野生小葉黑柴胡種子萌發(fā)特性及組織培養(yǎng)研究

史正文

摘? ? 要：為篩選出野生小葉黑柴胡種子的最佳萌發(fā)條件，以種子萌發(fā)得到的小葉黑柴胡下胚軸為外植體，探討了不同基礎培養(yǎng)基和不同濃度外源性激素在愈傷組織、不定根形成中的作用，以便對野生小葉黑柴胡種質(zhì)資源的保護提供一定的試驗數(shù)據(jù)和技術支持。

關鍵詞：野生小葉黑柴胡;種子萌發(fā);組織培養(yǎng)

文章編號： 1005-2690（2021）06-0010-02? ? ? ?中國圖書分類號： S567.79? ? ? ?文獻標志碼： B

小葉黑柴胡植株矮小，高僅15～40 cm;根呈黑褐色、小而多分枝，莖叢生;葉窄而小，花呈傘形且花序小，種子小且發(fā)芽率低[1]。藥理研究表明，小葉黑柴胡性苦、微寒，具有解熱、抗病毒、抗炎等作用[2]。小葉黑柴胡主要分布在海拔2 700～3 700 m的地區(qū)[3]，由于過度采挖，野生資源逐漸枯竭。采用組培育苗繁殖快，種苗質(zhì)量高。因此，建立野生小葉黑柴胡組培育苗體系，對其資源保護具有一定的指導意義。

1? ?材料與方法

1.1? ?試驗材料

當年野生小葉黑柴胡種子，采自山西省寧武縣山區(qū)。

1.2? ?試劑

生長素：激動素（KT）、萘乙酸（NAA）、6-芐基氨基嘌呤（6-BA）。

消毒劑：75% Alcohol、0.1% HgCl2、2% NaClO3。

基礎培養(yǎng)基：MS和B5培養(yǎng)基，水解酪蛋白（CH）。

1.3? ?培養(yǎng)條件

以MS和B5為基本培養(yǎng)基，通過改變激素種類和濃度形成不同條件的培養(yǎng)基。pH值6.0～6.5，光照時間12 h/d，光照強度50 μmol/（m2·s），溫度（26±2）℃。

1.4? ?試驗方法

1.4.1? ?小葉黑柴胡種子萌發(fā)的條件

1.4.1.1? ? 不同溫度下的萌芽試驗

取野生小葉黑柴胡種子400粒，每100粒分別在15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃溫度下進行發(fā)芽試驗，逐日記錄發(fā)芽數(shù)，30 d后計算發(fā)芽率。本試驗重復3次。

1.4.1.2? ? 不同試劑浸種的發(fā)芽試驗

取小葉黑柴胡種子200粒，每100粒分別用3% H2O2、1.0 mg/L GA3浸種1 d，再用流水洗凈。逐日記錄發(fā)芽數(shù)，30 d后計算發(fā)芽率。

1.4.2? ?小葉黑柴胡愈傷組織及不定芽的誘導

1.4.2.1? ? 試驗材料的消毒

取實驗室培養(yǎng)出的小葉黑柴胡幼苗，分別用75% Alcohol、0.1% HgCl2、2% NaClO3 消毒劑浸泡，篩選最佳的消毒條件。

1.4.2.2? ? 愈傷組織誘導培養(yǎng)基的篩選

將消毒后的幼苗，用無菌水沖洗3次，選取下胚軸，切成1 cm小段接種于不同激素配比的MS或B5基本培養(yǎng)基表面。

試驗中每30 d繼代1次，統(tǒng)計愈傷組織的誘導率，記錄愈傷組織的顏色、質(zhì)地及生長狀況。最后根據(jù)數(shù)據(jù)分析，篩選出最佳的愈傷組織誘導培養(yǎng)基。

1.4.2.3? ? 不定芽誘導培養(yǎng)基的篩選

將下胚軸生成的愈傷組織取出，用滅菌解剖刀切成小塊，無菌水沖洗干凈，然后接入含有不同濃度的激素和水解酪蛋白CH的MS或B5基本培養(yǎng)基表面，30 d后統(tǒng)計不定芽的誘導率。

2? ?結果與分析

2.1? ?小葉黑柴胡種子的萌發(fā)條件篩選

對于柴胡種子發(fā)芽率低的原因，魏建和等[4]曾報道，柴胡種子萌發(fā)率低與種皮和種子的成熟度有關。本試驗采取不同溫度及不同化學試劑對野生小葉黑柴胡種子進行預處理，探討了小葉黑柴胡種子的發(fā)芽條件，結果見表1和表2。

由表1和表2可以看出，用3%H2O2浸種1 d，能使小葉黑柴胡種子的發(fā)芽率顯著提高，而1.0 mg/L GA3對小葉黑柴胡種子的發(fā)芽有抑制作用。小葉黑柴胡種子發(fā)芽的最適溫度為20 ℃，其中15～20 ℃時的發(fā)芽率要高于25～30 ℃，說明小葉黑柴胡種子發(fā)芽喜低溫。

2.2? ?滅菌方法的比較

組培育苗中首先要解決的問題是污染，如果不能控制污染，組培育苗就失去了意義。因此，探索外植體的最佳消毒條件是小葉黑柴胡組織培養(yǎng)的前提。本次試驗比較了4種消毒方法，選擇出了殺傷力較小且效果好的消毒方案。接種10 d后，4種不同消毒方案的效果見表3。

由表3可以看出，用方案3和4消毒，滅菌效果雖然好，但對外植體的損害也大，獲得的無菌試驗材料存活率也低。因此，在選擇消毒劑時，既要考慮能殺死附著在外植體表面的微生物，又要盡量不傷害植物組織細胞。用方案1消毒，存活率高，但污染率也很高;而用方案2消毒，污染率很低，同時存活率也很高。所以，小葉黑柴胡的最佳消毒條件是75% Alcohol溶液中蕩滌30 s，無菌水蕩滌后，用0.1% HgCl2溶液蕩滌2.5 min，無菌水蕩滌后，再用2% NaClO3溶液蕩滌10 min。

2.3? ?愈傷組織誘導條件

由表4可知，不同基礎培養(yǎng)基、不同濃度外源性激素對小葉黑柴胡下胚軸愈傷組織誘導結果不同。整體來看，培養(yǎng)7 d后，野生小葉黑柴胡下胚軸開始形成愈傷組織。其中，MS基礎培養(yǎng)基誘導愈傷組織的效果優(yōu)于B5基礎培養(yǎng)基，0.1 mg/L KT的誘導效果優(yōu)于0.5 mg/L KT。2，4-D是柴胡組織愈傷組織誘導的主要激素，在MS+1.0 mg/L 2，4-D+0.1 mg/L KT的培養(yǎng)基上，下胚軸愈傷組織的誘導率達到100%，并且生長狀態(tài)良好。

2.4? ?不定芽的誘導條件

在分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 d左右，下胚軸愈傷組織塊上開始分化出芽，且分化出芽的數(shù)量逐天增加，具體結果見表5。

由表5可以看出，在B5基礎培養(yǎng)基中加入一定量的6-BA、NAA和CH，有利于小葉黑柴胡下胚軸愈傷組織分化芽，并且1.5 mg/L 6-BA+0.02 mg/L NAA+250 mg/L CH的B5培養(yǎng)基分化率最高。

3? ?討論

試驗表明，下胚軸愈傷組織誘導的最適培養(yǎng)基是：MS為基本培養(yǎng)基，添加的激素及濃度分別為1.0 mg/L 2，4-D、0.1 mg/L KT。不定芽分化的最適培養(yǎng)基是：B5為基礎培養(yǎng)基，添加的激素及濃度分別為1.5 mg/L 6-BA、0.02 mg/L NAA、250 mg/L CH。

組培育苗時，外植體的采集會受時間、種植地點的限制，尤其是超過了適宜采集期，外植體培養(yǎng)的愈傷組織質(zhì)量就會受到影響。因此，本試驗采集當年野生小葉黑柴胡飽滿、無病蟲害的種子。組培試驗中，外植體消毒效果的好壞會影響組培育苗的成活率。首先，在實驗室探索其種子發(fā)芽的適宜條件，提高了其種子的發(fā)芽率。其次，在溫室中種植，得到其幼苗，為下一步的組培育苗提供了優(yōu)良的外植體。本試驗篩選出了野生小葉黑柴胡外植體的最佳消毒方法，保障了后續(xù)組培育苗的成功。本試驗選用小葉黑柴胡的下胚軸作為組培育苗的外植體，由下胚軸形成的愈傷組織顏色為淺綠色，質(zhì)地松軟，生長良好，并且分化能力強，提高了組培育苗的效率。

參考文獻：

[ 1 ] 胡雙豐.柴胡與其混淆品小葉黑柴胡及錐葉黑柴胡的鑒別[J].藥學實踐雜志，2006，24（4）：47-48.

[ 2 ] 國家中醫(yī)藥管理局中華本草編委會.中華本草[M].上海：上海科學技術出版社，1999.

[ 3 ] 王玉慶，牛顏冰，秦雪梅.野生柴胡資源調(diào)查[J].山西農(nóng)業(yè)大學學報（自然科學版），2007，27（1）：103-107.

[ 4 ] 魏建和，李昆同，程惠珍.種子成熟度及種皮對北柴胡和三島柴胡種子萌發(fā)的影響[J].中國中藥雜志，2003，31（5）：46-48.