楨楠種子脫水過程中的生理響應(yīng)

李佳琦，薛曉明，高捍東*

(1. 南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，國家林業(yè)和草原局南方林木種子檢驗中心，南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037；2. 南京森林警察學(xué)院刑事科學(xué)技術(shù)學(xué)院，野生動植物物證技術(shù)國家林業(yè)和草原局重點實驗室, 江蘇 南京 210023)

楨楠(Phoebezhennan)屬樟科(Lauraceae)楠屬，是中國特有的珍貴樹種，在四川、重慶、貴州、湖北西部及湖南西北部均有生長[1]，垂直分布于海拔1 500 m以下的闊葉林中。楨楠樹干通直，四季常青，可作為很好的綠化樹種；同時，由于其木材紋理直、結(jié)構(gòu)細密、不易變形和開裂，可為建筑以及高級家具提供優(yōu)良木材[2]。由于長期采伐造成楨楠資源的急劇減少，其野生資源的保護及人工擴繁迫在眉睫。

確定目標(biāo)植物的種子脫水耐性是成功建立種子庫和異地保存的關(guān)鍵[3]，研究脫水敏感程度較高的楨楠種子就顯得尤為重要。但目前對楨楠的研究多集中在生產(chǎn)應(yīng)用技術(shù)，如楨楠的品種分類[4]、木材特性[5]、抗性生理[6-7]以及育苗栽培技術(shù)[8-10]。對于其種子萌發(fā)及脫水耐性等生物學(xué)方面的研究資料較少，主要有李鐵華等[11-12]通過人工老化處理研究種子活力變化機制。

本研究以楨楠種子為試驗材料，通過硅膠脫水，獲得不同脫水梯度狀態(tài)的種子，繼而測定其生活力、電導(dǎo)率、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性和過氧化氫酶(catalase，CAT)活性等指標(biāo)，對楨楠種子進行生理生化分析。通過研究不同脫水程度楨楠種子內(nèi)部各種指標(biāo)的動態(tài)變化，分析最適用于楨楠種子貯藏的含水量指標(biāo)，為楨楠在林業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用中的合理貯藏提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

楨楠種子于2018年11月采自重慶市酉陽土家族苗族自治縣(108°15′25″～109°19′02″E,28°19′28″～29°24′18″N)。新鮮楨楠種子采回后于清水中浸泡洗去果皮后陰干，然后置于濕河沙中分層貯藏備用。

1.2 試驗設(shè)計

試驗于2019年3月中旬開始進行，用分析天平稱取種子樣品的初始質(zhì)量(M1)，隨即裝入網(wǎng)紗束口袋(大小適中，保證所取種子樣品可以在其中平鋪) ，束口后平鋪放入裝有活性硅膠的干燥器中，以一層種子一層硅膠的置放順序在室溫下(25 ℃)脫水。定期進行稱質(zhì)量得到脫水后種子樣品質(zhì)量(M2)(允許0.3%的誤差)。從初始含水率起含水率每下降3%設(shè)置1個脫水梯度，共設(shè)置7個脫水梯度(包含初始含水率梯度)，每個梯度設(shè)置3個重復(fù)，即失水率在0、3%、6%、9%、12%、15%、18%時取樣1次并進行相關(guān)指標(biāo)的測定。以新鮮種子為基礎(chǔ)計算脫水至相應(yīng)含水率時種子樣品的質(zhì)量(M2)：

M2= [M1(1-G)] / (1-D)。

其中：G表示種子樣品初始含水率，%；D表示失水率在3%、6%、9%、12%、15%、18%時種子樣品的相對含水率，%。

將初始含水率和不同脫水梯度的種子用錫紙密封并貼好標(biāo)簽，暫時保存至-80 ℃冰箱中待全部種子脫水完畢后，立即進行后續(xù)試驗。

1.3 指標(biāo)測定與方法

1.3.1 楨楠種子基本生物學(xué)特性

1)種子形態(tài)。通過四分法選取50粒楨楠種子，用游標(biāo)卡尺測量其橫軸、縱軸長度，計算平均值，重復(fù)取4次。

2)種子千粒質(zhì)量。參照《林木種子檢驗規(guī)程》[13]，用四分法選取100粒種子稱取質(zhì)量(g)，計算平均值，重復(fù)取8次。計算8次重復(fù)的平均值、標(biāo)準差。

3)種子初始含水率。參照《林木種子檢驗規(guī)程》[13]，采用低溫烘干法，設(shè)置4次重復(fù)。先將潔凈鋁盒置于恒溫烘箱中于105℃烘2 h，烘后置于活化硅膠中進行冷卻，冷卻至室溫后于分析天平中稱得烘干鋁盒質(zhì)量(W1)。

用四分法選取種子15顆，切碎后取種子樣品4～5 g置于烘干鋁盒中稱質(zhì)量，得到烘干鋁盒和種子樣品初始質(zhì)量總和(W2)，再將其置于恒溫烘箱中，于103 ℃烘(17±1) h(若不能進行連續(xù)烘干，應(yīng)等再次打開烘箱后回溫至103℃后開始計時)。烘后置于活化硅膠中進行冷卻，冷卻至室溫后于分析天平中稱得鋁盒和烘干種子樣品質(zhì)量總和(W3)。以干質(zhì)量為基礎(chǔ)進行種子含水率的計算：

種子含水率= [ (W2-W3) × 100% ] / (W3-W1)。

1.3.2 楨楠種子生活力的測定

參照《林木種子檢驗規(guī)程》[13]，采用四唑染色法測定不同脫水梯度楨楠種子的生活力，每梯度設(shè)置3個重復(fù)，以初始含水率種子為對照(CK)。

用四分法取50粒種子樣品進行預(yù)處理，先用冷水浸泡48 h，然后在染色前除去種皮、避開胚將子葉表面劃破。用質(zhì)量分數(shù)0.5%的四唑溶液(配制時需要避光)于35℃恒溫箱中染色20 h，染色結(jié)束后用鑷子將種子擺放在鋪有蒸餾水潤濕濾紙的培養(yǎng)皿上，進行生活力有無的判定：胚與子葉全部為紅色或胚為紅色、胚附近未劃傷的子葉呈淡粉色時判定為有生活力。

根據(jù)試驗數(shù)據(jù)繪制含水量-生活力曲線，再利用Excel擬合出符合該曲線的回歸方程[14]，計算出楨楠種子的半致死含水率。

1.3.3 膜系統(tǒng)完整性的判定

采用胡晉[15]的方法測定不同脫水梯度種子的電導(dǎo)率來判定膜系統(tǒng)的完整性，每個梯度設(shè)置3個重復(fù)，以初始含水率種子為對照(CK)。

用四分法取50粒種子，稱質(zhì)量得到種子樣品質(zhì)量(M)。準備3個潔凈燒杯，將種子樣品倒入其中1個燒杯中，每個燒杯倒入250 mL蒸餾水，無種子樣品的兩個空白燒杯作為對照，燒杯用保鮮膜封口，24 h后測定每個燒杯的電導(dǎo)率。根據(jù)公式計算種子電導(dǎo)率：

種子電導(dǎo)率[ μS/(cm·g) ] = (σ-σ0) /M。

其中：σ表示含種子樣品燒杯的電導(dǎo)率，μS/cm；σ0表示兩空白燒杯電導(dǎo)率的平均值，μS/cm。

1.3.4 MDA含量測定

參照宋松泉[16]的方法進行MDA含量的測定，設(shè)置3個重復(fù)，以初始含水率種子的為對照(CK)。

1.3.5 SOD活性測定

參考鄒琦[17]、李鐵華等[11]和宋松泉[16]的方法并加以綜合改進，進行SOD活性測定，設(shè)置3個重復(fù)，以初始含水率種子為對照(CK)。

取種子樣品2 g，用50 mmol/L、pH 7.8的磷酸緩沖液[含質(zhì)量分數(shù)1%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和2 mmol/L抗壞血酸(下同)]冰浴研磨至勻漿后，定容至10 mL。1 000 g 4℃離心15 min，上清液即為粗酶液。取0.1 mL上清液(對照用0.1 mL、50 mmol/L、pH 7.8的磷酸緩沖液代替粗酶液)，避光條件下依次加入1.5 mL的50 mmol/L pH 7.8磷酸緩沖液、0.3 mL的130 mmol/L甲硫氨酸溶液、0.3 mL的750 μmol/L氮藍四唑溶液、0.3 mL的100 μmol/L EDTA-Na2溶液和0.3 mL的20 μmol/L核黃素溶液，混勻后于4 000 lx的恒溫光照箱中反應(yīng)30 min。反應(yīng)結(jié)束后避光測定(用避光30 min的50 mmol/L pH 7.8磷酸緩沖液進行調(diào)零)其在560 nm下的吸光度(OD)值。根據(jù)公式計算SOD活性：

SOD活性 = [(A0-A560) ×VT] / (A0× 0.5 ×W×V)。

其中：A0表示對照管的OD值；A560表示樣品管的OD值；VT表示粗酶提取液總體積，mL；W表示種子樣品質(zhì)量，g；V表示所用粗酶液體積，mL；蛋白質(zhì)含量為每克鮮質(zhì)量含蛋白質(zhì)量，mg/g。

1.3.6 CAT活性測定

參考鄒琦[17]、李鐵華等[11]和宋松泉[16]的方法并加以綜合改進，進行CAT活性測定，設(shè)置3個重復(fù)，以初始含水量種子為對照(CK)。

取種子樣品0.7 g，用50 mmol/L pH 7.8磷酸緩沖液冰浴研磨至勻漿后，定容至10 mL。1 000 g 4℃離心15 min，上清液即為粗酶液。取0.2 mL上清液(對照用0.2 mL煮死酶液代替粗酶液，調(diào)零用0.2 mL 50 mmol/L pH 7.8磷酸緩沖液代替粗酶液)，加入1.5 mL 50 mmol/l pH 7.0磷酸緩沖液。加入0.3 mL 10 mmol/L H2O2后立即計時，5 s后測定240nm初始OD值，40 s后再次測定OD值。以1 min內(nèi)A240減少0.1的酶量為1個酶活單位(U)，根據(jù)公式計算CAT活性：

CAT活性 = ΔA240×VT/ (0.1×V×t×W)；

ΔA240=AS0-(AS1+AS2) / 2；

CAT比活力 = CAT活性 / 蛋白質(zhì)含量。

其中：AS0表示加入煮死酶液的對照管OD值；AS1、AS2分別表示樣品管初始OD值和40 s后的OD值；VT表示粗酶提取液總體積，mL；V表示所用粗酶液體積，mL；W表示種子樣品質(zhì)量，g；t表示測定AS1到AS2的時間間隔，min；蛋白質(zhì)含量為每克鮮樣品含蛋白質(zhì)量，mg/g。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Microsoft Excel 2019進行數(shù)據(jù)的分析、制表；利用SPSS 22.0對幾次平行試驗結(jié)果進行最小顯著性差異方差分析等。

2 結(jié)果與分析

2.1 楨楠種子基本生物學(xué)特性

楨楠種子為長橢圓形，無胚乳，種皮脆且難以與子葉分離，胚與子葉質(zhì)量比小。經(jīng)測定，楨楠種子直徑為(6.89±0.26) mm，長(13.08±0.14) mm，千粒質(zhì)量(342.24±0.77) g，初始含水量為37.74%。

2.2 楨楠種子含水量與生活力關(guān)系

通過四唑染色法檢測楨楠種子生活力染色結(jié)果見圖1。

A. 有生活力種子seeds with viability; B. 無生活力種子seeds wthout viability. CU. 子葉未染色cotyledons unstained; CB. 子葉變黑cotyledons blackened; EU. 胚未染色embryos unstained。圖1 楨楠種子生活力四唑染色法檢測結(jié)果Fig.1 Seed viability assay with TTC staining

利用Excel擬合出該曲線的回歸方程(圖 2)，繪制楨楠種子生活力與含水率的關(guān)系曲線，其方程為Y=0.087 7X2-0.417 5X-17.372，由此算出楨楠種子生活力下降一半(半致死含水量，44.71%)時所對應(yīng)的含水率為29.09%。說明楨楠種子脫水耐性極差，在儲藏過程中的最低含水率應(yīng)高于29.09%。

圖2 楨楠種子生活力與含水率的關(guān)系Fig.2 The relationship between viability and water content of P. zhennan seeds

隨著楨楠種子含水率下降，生活力呈下降趨勢，而且下降速度較快(圖3A)。其中，種子的初始生活力為89.41%。當(dāng)含水率為37.74%、34.74%、31.74%、28.74%和19.74%時，差異性顯著(P<0.05)；當(dāng)含水率為25.74%和22.74%時，差異不顯著；且含水率降至19.74%時，生活力僅有10.61%。說明當(dāng)含水率降至25.74%時，絕大多數(shù)種子已經(jīng)沒有發(fā)芽潛力或死亡，同時，在解剖種子的過程中發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)種子的子葉和胚已經(jīng)變硬變黑。由此可見，楨楠種子對脫水極其敏感，表現(xiàn)出較高的頑拗性。

不同字母表示含水率水平間差異顯著(P<0.05)。Different letters in the same figure indicated significant differences at the level of water content, P < 0.05.圖3 脫水對楨楠種子生理指標(biāo)的影響Fig.3 Effects of dehydration on physiological indexes of P. zhennan seeds

2.3 楨楠種子含水量與電導(dǎo)率關(guān)系

當(dāng)細胞受到脫水傷害，膜系統(tǒng)會受到破壞，繼而導(dǎo)致細胞內(nèi)電解質(zhì)外泄，造成電導(dǎo)率的升高，所以電導(dǎo)率的大小可以用來判斷種子細胞膜結(jié)構(gòu)受到破壞的程度。楨楠種子電導(dǎo)率隨含水率的降低而升高(圖3B)，表明膜結(jié)構(gòu)受到的傷害不斷加劇。其中，初始電導(dǎo)率為0.84 μS/(cm·g)。當(dāng)含水率為37.74%、22.74%和19.74%時，差異性顯著(P< 0.05)；當(dāng)含水率為34.74%、31.74%、28.74%和25.74%時，差異不顯著，即脫水至34.74%時，電導(dǎo)率升高較快，而繼續(xù)脫水至25.74%時，電導(dǎo)率升高速度變緩；在脫水后期(含水率小于25.74%時)，電導(dǎo)率升高速度又變快。在脫水初期，楨楠種子電解質(zhì)濃度的升高激發(fā)了其細胞內(nèi)部的保護機制，在一定程度上緩解了膜系統(tǒng)的傷害進程；而在脫水后期，電導(dǎo)率升高幅度較大，說明保護機制不再起作用，原因可能是過高的電解質(zhì)濃度抑制了保護機制(或保護酶系統(tǒng)活性)或者保護酶系統(tǒng)在較低含水量時失活。

2.4 楨楠種子含水率與MDA含量關(guān)系

丙二醛(MDA)為膜脂過氧化作用的過氧化產(chǎn)物，可以加劇膜脂過氧化作用而造成膜系統(tǒng)的進一步破壞，因此，MDA含量可以用來判斷膜脂過氧化以及膜系統(tǒng)被破壞的程度。

楨楠種子MDA含量隨含水率的降低而升高(圖3C)，表明膜脂過氧化作用和膜系統(tǒng)受到破壞的程度不斷加劇。其中，初始MDA含量為5.12 μmol/g；當(dāng)含水率為37.74%、25.74%和22.74%時，差異性顯著(P< 0.05)；當(dāng)含水率為34.74%、31.74%和28.74%時，差異不顯著，即從初始含水量脫水至34.74%時，MDA含量升高速度較快；而繼續(xù)脫水至28.74%，MDA含量升高速度變緩；再脫水至19.74%，MDA含量升高再次變快，這與楨楠種子電導(dǎo)率隨含水率的變化趨勢接近，但MDA含量第2次上升速度的提高比電導(dǎo)率來得要早。在脫水初期，楨楠種子MDA含量的增加激發(fā)了其細胞內(nèi)部的保護酶系統(tǒng)，在一定程度上消除了MDA，緩解了膜脂過氧化進程；而在脫水后期，MDA含量增加速度再次加快，說明低含水率使保護酶系統(tǒng)不再起作用，引起了細胞膜脂過氧化作用的加劇，進而引起MDA積累。而第2次MDA含量增加速率比電導(dǎo)率來得要早，可能是由于與MDA代謝相關(guān)酶對脫水更敏感，在含水率較高時已經(jīng)不起作用。

2.5 楨楠種子含水率與SOD活性關(guān)系

2.6 楨楠種子含水率與CAT活性關(guān)系

過氧化氫酶(CAT)作為保護酶系統(tǒng)的重要抗氧化酶之一[19]，具有非常重要的生理功能，其主要作用是促使H2O2分解為分子氧和水，減少H2O2對膜系統(tǒng)的傷害。隨著含水率不斷降低，CAT活性呈先增加后減小的趨勢(圖3E)，其中，CAT活性初始值較大，與SOD活性相同，為20.88 U/mg。脫水至34.74%時，CAT活性有所上升，而含水率在37.74%、34.74%和31.74%時，差異不顯著，說明在脫水前期已經(jīng)激發(fā)了CAT作用，并一直維持較高的活性；當(dāng)含水率為31.74%、28.74%和25.74%時，差異顯著(P< 0.05)。楨楠種子含水率從31.74%到25.74%時，CAT活性急劇下降，說明隨著脫水進程，產(chǎn)生的H2O2開始積累，而CAT已經(jīng)達到飽和狀態(tài)，H2O2濃度過高也同時抑制了CAT活性；含水率在25.74%、22.74%和19.74%時，差異不顯著，即CAT活性已經(jīng)保持在較低水平，說明CAT在較低含水率時已基本失活。

2.7 各指標(biāo)相關(guān)性分析

在硅膠脫水的過程中，楨楠種子含水率不斷下降，其各生理指標(biāo)也發(fā)生變化。由相關(guān)性分析(表1)可知，楨楠種子的生活力與電導(dǎo)率、MDA含量和CAT活性隨著脫水的進行存在極顯著相關(guān)性(相關(guān)系數(shù)分別為-0.905、-0.957和0.945)，說明隨著脫水的進行，保護酶系統(tǒng)受到抑制，膜脂過氧化作用加強，引起楨楠種子膜透性加劇，有害過氧化物(MDA)積累，進一步引起種子生活力降低乃至完全喪失。

表1 楨楠種子在脫水過程中各生理指標(biāo)相關(guān)性分析

同時，SOD活性和CAT活性均與電導(dǎo)率和MDA含量之間存在顯著負相關(guān)關(guān)系(相關(guān)系數(shù)分別為-0.833、-0.743、-0.819和-0.871)，說明抗氧化系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶SOD和CAT確實能在一定程度上消除活性氧，減少有害過氧化產(chǎn)物的積累，從而降低脫水進程中膜系統(tǒng)的傷害。

3 討 論

種子脫水耐性是種子的基本特征之一，與種子的貯藏密切相關(guān)。種子脫水耐性的獲得通常在自然干燥成熟脫水之前，有些種類的種子在發(fā)育中期前就獲得脫水耐性。Roberts[20]在1973年根據(jù)種子對低溫和脫水的行為以及其貯藏特性，將種子分為3類，即正常性種子、中間性種子和頑拗性種子。大多數(shù)植物種子為正常型種子，這類種子在發(fā)育成熟時散失掉90%的水分，并且散落后繼續(xù)脫水到2%～6%仍具有較高活力，同時可在低含水率和低溫下長期保存。頑拗性種子一般不經(jīng)歷脫水過程，脫離母體時含水率高達40%～60%，對脫水和低溫(一般低于10 ℃)敏感，一般情況下脫水至15%～20%含水率時大多數(shù)或者全部死亡[21]。然而很多頑拗性種子或者脫水耐性差的種子都具有較高的經(jīng)濟價值，但其貯藏條件不易掌握，實現(xiàn)長期保存很困難，所以這類種子脫水耐性的研究就具有重要生產(chǎn)意義和科學(xué)價值。Ellis等[22]通過對阿拉伯咖啡種子的研究認為在正常性種子和頑拗性種子之間存在第3類貯藏行為的可能，即中間性種子，這類種子有一定的脫水耐性，但含水率降到7%～12%時就會受到傷害。不同脫水耐性的種子如何實現(xiàn)合理的種質(zhì)資源保存就顯得尤為關(guān)鍵。通過對楨楠種子脫水耐性的研究，探討如何對其進行適當(dāng)?shù)拿撍幚?，進而獲得其脫水耐性的更多了解，為楨楠種子的長期保存提供必要的理論和技術(shù)支持。

在進行發(fā)芽預(yù)試驗過程中發(fā)現(xiàn)楨楠種子有輕微的休眠現(xiàn)象。林木種子休眠的定義為具有生活力的種子在適宜的萌發(fā)環(huán)境條件(光、溫、水、氣)下，在30 d內(nèi)不發(fā)芽或者沒有達到高萌發(fā)率(80%)[23]。Tweddle等[24]的研究認為頑拗性種子由于含水量高而大多迅速萌發(fā)，不存在休眠現(xiàn)象，而近年來也有研究表明有些頑拗性種子確實具有休眠特性[25-26]。關(guān)于楨楠種子的休眠特性還有待進一步研究討論。

頑拗性種子成熟時的含水率一般在36%～90%[27]，并且對脫水極度敏感。同時，由于頑拗性種子對低溫敏感的特性[28-29]，在后續(xù)研究中，也可通過研究低溫逆境(或其他逆境指標(biāo))對楨楠種子生活力和過氧化代謝物含量及抗氧化酶系統(tǒng)的影響，為楨楠種子的儲存提供更加合理而有力的依據(jù)。

4 結(jié) 論

楨楠種子表現(xiàn)出較高的頑拗性，在儲藏過程中應(yīng)尤其注重其對水分的要求，輕微脫水可激發(fā)其保護酶(抗氧化)系統(tǒng)的活性，提高其脫水耐性，有利于種子儲藏。

楨楠種子在硅膠脫水過程中的生理響應(yīng)如下：生活力逐漸下降；電導(dǎo)率和丙二醛含量不斷上升，但均在脫水前期上升較慢、在脫水后期上升較快；超氧化物歧化酶活性和過氧化氫酶活性均先上升，之后急劇下降，34.74%時出現(xiàn)最大值；同時，SOD活性和CAT活性種子生活力與電導(dǎo)率、MDA含量、SOD活性和CAT活性存在顯著的相關(guān)性，其中，生活力與電導(dǎo)率和MDA含量呈負相關(guān)，與SOD活性和CAT活性呈正相關(guān)。

因此，本試驗結(jié)果所示楨楠種子儲藏最佳的含水率為34.74%，在生產(chǎn)實際中含水率可控制在34.74%±3%。