γ-分泌酶抑制劑通過Notch信號通路抑制人骨肉瘤細(xì)胞的遷移

李珂 李京 賀西京 王爽 郝丹丹

骨肉瘤是一種最常見的惡性骨腫瘤，在兒童和青少年人群發(fā)病率最高。轉(zhuǎn)移是骨肉瘤預(yù)后不良的關(guān)鍵因素之一，最常見的轉(zhuǎn)移部位為肺，約有15%～25%的骨肉瘤病人在確診時即發(fā)現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移［1_3］。骨肉瘤目前的治療方式為保肢手術(shù)聯(lián)合輔助化療，然而轉(zhuǎn)移病人的5年生存率仍然不足20%［4_5］。有文獻(xiàn)報道，Notch信號通路在包括骨肉瘤在內(nèi)的多種惡性腫瘤中均有異常表達(dá)，增加腫瘤的遷移侵襲能力［6_8］。而DAPT是一種γ-分泌酶抑制劑，能夠在Notch通路的活化過程中起到阻斷作用［9］。本文通過體外培養(yǎng)人骨肉瘤細(xì)胞系MG63和143B以及構(gòu)建體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移瘤模型，并用DAPT進(jìn)行處理干預(yù)，來探究DAPT能否通過阻斷Notch通路而抑制骨肉瘤細(xì)胞的遷移及體內(nèi)侵襲能力，從而為骨肉瘤的臨床抗轉(zhuǎn)移治療提供研究思路。

材料與方法

一、細(xì)胞株和主要試劑耗材

人骨肉瘤細(xì)胞系MG63和143B（中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所，中國）；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素&鏈霉素（Gibco公司，美國）；PBS緩沖液、胰蛋白酶（Hyclone公司，美國）；DAPT、二甲基亞砜（DMSO）、4%多聚甲醛（Sigma公司，美國）；Jagged1活性肽（序列：CDYYYGFGCNKFCRPR，10μM，Gen_Script）；Transwell小室（Corning Costar公司，美國）；鼠抗人Notch1（免疫熒光1∶250，Abcam公司，英國）；羊抗鼠二抗（免疫熒光1∶500，Abcam公司，英國）；DAPI（1∶1 000，Abcam公司，英國）。

二、實驗方法

（一）細(xì)胞培養(yǎng)

143B和MG63細(xì)胞系培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱，每兩天換液一次，將細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用胰蛋白酶消化收集用于后續(xù)實驗。

（二）DAPT處理

將DAPT用DMSO溶解配成50 mM的母液，分裝后儲存于-80℃冰箱中。使用時取出溶解，用DMEM培養(yǎng)基稀釋到實驗所需濃度。

（三）免疫熒光染色

將細(xì)胞接種于細(xì)胞爬片上，待細(xì)胞融合度達(dá)到90%時，取出爬片，用PBS浸洗3次，每次3 min。用4%多聚甲醛固定爬片15 min，用PBS浸洗3次，每次3 min。用吸水紙吸干爬片上的PBS，滴加山羊血清，室溫封閉30 min。在每張爬片上滴加稀釋好的一抗并放入濕盒中，4℃孵育過夜。第二天取出爬片，用PBS浸洗3次，每次3 min，用吸水紙吸干后滴加稀釋好的二抗，置于濕盒中，室溫避光孵育1 h。用PBS浸洗3次，每次3 min，然后滴加稀釋好的DAPI，室溫避光孵育5 min后，用PBS浸洗3次，每次3 min。用吸水紙吸取殘余的PBS后，用含抗熒光猝滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

（四）標(biāo)本來源

西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨二科，病人1，男，16歲，診斷為左側(cè)肱骨近端骨肉瘤；病人2，男，12歲，診斷為右側(cè)股骨遠(yuǎn)端骨肉瘤。病人3，女，57歲，診斷為左側(cè)股骨近端骨肉瘤。以上病人均發(fā)生肺部轉(zhuǎn)移。

（五）免疫組織化學(xué)染色

取腫瘤組織用4%多聚甲醛固定48 h，然后進(jìn)行石蠟包埋。將石蠟組織連續(xù)切片后進(jìn)行抗原修復(fù)，擦干周圍水分后，加入一抗置于4℃冰箱孵育過夜。復(fù)溫加入二抗后于37℃孵育20 min，然后用PBS沖洗。擦凈周圍水分后DAB顯色、蘇木精復(fù)染、分化、脫水、透明，封片，最后在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察采集圖像。

（六）劃痕試驗

取處于對數(shù)生長期的143B和MG63細(xì)胞以5×105個/孔接種于24孔板中，每隔一天換液一次，顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，待細(xì)胞融合度達(dá)到90%時，用200μL的無菌槍頭劃痕，注意用力均勻，棄去培養(yǎng)液，用PBS浸洗后更換含有1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。將0.2μL的DMSO（對照組）、10μM的DAPT（DAPT組）以及10μM的Jagged1活性肽（Jagged1組）加入至各組，于顯微鏡下觀察劃痕情況，拍照。將24孔板置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后取出于顯微鏡下觀察各組劃痕愈合情況，拍照。

（七）Transwell遷移試驗

取處于對數(shù)生長期的143B和MG63細(xì)胞，用無血清的DMEM培養(yǎng)基重懸計數(shù)，取50μL 5×106/mL的MG63和143B細(xì)胞接種于Transwell小室的上室，下室分別加入30μL含等體積DMSO（對照組）、10μM的DAPT（DAPT組）以及10μM的Jagged1活性肽（Jagged1組）的10%血清培養(yǎng)液。常規(guī)孵育8 h后，用棉簽輕輕擦去小室膜上表面的細(xì)胞，用4%的多聚甲醛固定小室膜下表面遷移的細(xì)胞30 min，并用結(jié)晶紫染液染色15 min，純水洗凈。在顯微鏡下隨機(jī)選取8個視野，觀察遷移細(xì)胞的數(shù)量，每組實驗均獨立重復(fù)3次。

（八）肺轉(zhuǎn)移瘤模型的構(gòu)建

在西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心購買6只4周齡大BABL/C雄性裸鼠，參考文獻(xiàn)［10_11］方法建立小鼠骨肉瘤異種肺轉(zhuǎn)移瘤模型。將裸鼠隨機(jī)分為兩組，對照組和DAPT組，每組3只。從尾靜脈向6只裸鼠注射100μL的MG63細(xì)胞懸液，濃度為1×107個/mL。隨后每隔一天對裸鼠腹腔注射一次DAPT（DAPT組，10 mg/kg，用5%DMSO稀釋）或等體積的5%的DMSO（對照組，用PBS稀釋），在MG63細(xì)胞注射四周后對裸鼠進(jìn)行處死，觀察肺轉(zhuǎn)移瘤大小，并將標(biāo)本切片進(jìn)行HE染色。

（九）腫瘤組織染色

將裸鼠肺部轉(zhuǎn)移瘤組織切片進(jìn)行染色，首先使用二甲苯脫蠟2次，每次5 min，用無水乙醇浸洗2次，每次5 min。然后用95%的乙醇和80%的乙醇各洗10 min，分別用自來水和純水各清洗2 min，然后用蘇木素染色4 min后用自來水清洗2 min。用1%的鹽酸酒精分化20 s，馬上用自來水清洗2 min，用1%稀氨水返藍(lán)30 s后，用自來水清洗2 min。最后用伊紅染色2 min，再用80%的乙醇和95%的乙醇各脫水10 s，無水乙醇脫水5 min，用二甲苯透明20 min后封片，置于顯微鏡下觀察采集圖像。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0（IBM公司，美國）進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各組間細(xì)胞遷移數(shù)量的比較采用獨立樣本t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、Notch1在骨肉瘤細(xì)胞及臨床標(biāo)本中高表達(dá)

從圖1 a～f可以看到Notch1在MG63細(xì)胞及143B細(xì)胞中均高表達(dá)，人骨肉瘤體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移臨床標(biāo)本的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示肺轉(zhuǎn)移腫瘤標(biāo)本中同樣高表達(dá)Notch1（圖1 g、h），說明Notch1無論在人骨肉瘤MG63和143B細(xì)胞系還是在肺轉(zhuǎn)移瘤中都被過度表達(dá)。

二、DAPT抑制骨肉瘤細(xì)胞的遷移

如圖2所示，與對照組相比，DAPT組細(xì)胞的遷移愈合距離明顯短于對照組和Jagged1組，而Jag_ged1組細(xì)胞的遷移愈合距離最長，說明DAPT能夠抑制兩種骨肉瘤細(xì)胞的遷移，而Jagged1通過促進(jìn)Notch通路的活化增強(qiáng)兩種骨肉瘤細(xì)胞的遷移能力。Transwell遷移試驗結(jié)果如圖3所示，DAPT組穿膜細(xì)胞明顯少于對照組和Jagged1組，而Jagged1組的穿膜細(xì)胞最多，同樣說明了DAPT對于143B細(xì)胞和MG63細(xì)胞的遷移有抑制作用。

三、DAPT在體內(nèi)抑制骨肉瘤的肺轉(zhuǎn)移

肺部是骨肉瘤病人最常見的轉(zhuǎn)移部位，為了驗證DAPT對體內(nèi)骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移的影響，我們用MG63細(xì)胞進(jìn)行了裸鼠成瘤試驗，成功構(gòu)建了裸鼠的肺轉(zhuǎn)移瘤模型，并經(jīng)腹腔注射DAPT探究其對骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移的影響。如圖4 a所示，對照組的肺部腫瘤結(jié)節(jié)明顯大于DAPT組，且數(shù)量更多。隨后我們將肺部進(jìn)行切片染色，HE染色結(jié)果顯示對照組有明顯的轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)，且面積更大，而DAPT組幾乎沒有結(jié)節(jié)（圖4 b），說明DAPT能夠在體內(nèi)明顯抑制人骨肉瘤MG63細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移。

討 論

圖1 細(xì)胞免疫熒光染色與臨床標(biāo)本免疫組化結(jié)果a～c：MG63細(xì)胞免疫熒光染色；d～f：143B細(xì)胞免疫熒光染色；紅色熒光標(biāo)記Notch1陽性細(xì)胞，藍(lán)色熒光DAPI標(biāo)記細(xì)胞核（×200）；g、h：人體骨肉瘤標(biāo)本免疫組化結(jié)果及陰性對照（×400）

圖2 143B細(xì)胞和MG63細(xì)胞的劃痕實驗 a：143B細(xì)胞劃痕愈合結(jié)果（×100）；b：MG63細(xì)胞劃痕愈合結(jié)果（×100）

骨肉瘤是一種致殘率很高的原發(fā)性惡性骨腫瘤，尤其是肺轉(zhuǎn)移后的病人生存率很低，嚴(yán)重威脅到人類的生命［12_13］。隨著治療手段的不斷提升，骨肉瘤的治療方法不斷增多，但是由于骨肉瘤容易發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，所以總體的預(yù)后仍然很差，肺轉(zhuǎn)移病人的5年生存率不足20%，因此針對骨肉瘤病人肺轉(zhuǎn)移的治療目前仍是一大研究熱點［14_15］。

Notch信號通路在胚胎發(fā)育過程中起著關(guān)鍵作用，參與胚胎期間的血管發(fā)育和血管生成，在組織修復(fù)、傷口愈合的新生血管再生中同樣發(fā)揮著重要作用［16_17］。同樣，Notch通路也在癌癥中扮演著重要的角色，任何干預(yù)Notch通路的微環(huán)境的改變都有可能成為機(jī)體癌變的引線。Notch通路通過整合癌細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境之間的相互作用，進(jìn)一步支持了癌細(xì)胞的“干性”，幫助其在微環(huán)境中的長期生存［18］。Notch信號傳導(dǎo)參與癌癥擴(kuò)散的早期階段，即入侵和遷移，有研究表明，Notch通路直接或間接地與細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）成分相互作用，幫助上皮癌細(xì)胞穿透ECM，這對于癌細(xì)胞的體內(nèi)轉(zhuǎn)移具有重要作用［19_20］。因此，本文擬通過體內(nèi)、體外實驗來探究Notch通路阻斷劑DAPT對骨肉瘤遷移侵襲的影響，為骨肉瘤轉(zhuǎn)移的臨床治療提供研究思路和科研支持。

圖3 143B細(xì)胞和MG63細(xì)胞的Transwell遷移試驗 a：兩種細(xì)胞Transwell遷移情況（結(jié)晶紫染色，×200）；b：兩種細(xì)胞遷移情況柱狀統(tǒng)計圖（與對照組比較，**P＜0.01）

圖4 裸鼠骨肉瘤的肺轉(zhuǎn)移情況 a：肺部轉(zhuǎn)移瘤圖片；b：肺轉(zhuǎn)移瘤的HE染色（×100）

本實驗通過體外培養(yǎng)人骨肉瘤143B細(xì)胞和MG63細(xì)胞，添加DAPT與Notch通路激活劑Jag_ged1，觀測其對癌細(xì)胞體外遷移能力的影響。首先我們采用免疫熒光染色和免疫組化分別檢驗MG63細(xì)胞、143B細(xì)胞和人骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移瘤的臨床標(biāo)本中Notch1的表達(dá)情況，結(jié)果顯示體外培養(yǎng)的人骨肉瘤MG63、143B細(xì)胞系和人骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移瘤均高表達(dá)Notch1，這對后續(xù)的干預(yù)研究具有指導(dǎo)意義。然后我們通過劃痕試驗定性觀察DAPT和Jagged1對人骨肉瘤143B細(xì)胞和MG63細(xì)胞遷移的影響，結(jié)果表明DAPT能夠明顯抑制兩種細(xì)胞的劃痕愈合能力，而Jagged1則能夠起到明顯的促進(jìn)愈合作用，這與我們的預(yù)期相符。接著我們通過Transwell遷移實驗進(jìn)行定量驗證，結(jié)果同樣證明DAPT對143B細(xì)胞和MG63細(xì)胞的遷移起抑制作用。為了給臨床治療提供更加可靠的實驗信息，模擬更加復(fù)雜的體內(nèi)環(huán)境，我們通過構(gòu)建裸鼠的骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移瘤模型來驗證DAPT對于骨肉瘤的體內(nèi)侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。結(jié)果顯示，DAPT能夠明顯減少人骨肉瘤MG63細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移瘤的數(shù)量及體積，且通過對轉(zhuǎn)移瘤標(biāo)本的HE染色發(fā)現(xiàn)，DAPT組的結(jié)節(jié)數(shù)量明顯少于對照組，且結(jié)節(jié)大小也明顯減小，說明DAPT能夠在體內(nèi)環(huán)境中抑制骨肉瘤的肺部侵襲轉(zhuǎn)移能力，這對于骨肉瘤的轉(zhuǎn)移治療具有重要指導(dǎo)意義。

本研究結(jié)果顯示，γ-分泌酶抑制劑DAPT對體外培養(yǎng)的人骨肉瘤143B細(xì)胞和MG63細(xì)胞有明顯的遷移抑制作用，同時能夠減弱體內(nèi)骨肉瘤肺部侵襲轉(zhuǎn)移能力。本研究為DAPT治療骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移的臨床應(yīng)用提供了重要的理論基礎(chǔ)。