氫氧化鉀濕片法與熒光染色法在淺部真菌檢查中的使用

文/張文革

隨著我國經(jīng)濟(jì)社會的快速發(fā)展和綜合國力的顯著增強(qiáng)，城鄉(xiāng)居民生活水平顯著提高，人們對皮膚病的認(rèn)識和重視程度也顯著提高。據(jù)我院皮膚科門診量統(tǒng)計(jì)，2012年到2019年逐年遞增，最高年門診量達(dá)16萬余人次。其中較為常見真菌感染患者人次也屢見不鮮，其中我實(shí)驗(yàn)室統(tǒng)計(jì)的真菌鏡檢檢測數(shù)量，由2012年的1785人次遞增到2019年的8395人次得出，這是顯而易見的。通常，夏季較為明顯。炎熱多汗為真菌生長創(chuàng)造有利條件，可能會加重手、足、股癬的皮損，給患者帶來強(qiáng)烈不適。 真菌檢測在皮膚科臨床檢查中，應(yīng)用極為廣泛，通過檢測診斷真菌感染，是臨床必不可少的一部分。目前真菌檢查還主要依賴于技術(shù)員人工操作，沒有太多的機(jī)器操作。10%氫氧化鉀濕片法是經(jīng)典的真菌檢查方法，在早期皮膚科發(fā)展中，也起到很重要的診斷作用。然而，隨著時代進(jìn)步，科技不斷發(fā)展，科研不斷創(chuàng)新，我們的檢測方法也在改良。熒光染色法無論從顯微鏡下還是從檢測報(bào)告中都能讓人們更好、更清楚地看到真菌。我院皮膚科從2016年引進(jìn)真菌熒光染色法，臨床診斷改變是有目共睹的[1-3]。

1 資料與方法

資料：2016年7月13日到8月27日的1005例門診真菌檢測的病例，其中足癬228例、手癬106例、股癬101例、甲癬224例、體癬203例、鼻毛囊蟲36例，陽性例數(shù)為106、19、55、79、88、23。2019年7月21日到8月20日的1002例門診真菌檢測病例，其中足癬110例、手癬48例、股癬81例、甲癬236例、體癬46例、鼻毛囊蟲59例，陽性例數(shù)為54、13、59、117、22、41。

氫氧化鉀濕片法：酒精消毒患者皮損部位（黏膜部位除外）取材刀刮取患者患處皮屑或甲屑，取材量為肉眼可見的多，盡量多取材，放在滴好10%氫氧化鉀的載玻片上，混為懸液，蓋上蓋玻片，在酒精燈上微微過一下（加速角質(zhì)溶解），即可在顯微鏡下觀察（萊卡 自然光源顯微鏡）。結(jié)果解釋:看到有折光性，粗細(xì)較為均勻，呈現(xiàn)絲狀形態(tài)，在細(xì)胞上或細(xì)胞之間的結(jié)構(gòu)， 即可報(bào)真菌鏡檢陽性。

熒光染色法：酒精消毒患處，用取材刀刮取皮屑或甲屑，在載玻片上滴一滴熒光試劑A液，將取好的皮屑放在載玻片上，與A液混勻后滴加B液，蓋上蓋玻片，用棉簽吸取多余液體，即可在熒光顯微鏡上觀察。檢驗(yàn)結(jié)果解釋：樣本進(jìn)行染色后，熒光顯微鏡下觀察，先用低倍鏡找到可疑真菌菌絲所在位置，調(diào)至視野正中央，在用高倍鏡觀察真菌菌絲或孢子結(jié)構(gòu)加以確定，電腦裁圖，簽發(fā)報(bào)告。

2 結(jié)果

傳統(tǒng)的氫氧化鉀濕片法，在鏡下可看到都是透明的，顧名思義我們也稱之為透明法，視野也不是很清晰，很難區(qū)分上皮細(xì)胞邊緣和真菌菌絲，不能快速識別真菌。熒光染色法則不同，熒光鏡下，上皮細(xì)胞和真菌菌絲都很漂亮，視覺更舒適，菌絲更為明顯，就算隱藏在上皮細(xì)胞縫隙里，也清晰可見熒光藍(lán)色的真菌菌絲，不僅臨床診斷快，也更有利于教學(xué)。

足癬、手癬、股癬、甲癬、體癬、鼻（毛囊蟲）熒光染色法和氫氧化鉀法的陽性率分別是49%、27%、72%、49%、47%、69%和46%、18%、54%、35%、43%、64%，熒光染色法明顯更優(yōu)于氫氧化鉀法

3 討論

真菌病在皮膚科門診中非常常見，在當(dāng)下快節(jié)奏的生活中，它嚴(yán)重影響了人們的生活質(zhì)量。因此，更依賴于我們真菌的診斷。真菌病診斷方法有很多，臨床更多見于真菌鏡檢和培養(yǎng)。真菌培養(yǎng)最為可靠，但是它耗時長，需要經(jīng)驗(yàn)豐富的技術(shù)員來鑒別，并不太適合臨床常規(guī)的快速診斷。所以真菌鏡檢才是診斷真菌病的最基礎(chǔ)最實(shí)用的方法。氫氧化鉀法是最早的真菌檢測方法，快速，簡便，成本低是它的特點(diǎn)但是對于臨床技術(shù)員要求高，需要很長一段時間的學(xué)習(xí)，才能獨(dú)當(dāng)一面。陽性率的影響因素也很多，取材量要肉眼可見的多，取材部位要明確，取材方法，患者配合度。對于這項(xiàng)工作需要長時間的耐心與磨煉才能穩(wěn)扎穩(wěn)打的進(jìn)行。這對于臨床需要是不可取的，假陰性的結(jié)果影響臨床醫(yī)師的判斷，對診斷真菌病受到巨大阻礙。

熒光染色法原理是熒光染料能與真菌細(xì)胞壁的纖維素、幾丁質(zhì)和其他β-多糖無特異性結(jié)合，從而標(biāo)記熒光，在熒光顯微鏡下進(jìn)行區(qū)分和檢測。隨著熒光染色法的問世，真菌診斷有了質(zhì)的飛躍。這引起了大家的共鳴，事實(shí)證明的確如此，見表1。

表1 真菌熒光染色圖片

本研究表明，熒光染色法在臨床實(shí)際應(yīng)用中有明顯的優(yōu)勢，雖然有些陽性率差距不是很大，如手癬陽性率僅差2%，這可能與門診檢驗(yàn)技師均為兩年以上，工作經(jīng)驗(yàn)豐富，取材方法準(zhǔn)確有關(guān)。從日常臨床工作材料中的數(shù)據(jù)總結(jié)來說，不存在主觀偏差。目前熒光染色法在各大醫(yī)院皮膚科廣泛應(yīng)用，在真菌檢測報(bào)告中，清晰可見的亮藍(lán)色菌絲，是臨床醫(yī)師進(jìn)行診斷的有力證據(jù)，是給患者的最完美的解釋。見圖1，圖2，圖3。

圖1 為熒光染色法鏡下真菌形態(tài)

圖2 為熒光染色法鏡下毛囊蟲形態(tài)

圖3 為10%氫氧化鉀法鏡下真菌菌絲形態(tài)