唐古特白刺N(yùn)tCBL1、NtCBL2基因克隆及表達(dá)分析

黎夢(mèng)娟，朱禮明，霍俊男，張景波，施季森，成鐵龍*

(1.南京林業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院，南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037；2.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院沙漠林業(yè)實(shí)驗(yàn)中心，內(nèi)蒙古 磴口 015200；3.南京林業(yè)大學(xué)，林木遺傳與生物技術(shù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210037)

植物在整個(gè)生命周期中會(huì)遇到各種不利的非生物逆境脅迫，如土壤鹽分、干旱、高溫、低溫、低鉀等。植物感受到非生物脅迫后會(huì)產(chǎn)生一些生物反應(yīng)來(lái)避免傷害發(fā)生，而其中的關(guān)鍵在于對(duì)非生物脅迫的檢測(cè)[1]。鈣離子作為重要的第二信使，普遍存在于真核生物的細(xì)胞中，在植物生長(zhǎng)發(fā)育及響應(yīng)外界環(huán)境脅迫中起關(guān)鍵作用[2-4]。外界環(huán)境刺激，如土壤鹽分、干旱、低溫、激素、低鉀等都能引起細(xì)胞中游離的Ca2+濃度在時(shí)空上出現(xiàn)特異性的變化[5]。這種Ca2+信號(hào)變化會(huì)被鈣結(jié)合蛋白感知并傳遞給下游的靶蛋白，靶蛋白通過(guò)調(diào)控下游目的基因從而激活相應(yīng)的應(yīng)答途徑[6]。到目前為止，在高等植物中主要有鈣調(diào)蛋白(calmodulins, CaM)、類(lèi)鈣調(diào)蛋白(calmodulin-like proteins, CML)、鈣依賴(lài)蛋白激酶(calcium-dependent protein kinases, CDPK)、類(lèi)鈣調(diào)磷酸酶B蛋白(calcineurin B-like proteins, CBL)這4種Ca2+感受器蛋白家族[7]。而鹽脅迫作為最常見(jiàn)的環(huán)境脅迫因子之一，引起植物的氧化脅迫[8]、離子脅迫[9]、滲透脅迫[10]，抑制植物的生長(zhǎng)發(fā)育，甚至可以導(dǎo)致植物的死亡。土壤鹽堿化問(wèn)題已經(jīng)成為全球性的生態(tài)環(huán)境與資源問(wèn)題，日益受到人們的重視[11]。

1998年CBL基因首次在擬南芥中被克隆出來(lái)[12]，由于與動(dòng)物的鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶B(CNB)和神經(jīng)元鈣傳感器(NCS)同源，由此被命名為鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶B亞基蛋白[12-13]。類(lèi)鈣調(diào)磷酸酶B亞基蛋白CBL是一個(gè)多基因家族鈣離子感受器，可以檢測(cè)到鈣離子的時(shí)空變化。研究表明，CBL基因家族在不同植物中的數(shù)目是不等的，擬南芥、水稻均有10個(gè)[14]，茶樹(shù)有7個(gè)[15]。CBL通過(guò)其特異性靶蛋白絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶CIPK互作構(gòu)成CBL-CIPK信號(hào)系統(tǒng)在植物應(yīng)答外界環(huán)境刺激中起重要作用[16]。

唐古特白刺(Nitrariatangutorum)是蒺藜科(Zygophyllaceae) 白刺屬(Nitraria)一種鹽生植物，為我國(guó)所特有，主要分布在河西走廊干旱鹽漬化地區(qū)，具有耐干旱、耐鹽堿、防風(fēng)固沙等特點(diǎn)[17]，在治理土壤荒漠化和鹽堿化中發(fā)揮著重要作用[18]。唐古特白刺含有大量的營(yíng)養(yǎng)成分和藥用成分，具有較高藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。但是對(duì)唐古特白刺的研究主要集中在生理生化分析[19-20]、化學(xué)成分的提取[21]、優(yōu)良家系的選擇[22]上，而從分子水平上闡述其耐鹽機(jī)制的研究鮮見(jiàn)。本研究以唐古特白刺為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)CBL1、CBL2基因進(jìn)行克隆分析并研究其在鹽、干旱、冷脅迫條件下的表達(dá)情況，為探討唐古特白刺的耐鹽機(jī)制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

將唐古特白刺種子用沙土于4 ℃下沙藏2～6個(gè)月，取出后用發(fā)芽盒萌發(fā)，待種子長(zhǎng)出兩片子葉時(shí)將其種到土壤中。種植土壤以V營(yíng)養(yǎng)土∶V珍珠巖∶V蛭石=5∶1∶1進(jìn)行配制，每隔4 d澆1次水。

種植白刺6周后，選擇長(zhǎng)勢(shì)一致、生長(zhǎng)良好的唐古特白刺并隨機(jī)分成對(duì)照組和處理組，對(duì)照組正常用水進(jìn)行澆灌，鹽脅迫處理組以500 mmol/L NaCl溶液進(jìn)行澆灌，干旱脅迫處理組以300 mmol/L甘露醇液澆灌，每盆澆灌750 mL；冷脅迫處理組置于4 ℃的光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行處理，每處理3次重復(fù)。分別在脅迫時(shí)間為0、1、3、6 h取唐古特白刺根、莖、葉片，用液氮速凍，于-80 ℃超低溫冰箱內(nèi)儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 唐古特白刺總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄

以唐古特白刺新鮮嫩葉為試驗(yàn)材料，用Bioteke RNA多糖多酚型植物試劑盒提取唐古特白刺總RNA，得到的總RNA用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。再參照HiScript? Ⅲ 1st Strand cDNA 反轉(zhuǎn)試劑盒(Vazyme)進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。cDNA的合成體系為：總RNA 10 μL，10 × RT mix、HiScript III Enzyme mix各2 μL，Random hexamers 1 μL，RNase-free ddH2O 20 μL。反應(yīng)程序設(shè)置為：25 ℃ 5 min，37 ℃ 45 min，85 ℃ 5 s。為了盡量減少RNA酶的污染，進(jìn)行試驗(yàn)所需的研缽、槍頭、離心管等均用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的DEPC水浸泡且高壓滅菌后使用，總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄均在超凈臺(tái)內(nèi)操作。

1.3 唐古特白刺N(yùn)tCBL1、NtCBL2基因的克隆

根據(jù)南京林業(yè)大學(xué)林木遺傳與生物技術(shù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室已有的部分唐古特白刺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，進(jìn)行同源基因比對(duì)后找出目的基因，使用Oligo 7.0設(shè)計(jì)特異性引物，將引物命名為NtCBL1-F、NtCBL1-R和NtCBL2-F、NtCBL2-R，如表1所示。以反轉(zhuǎn)得到的cDNA為模板，目的CBL1、CBL2片段進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的片段，切膠回收后的純化產(chǎn)物與pMD19-T Vector連接，再轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，篩選得到的陽(yáng)性克隆菌液送到公司測(cè)序。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物序列

1.4 CBL基因的生物信息學(xué)分析

在NCBI中用BLAST(http：//www.NCBI.nlm.nih.gov)搜索NtCBL1、NtCBL2基因所編碼的氨基酸同源的氨基酸序列；通過(guò)DNAMAN軟件對(duì)克隆得到的NtCBL1、NtCBL2基因所編碼的氨基酸序列和這些同源序列進(jìn)行相似性比對(duì)分析；用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)在線軟件預(yù)測(cè)保守結(jié)構(gòu)域；通過(guò)網(wǎng)站 http://web.expasy.org/protparam/分析該蛋白的理化性質(zhì)；利用Oligo7和NCBI在線軟件設(shè)計(jì)相關(guān)引物；利用MEGAX中的鄰接法(neighbor-joining,NJ)進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建。

1.5 唐古特白刺N(yùn)tCBL1、NtCBL2基因的亞細(xì)胞定位

利用XbaI與BamhI酶切位點(diǎn)對(duì)pJIT166質(zhì)粒對(duì)進(jìn)行雙酶切，酶切反應(yīng)體系為PJIT166質(zhì)粒 3 μL，10×CutSmart Buffer 5 μL，XbaI、BamHⅠ各 1 μL，ddH2O 40 μL。反應(yīng)條件為37 ℃酶切1 h，雙Z酶切產(chǎn)物用切膠回收試劑盒進(jìn)行回收。設(shè)計(jì)帶XbaⅠ與BamhI酶切位點(diǎn)的引物gNtCBL1-F、gNtCBL1-R和gNtCBL2-F、gNtCBL2-R(表1)，其中引物上的小寫(xiě)字母為載體上的序列。利用同源重組的方法構(gòu)建pJIT166-NtCBL1-GFP、pJIT166-NtCBL2-GFP融合表達(dá)載體，以哥倫比亞Col擬南芥葉片制備原生質(zhì)體，參照PEG介導(dǎo)法[23]進(jìn)行目的基因的亞細(xì)胞定位。

1.6 唐古特白刺N(yùn)tCBL1、NtCBL2基因的表達(dá)分析

以不同鹽脅迫、干旱脅迫、冷脅迫條件下不同時(shí)間處理的唐古特白刺葉為材料，提取RNA并用HiScript? Ⅲ 1st Strand cDNA for qPCR(+gDNA wiper)反轉(zhuǎn)試劑盒(Vazyme)進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。在NBCI在線設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物，NtCBL1引物為qCBL1-F、qCBL1-R，NtCBL2引物為qCBL2-F、qCBL2-R，內(nèi)參引物為β-Actin-F、β-Actin-R(表1)，參照AceQ qPCR SYBR Green mix(Vazyme)進(jìn)行熒光定量分析。采用2-ΔΔCT[24]計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量，數(shù)據(jù)結(jié)果利用SPSS進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 唐古特白刺N(yùn)tCBL1、NtCBL2基因的克隆

以唐古特白刺葉片cDNA為模板，設(shè)計(jì)特異性引物NtCBL1-F、NtCBL1-R和NtCBL2-F、NtCBL2-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得與預(yù)期條帶大小一致的擴(kuò)增條帶(圖1)。NtCBL1基因cDNA編碼區(qū)為642 bp，而NtCBL2基因cDNA編碼區(qū)為681 bp。

M. DL2000 DNA marker; 1、2. 對(duì)照 control。圖1 唐古特白刺N(yùn)tCBL1、NtCBL2基因的PCR 擴(kuò)增電泳結(jié)果Fig.1 PCR amplification of NtCBL1 and NtCBL2 gene

2.2 唐古特白刺N(yùn)tCBL1、NtCBL2序列的參數(shù)分析

利用 http://web.expasy.org/網(wǎng)址中的ProtParam 工具對(duì)編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)，得出NtCBL1蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為52.77 ku；理論等電點(diǎn)(pI) 5.21，分子式為C1 971H3 302N642O836S106。脂肪系數(shù)為 30.37，平均親水系數(shù)為0.657，預(yù)測(cè)其為疏水蛋白。蛋白質(zhì)不穩(wěn)定指數(shù)為32.78，被認(rèn)定為穩(wěn)定性蛋白。

鑒于Hadoop平臺(tái)下作業(yè)調(diào)度算法在Reduce任務(wù)調(diào)度方面的不足，本文提出了一種新的任務(wù)調(diào)度算法，其基本思想在于選擇系統(tǒng)中的最優(yōu)節(jié)點(diǎn)，將特定的Reduce任務(wù)調(diào)度到最優(yōu)節(jié)點(diǎn)上，從而減少任務(wù)的中間數(shù)據(jù)傳輸時(shí)間，省去對(duì)數(shù)據(jù)中心帶寬資源的占用。其中最優(yōu)節(jié)點(diǎn)是指集群中通過(guò)網(wǎng)絡(luò)鏈路傳輸Map階段中間數(shù)據(jù)時(shí)經(jīng)過(guò)的跳數(shù)最少的節(jié)點(diǎn)。

NtCBL2蛋白質(zhì)分子質(zhì)量26.10 ku；理論理論等電點(diǎn)(pI) 4.82，分子式為C1 179H1 832N298O356S7。脂肪系數(shù)為45.58，平均親水系數(shù)為-0.243，預(yù)測(cè)其為親水蛋白。蛋白質(zhì)不穩(wěn)定指數(shù)為92.30，被認(rèn)定為不穩(wěn)定性蛋白。

將NtCBL1、NtCBL2的CDS序列提交到NCBI的ORF finder在線翻譯工具，可知NtCBL1翻譯213個(gè)氨基酸，NtCBL2翻譯226個(gè)氨基酸。利用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)在線軟件分析，結(jié)果顯示，NtCBL1、NtCBL2蛋白均具有3個(gè)EF手型結(jié)構(gòu)域，含有Ca2+binding位點(diǎn)，是鈣離子結(jié)合蛋白，可進(jìn)行鈣信號(hào)傳導(dǎo)(圖2A、2B)。NtCBL1和NtCBL2蛋白的第1個(gè)和第2個(gè)EF手型結(jié)構(gòu)域距離9個(gè)氨基酸，而第2個(gè)和第3個(gè)的距離均為16個(gè)氨基酸。

灰色區(qū)域代表EF手型結(jié)構(gòu)域，aa為氨基酸單位。The gray region represents EF hand domain, aa is amino acid unit.圖2 NtCBL1蛋白(A)和NtCBL2蛋白(B)蛋白 保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig.2 The prediction for conserved domains of NtCBL1 protein(A) and NtCBL2 protein(B)

2.3 NtCBL1、NtCBL2氨基酸序列的同源性比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析

在NCBI上下載其他CBL1蛋白序列，再用DNAMAN軟件對(duì)NtCBL1、NtCBL2蛋白與其他植物的CBL1、NtCBL2蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果(圖3A)顯示，NtCBL1蛋白與其他蛋白的同源相似性為80.0%～90.0%。其中，NtCBL1蛋白與毛果楊(Populustrichocarpa)PtCBL1蛋白的同源相似性最高，達(dá)到88.3%，與擬南芥(Arabidopsisthaliana)的則為83.1%。這些結(jié)果表明，NtCBL1所編碼的蛋白序列與其他植物的同源性較高且它們均含有豆蔻?；Y(jié)構(gòu)域(MGXXXS/T)。比對(duì)NtCBL2蛋白與其他植物蛋白序列，結(jié)果顯示，NtCBL2蛋白與其他植物蛋白的同源相似性均高于90%且與陸地錦(Gossypiumhirsutum)、杜梨(Pyrusbetulifolia)高達(dá)93.81%(圖3B)。

A.NtCBL1與其他植物CBL1蛋白的多序列比對(duì)分析multiple sequence alignment of NtCBL1 and CBL1 proteins of other plants;AAC26008.1.擬南芥Arabidopsis thaliana；ABO43660.1.毛果楊Populus trichocarpa；AXM42381.1.木薯Manihot esculenta；KAF4362542.1.大麻Cannabis sativa；NP_001239047.1.番茄Solanum lycopersicum；ABC67906.1.胡楊Populus euphratica。B.NtCBL1與其他植物CBL1蛋白的多序列比對(duì)分析multiple sequence alignment of NtCBL2 and CBL2 proteins of other plants；ABW06389.1.陸地棉Gossypium hirsutum；AGM15885.1.杜梨Pyrus betulifolia；ABJ09704.1.胡楊Populus euphratica；AFK64728.1.百合Lilium longiflorum；ABO43661.1.毛果楊Populus trichocarpa。圖3 NtCBL與其他植物CBL蛋白的多序列比對(duì)分析Fig.3 The multiple sequence alignment of NtCBL and CBL proteins from other plants

用MEGA-X軟件，采用鄰接法(neighbor joining, NJ)對(duì)氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，Bootstrap設(shè)置為1 000，結(jié)果如圖4所示?？梢?jiàn)進(jìn)化樹(shù)主要聚類(lèi)成兩大支，唐古特白刺N(yùn)tCBL1和擬南芥AtCBL1、AtCBL9的同源性最高，它們的親緣關(guān)系最近，而唐古特白刺N(yùn)tCBL2和擬南芥AtCBL2、AtCBL3聚類(lèi)于同一發(fā)育分支上，表明它們的同源一致性較高。

圖4 CBL進(jìn)化樹(shù)分析Fig.4 The phylogenetic tree analysis of CBL

綜上表明，所克隆得到的兩個(gè)基因?qū)貱BL基因家族，編碼唐古特白刺類(lèi)鈣調(diào)磷酸酶B亞基蛋白。

2.4 唐古特白刺基因的亞細(xì)胞定位

圖5 轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)的亞細(xì)胞定位結(jié)果Fig.5 Subcellular location results of transformation of Arabidopsis protoplasts

由圖5可知，對(duì)照組PJIT166的GFP分布于整個(gè)原生質(zhì)體中，經(jīng)過(guò)明場(chǎng)和熒光場(chǎng)疊加一起表明，空載PJIT166在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、質(zhì)膜上都有表達(dá)。而NtCBL1、NtCBL2主要在質(zhì)膜上發(fā)出熒光，說(shuō)明這兩個(gè)基因翻譯的蛋白可能在質(zhì)膜上發(fā)揮作用。

2.5 唐古特白刺基因的表達(dá)分析

為了研究NtCBL1、NtCBL2在不同脅迫條件下的表達(dá)情況，分別用500 mmol/L NaCl進(jìn)行鹽脅迫處理、300 mmol/L的甘露醇進(jìn)行干旱脅迫處理以及4 ℃的冷脅迫處理。以β-Actin為內(nèi)參基因，根據(jù)NtCBL1、NtCBL2基因序列設(shè)計(jì)qCBL1-F/R、qCBL2-F/R熒光引物，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 在不同脅迫條件下NtCBL基因表達(dá)分析Fig.6 Expression profiles of NtCBL gene under different stress

圖6顯示，在未處理前NtCBL1基因在莖中的表達(dá)量最高，幾乎為葉片中的2倍，在根中的表達(dá)量最低。同樣地，NtCBL2基因在莖中的表達(dá)量最高，其次是在根中，而在葉片中的表達(dá)量最低。500 mmol/L鹽脅迫處理下，NtCBL1基因的表達(dá)發(fā)生了變化，根、莖、葉內(nèi)基因表達(dá)量在3 h均達(dá)到最高值，相比未處理前根中上調(diào)了1.56倍，在莖中上調(diào)了1.78倍，而在葉片中的上調(diào)倍數(shù)最為明顯，為2.94倍。NtCBL2在鹽脅迫下雖然存在波動(dòng)，但是沒(méi)有顯著性差異，相比處理前，在1 h時(shí)上調(diào)得最為顯著，在葉片內(nèi)表達(dá)量也僅達(dá)到其對(duì)照的1.29倍。干旱脅迫下，NtCBL1基因在莖、葉內(nèi)都上調(diào)表達(dá)，但是上升的倍數(shù)不是很明顯，最高上調(diào)情況發(fā)生在處理1 h的葉片內(nèi)，上調(diào)倍數(shù)為1.44。但是NtCBL2基因在干旱處理下上升和降低都沒(méi)有顯著性差異。在4 ℃冷處理下，NtCBL2基因在根、葉中顯示出先升高后下降的趨勢(shì)，而在莖中也顯示相同的趨勢(shì)，但是變化不是很明顯；而NtCBL2基因在葉片中整體上調(diào)表達(dá)，在1 h是達(dá)到最高，為對(duì)照的1.59倍。

3 討 論

CBL-CIPK響應(yīng)多種逆境脅迫，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中具有重要作用。CBL-CIPK途徑最開(kāi)始是在鹽敏感的擬南芥突變體缺失基因sos3(cbl4)的分離鑒定中被發(fā)現(xiàn)的[11]，大多數(shù)CBL蛋白定位于細(xì)胞膜，因此，大多CBL-CIPK途徑在很大程度上與細(xì)胞膜相關(guān)[25]。對(duì)鹽生植物唐古特白刺進(jìn)行CBL基因克隆，獲得NtCBL1基因cDNA編碼區(qū)為642 bp，共編碼213個(gè)氨基酸殘基。NtCBL2基因cDNA編碼區(qū)為681 bp，共編碼226個(gè)氨基酸殘基。結(jié)構(gòu)分析表明，NtCBL1、NtCBL2基因有EH手型保守結(jié)構(gòu)域，這是與Ca2+結(jié)合的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。NtCBL1蛋白與其他植物的CBL1蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果NtCBL1蛋白與毛白楊、大麻、擬南芥、木薯的同源相似性較高。其中，NtCBL1蛋白與毛果楊PtCBL1蛋白的同源相似性最高，說(shuō)明NtCBL1基因可能與PtCBL1基因在功能上有相似之處。且它們均含有豆蔻酰化結(jié)構(gòu)域(MGXXXS/T)[26]，在擬南芥植物細(xì)胞中該基序介導(dǎo)的膜結(jié)合和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用[27]，為CBL蛋白第1亞族成員[13]。NtCBL2蛋白與其他植物的CBL2蛋白的氨基酸序列也具有較高的同源相似性，同源相似性均在90%以上。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果都表明了NtCBL1、NtCBL2蛋白在質(zhì)膜上表達(dá)，它們可做膜結(jié)合蛋白在細(xì)胞中發(fā)揮作用。

到目前為止，CBL1基因是擬南芥CBL基因家族亦是CBL基因家族中研究得最廣泛的基因。CBL1基因在鹽、干旱、低溫、低鉀中的作用已在模式植物和其他作物中被探究[1, 28]。比較野生型擬南芥和cbl1突變體中CIPK7的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)CIPK7通過(guò)與CBL1的相互作用在冷反應(yīng)中發(fā)揮功能[29]。此外，過(guò)表達(dá)CBL1的植株表現(xiàn)出對(duì)鹽和干旱的耐性增強(qiáng)，但對(duì)低溫的耐性降低[30]。而在鹽脅迫下杜梨CBL1在根、莖、葉中高表達(dá)[31]。本研究結(jié)果表明NtCBL1基因受鹽脅迫處理的誘導(dǎo)，在根莖葉中上調(diào)表達(dá)，在脅迫3 h時(shí)葉片上調(diào)達(dá)到最高值，NtCBL1基因的表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組提高了2.94倍，推測(cè)NtCBL1基因能夠提高唐古特白刺高鹽條件下的耐受能力。而干旱脅迫下，NtCBL1基因有一定的上調(diào)現(xiàn)象，最高上調(diào)表達(dá)了1.44倍，可能NtCBL1基因在唐古特白刺干旱耐受上起到一定的作用。在4 ℃冷處理下，NtCBL1基因僅在葉片中較為明顯的上調(diào)表達(dá)。相對(duì)于CBL1基因來(lái)說(shuō)，對(duì)CBL2基因的研究較少。Nurazzaman[32]將煙草NsylCBL2轉(zhuǎn)入擬南芥的研究中，發(fā)現(xiàn)NsylCBL2可能不受鹽與鎂的信號(hào)誘導(dǎo)。對(duì)胡楊進(jìn)行鹽脅迫處理時(shí)，發(fā)現(xiàn)葉片中PeCBL1、PeCBL2均上調(diào)表達(dá)[33]。在對(duì)馬尾松PmCBL3基因的研究中發(fā)現(xiàn)，PmCBL3響應(yīng)干旱脅迫[34]。這些均表明了同一基因在不同的物種中可能有相似的功能，也可能有差異。而筆者在研究唐古特白刺N(yùn)tCBL2基因在鹽脅迫、干旱脅迫下的表達(dá)特征時(shí)，發(fā)現(xiàn)NtCBL2基因的變化不明顯，可能其在鹽脅迫、干旱脅迫下的作用不明顯。而在4 ℃冷脅迫下，NtCBL2基因在葉片中有一定的上調(diào)表達(dá)，推測(cè)其在冷脅迫響應(yīng)中發(fā)揮一定的作用。

目前，對(duì)CBL家族的分析研究主要集中于擬南芥、水稻和玉米等模式植物中[16]，對(duì)具有強(qiáng)抗鹽性的唐古特白刺等木本植物研究較少。唐古特白刺對(duì)高鹽、干旱、低溫等非生物脅迫具有極強(qiáng)的耐受性，是研究環(huán)境脅迫的理想材料。本研究從唐古特白刺中克隆出NtCBL1、NtCBL2基因，研究了鹽脅迫條件下的基因表達(dá)模式，為唐古特白刺的耐鹽分子機(jī)制研究奠定了理論基礎(chǔ)。