李珂 李京 賀西京 王爽 郝丹丹
骨肉瘤是一種最常見的惡性骨腫瘤,在兒童和青少年人群發(fā)病率最高。轉(zhuǎn)移是骨肉瘤預(yù)后不良的關(guān)鍵因素之一,最常見的轉(zhuǎn)移部位為肺,約有15%~25%的骨肉瘤病人在確診時即發(fā)現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移[1_3]。骨肉瘤目前的治療方式為保肢手術(shù)聯(lián)合輔助化療,然而轉(zhuǎn)移病人的5年生存率仍然不足20%[4_5]。有文獻(xiàn)報道,Notch信號通路在包括骨肉瘤在內(nèi)的多種惡性腫瘤中均有異常表達(dá),增加腫瘤的遷移侵襲能力[6_8]。而DAPT是一種γ-分泌酶抑制劑,能夠在Notch通路的活化過程中起到阻斷作用[9]。本文通過體外培養(yǎng)人骨肉瘤細(xì)胞系MG63和143B以及構(gòu)建體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移瘤模型,并用DAPT進(jìn)行處理干預(yù),來探究DAPT能否通過阻斷Notch通路而抑制骨肉瘤細(xì)胞的遷移及體內(nèi)侵襲能力,從而為骨肉瘤的臨床抗轉(zhuǎn)移治療提供研究思路。
人骨肉瘤細(xì)胞系MG63和143B(中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所,中國);DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素&鏈霉素(Gibco公司,美國);PBS緩沖液、胰蛋白酶(Hyclone公司,美國);DAPT、二甲基亞砜(DMSO)、4%多聚甲醛(Sigma公司,美國);Jagged1活性肽(序列:CDYYYGFGCNKFCRPR,10μM,Gen_Script);Transwell小室(Corning Costar公司,美國);鼠抗人Notch1(免疫熒光1∶250,Abcam公司,英國);羊抗鼠二抗(免疫熒光1∶500,Abcam公司,英國);DAPI(1∶1 000,Abcam公司,英國)。
(一)細(xì)胞培養(yǎng)
143B和MG63細(xì)胞系培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中,置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱,每兩天換液一次,將細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期,用胰蛋白酶消化收集用于后續(xù)實驗。
(二)DAPT處理
將DAPT用DMSO溶解配成50 mM的母液,分裝后儲存于-80℃冰箱中。使用時取出溶解,用DMEM培養(yǎng)基稀釋到實驗所需濃度。
(三)免疫熒光染色
將細(xì)胞接種于細(xì)胞爬片上,待細(xì)胞融合度達(dá)到90%時,取出爬片,用PBS浸洗3次,每次3 min。用4%多聚甲醛固定爬片15 min,用PBS浸洗3次,每次3 min。用吸水紙吸干爬片上的PBS,滴加山羊血清,室溫封閉30 min。在每張爬片上滴加稀釋好的一抗并放入濕盒中,4℃孵育過夜。第二天取出爬片,用PBS浸洗3次,每次3 min,用吸水紙吸干后滴加稀釋好的二抗,置于濕盒中,室溫避光孵育1 h。用PBS浸洗3次,每次3 min,然后滴加稀釋好的DAPI,室溫避光孵育5 min后,用PBS浸洗3次,每次3 min。用吸水紙吸取殘余的PBS后,用含抗熒光猝滅劑的封片液封片,然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。
(四)標(biāo)本來源
西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨二科,病人1,男,16歲,診斷為左側(cè)肱骨近端骨肉瘤;病人2,男,12歲,診斷為右側(cè)股骨遠(yuǎn)端骨肉瘤。病人3,女,57歲,診斷為左側(cè)股骨近端骨肉瘤。以上病人均發(fā)生肺部轉(zhuǎn)移。
(五)免疫組織化學(xué)染色
取腫瘤組織用4%多聚甲醛固定48 h,然后進(jìn)行石蠟包埋。將石蠟組織連續(xù)切片后進(jìn)行抗原修復(fù),擦干周圍水分后,加入一抗置于4℃冰箱孵育過夜。復(fù)溫加入二抗后于37℃孵育20 min,然后用PBS沖洗。擦凈周圍水分后DAB顯色、蘇木精復(fù)染、分化、脫水、透明,封片,最后在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察采集圖像。
(六)劃痕試驗
取處于對數(shù)生長期的143B和MG63細(xì)胞以5×105個/孔接種于24孔板中,每隔一天換液一次,顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài),待細(xì)胞融合度達(dá)到90%時,用200μL的無菌槍頭劃痕,注意用力均勻,棄去培養(yǎng)液,用PBS浸洗后更換含有1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。將0.2μL的DMSO(對照組)、10μM的DAPT(DAPT組)以及10μM的Jagged1活性肽(Jagged1組)加入至各組,于顯微鏡下觀察劃痕情況,拍照。將24孔板置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24 h后取出于顯微鏡下觀察各組劃痕愈合情況,拍照。
(七)Transwell遷移試驗
取處于對數(shù)生長期的143B和MG63細(xì)胞,用無血清的DMEM培養(yǎng)基重懸計數(shù),取50μL 5×106/mL的MG63和143B細(xì)胞接種于Transwell小室的上室,下室分別加入30μL含等體積DMSO(對照組)、10μM的DAPT(DAPT組)以及10μM的Jagged1活性肽(Jagged1組)的10%血清培養(yǎng)液。常規(guī)孵育8 h后,用棉簽輕輕擦去小室膜上表面的細(xì)胞,用4%的多聚甲醛固定小室膜下表面遷移的細(xì)胞30 min,并用結(jié)晶紫染液染色15 min,純水洗凈。在顯微鏡下隨機(jī)選取8個視野,觀察遷移細(xì)胞的數(shù)量,每組實驗均獨立重復(fù)3次。
(八)肺轉(zhuǎn)移瘤模型的構(gòu)建
在西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心購買6只4周齡大BABL/C雄性裸鼠,參考文獻(xiàn)[10_11]方法建立小鼠骨肉瘤異種肺轉(zhuǎn)移瘤模型。將裸鼠隨機(jī)分為兩組,對照組和DAPT組,每組3只。從尾靜脈向6只裸鼠注射100μL的MG63細(xì)胞懸液,濃度為1×107個/mL。隨后每隔一天對裸鼠腹腔注射一次DAPT(DAPT組,10 mg/kg,用5%DMSO稀釋)或等體積的5%的DMSO(對照組,用PBS稀釋),在MG63細(xì)胞注射四周后對裸鼠進(jìn)行處死,觀察肺轉(zhuǎn)移瘤大小,并將標(biāo)本切片進(jìn)行HE染色。
(九)腫瘤組織染色
將裸鼠肺部轉(zhuǎn)移瘤組織切片進(jìn)行染色,首先使用二甲苯脫蠟2次,每次5 min,用無水乙醇浸洗2次,每次5 min。然后用95%的乙醇和80%的乙醇各洗10 min,分別用自來水和純水各清洗2 min,然后用蘇木素染色4 min后用自來水清洗2 min。用1%的鹽酸酒精分化20 s,馬上用自來水清洗2 min,用1%稀氨水返藍(lán)30 s后,用自來水清洗2 min。最后用伊紅染色2 min,再用80%的乙醇和95%的乙醇各脫水10 s,無水乙醇脫水5 min,用二甲苯透明20 min后封片,置于顯微鏡下觀察采集圖像。
采用SPSS 22.0(IBM公司,美國)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,各組間細(xì)胞遷移數(shù)量的比較采用獨立樣本t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
從圖1 a~f可以看到Notch1在MG63細(xì)胞及143B細(xì)胞中均高表達(dá),人骨肉瘤體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移臨床標(biāo)本的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示肺轉(zhuǎn)移腫瘤標(biāo)本中同樣高表達(dá)Notch1(圖1 g、h),說明Notch1無論在人骨肉瘤MG63和143B細(xì)胞系還是在肺轉(zhuǎn)移瘤中都被過度表達(dá)。
如圖2所示,與對照組相比,DAPT組細(xì)胞的遷移愈合距離明顯短于對照組和Jagged1組,而Jag_ged1組細(xì)胞的遷移愈合距離最長,說明DAPT能夠抑制兩種骨肉瘤細(xì)胞的遷移,而Jagged1通過促進(jìn)Notch通路的活化增強(qiáng)兩種骨肉瘤細(xì)胞的遷移能力。Transwell遷移試驗結(jié)果如圖3所示,DAPT組穿膜細(xì)胞明顯少于對照組和Jagged1組,而Jagged1組的穿膜細(xì)胞最多,同樣說明了DAPT對于143B細(xì)胞和MG63細(xì)胞的遷移有抑制作用。
肺部是骨肉瘤病人最常見的轉(zhuǎn)移部位,為了驗證DAPT對體內(nèi)骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移的影響,我們用MG63細(xì)胞進(jìn)行了裸鼠成瘤試驗,成功構(gòu)建了裸鼠的肺轉(zhuǎn)移瘤模型,并經(jīng)腹腔注射DAPT探究其對骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移的影響。如圖4 a所示,對照組的肺部腫瘤結(jié)節(jié)明顯大于DAPT組,且數(shù)量更多。隨后我們將肺部進(jìn)行切片染色,HE染色結(jié)果顯示對照組有明顯的轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié),且面積更大,而DAPT組幾乎沒有結(jié)節(jié)(圖4 b),說明DAPT能夠在體內(nèi)明顯抑制人骨肉瘤MG63細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移。
圖1 細(xì)胞免疫熒光染色與臨床標(biāo)本免疫組化結(jié)果a~c:MG63細(xì)胞免疫熒光染色;d~f:143B細(xì)胞免疫熒光染色;紅色熒光標(biāo)記Notch1陽性細(xì)胞,藍(lán)色熒光DAPI標(biāo)記細(xì)胞核(×200);g、h:人體骨肉瘤標(biāo)本免疫組化結(jié)果及陰性對照(×400)
圖2 143B細(xì)胞和MG63細(xì)胞的劃痕實驗 a:143B細(xì)胞劃痕愈合結(jié)果(×100);b:MG63細(xì)胞劃痕愈合結(jié)果(×100)
骨肉瘤是一種致殘率很高的原發(fā)性惡性骨腫瘤,尤其是肺轉(zhuǎn)移后的病人生存率很低,嚴(yán)重威脅到人類的生命[12_13]。隨著治療手段的不斷提升,骨肉瘤的治療方法不斷增多,但是由于骨肉瘤容易發(fā)生肺轉(zhuǎn)移,所以總體的預(yù)后仍然很差,肺轉(zhuǎn)移病人的5年生存率不足20%,因此針對骨肉瘤病人肺轉(zhuǎn)移的治療目前仍是一大研究熱點[14_15]。
Notch信號通路在胚胎發(fā)育過程中起著關(guān)鍵作用,參與胚胎期間的血管發(fā)育和血管生成,在組織修復(fù)、傷口愈合的新生血管再生中同樣發(fā)揮著重要作用[16_17]。同樣,Notch通路也在癌癥中扮演著重要的角色,任何干預(yù)Notch通路的微環(huán)境的改變都有可能成為機(jī)體癌變的引線。Notch通路通過整合癌細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境之間的相互作用,進(jìn)一步支持了癌細(xì)胞的“干性”,幫助其在微環(huán)境中的長期生存[18]。Notch信號傳導(dǎo)參與癌癥擴(kuò)散的早期階段,即入侵和遷移,有研究表明,Notch通路直接或間接地與細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)成分相互作用,幫助上皮癌細(xì)胞穿透ECM,這對于癌細(xì)胞的體內(nèi)轉(zhuǎn)移具有重要作用[19_20]。因此,本文擬通過體內(nèi)、體外實驗來探究Notch通路阻斷劑DAPT對骨肉瘤遷移侵襲的影響,為骨肉瘤轉(zhuǎn)移的臨床治療提供研究思路和科研支持。
圖3 143B細(xì)胞和MG63細(xì)胞的Transwell遷移試驗 a:兩種細(xì)胞Transwell遷移情況(結(jié)晶紫染色,×200);b:兩種細(xì)胞遷移情況柱狀統(tǒng)計圖(與對照組比較,**P<0.01)
圖4 裸鼠骨肉瘤的肺轉(zhuǎn)移情況 a:肺部轉(zhuǎn)移瘤圖片;b:肺轉(zhuǎn)移瘤的HE染色(×100)
本實驗通過體外培養(yǎng)人骨肉瘤143B細(xì)胞和MG63細(xì)胞,添加DAPT與Notch通路激活劑Jag_ged1,觀測其對癌細(xì)胞體外遷移能力的影響。首先我們采用免疫熒光染色和免疫組化分別檢驗MG63細(xì)胞、143B細(xì)胞和人骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移瘤的臨床標(biāo)本中Notch1的表達(dá)情況,結(jié)果顯示體外培養(yǎng)的人骨肉瘤MG63、143B細(xì)胞系和人骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移瘤均高表達(dá)Notch1,這對后續(xù)的干預(yù)研究具有指導(dǎo)意義。然后我們通過劃痕試驗定性觀察DAPT和Jagged1對人骨肉瘤143B細(xì)胞和MG63細(xì)胞遷移的影響,結(jié)果表明DAPT能夠明顯抑制兩種細(xì)胞的劃痕愈合能力,而Jagged1則能夠起到明顯的促進(jìn)愈合作用,這與我們的預(yù)期相符。接著我們通過Transwell遷移實驗進(jìn)行定量驗證,結(jié)果同樣證明DAPT對143B細(xì)胞和MG63細(xì)胞的遷移起抑制作用。為了給臨床治療提供更加可靠的實驗信息,模擬更加復(fù)雜的體內(nèi)環(huán)境,我們通過構(gòu)建裸鼠的骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移瘤模型來驗證DAPT對于骨肉瘤的體內(nèi)侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。結(jié)果顯示,DAPT能夠明顯減少人骨肉瘤MG63細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移瘤的數(shù)量及體積,且通過對轉(zhuǎn)移瘤標(biāo)本的HE染色發(fā)現(xiàn),DAPT組的結(jié)節(jié)數(shù)量明顯少于對照組,且結(jié)節(jié)大小也明顯減小,說明DAPT能夠在體內(nèi)環(huán)境中抑制骨肉瘤的肺部侵襲轉(zhuǎn)移能力,這對于骨肉瘤的轉(zhuǎn)移治療具有重要指導(dǎo)意義。
本研究結(jié)果顯示,γ-分泌酶抑制劑DAPT對體外培養(yǎng)的人骨肉瘤143B細(xì)胞和MG63細(xì)胞有明顯的遷移抑制作用,同時能夠減弱體內(nèi)骨肉瘤肺部侵襲轉(zhuǎn)移能力。本研究為DAPT治療骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移的臨床應(yīng)用提供了重要的理論基礎(chǔ)。