超聲波輔助衍生-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定克氏原鰲蝦中的硝基呋喃類代謝物殘留

朱曉玲，劉杰，江豐，韓智，劉迪，范志勇，張莉，王會霞

（湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗研究院，湖北省食品質(zhì)量安全檢測工程技術(shù)研究中心，湖北武漢 430070）

硝基呋喃類藥物是一類具有5-硝基-2-呋喃結(jié)構(gòu)的合成類抗感染藥物[1]，在臨床上主要作為廣譜抗菌藥使用，目前已知的最常用的硝基呋喃類藥物主要有呋喃唑酮、呋喃它酮，呋喃西林，呋喃妥因4種（結(jié)構(gòu)式見圖1），該類藥物曾在養(yǎng)殖業(yè)中被應用于預防和治療由沙門氏菌和埃希氏菌引起的豬、牛、水產(chǎn)以及蜜蜂的胃腸道疾病[2]。但后來的研究發(fā)現(xiàn)，硝基呋喃類藥物具有遺傳毒性和致癌性[3]，因此世界各國先后禁止該類藥物使用，并規(guī)定用作食品的動物組織均不得檢出硝基呋喃類藥物殘留，我國農(nóng)業(yè)部于2002年頒布禁止使用硝基呋喃類抗生素的禁令。但在實際生產(chǎn)實踐中，該類藥物以抗菌效果好、抗菌譜寬、價格低廉且不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點，使得該類藥物在畜禽養(yǎng)殖業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中仍然存在違法使用的可能性，另外，從近幾年的食品安全監(jiān)管中也證實，雖然該類藥物早在2002年就已被列為禁用藥物，但目前仍存在非法使用的情況[4]，給人類健康造成威脅。

圖1 4種常用的硝基呋喃類藥物結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formula of four commonly used nitrofurans

硝基呋喃類藥物進入動物體內(nèi)后迅速代謝，無法直接檢測動物組織中的原型藥物，藥物代謝后形成相應的代謝產(chǎn)物，分別為AMOZ、AOZ、SEM、AHD，代謝產(chǎn)物與動物機體蛋白質(zhì)緊密結(jié)合形成穩(wěn)定的化合物，因此，世界各國均以檢測硝基呋喃類代謝物作為判定是否存在違法使用該類禁用藥物的依據(jù)。目前，報道的硝基呋喃類藥物檢測方法主要有酶聯(lián)免疫法[5]、極譜法[6]、拉曼光譜法[7,8]、毛細管電泳法[9]、伏安法[10]、分光光度法[11]、高效液相色譜法[12,13]和液質(zhì)聯(lián)用法(LC-MS/MS)[14-17]等，其中液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法因具有高靈敏度而被廣泛應用，我國現(xiàn)行的檢測國家標準方法GB/T 21311-2007[18]，農(nóng)業(yè)部783號公告-1-2006[19]等，均采用的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，為我國的食品安全監(jiān)管提供了技術(shù)保障，但目前的標準方法以及大多數(shù)文獻報道的檢測方法，操作過程均較為耗時，樣品的水解和衍生時間較長，需16 h，前處理復雜，而超聲波輔助衍生能有效加快樣品中目標化合物的水解速率和衍生反應速率，大大縮短樣品前處理時間，提高檢測效率，因此，開發(fā)超聲波輔助衍生-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測樣品中的硝基呋喃類代謝物殘留在實際應用中具有一定的意義。

克氏原鰲蝦作為一種甲殼類水產(chǎn)品，多國研究報道指出[20,21]，動物甲殼中可能存在非呋喃西林藥物來源的氨基脲，導致食品安全監(jiān)管過程中采用氨基脲進行呋喃西林藥物違法使用的判定依據(jù)存在一定的爭議，可能存在假陽性結(jié)果判定，造成經(jīng)濟損失、產(chǎn)業(yè)危機和消費者恐慌，因此，研究者們目前仍在持續(xù)開展帶殼動物性產(chǎn)品中硝基呋喃類藥物殘留標志物或形成機制等相關(guān)研究[22]。本文以克氏原鰲蝦為檢測對象，建立了超聲波輔助衍生，LC-MS/MS測定樣品中4種硝基呋喃代謝物的分析方法，本方法改進后將衍生時間縮短到60 min，大大提高檢測效率，為順利開展后續(xù)研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

呋喃唑酮代謝物：3-氨基-2-噁唑烷基酮（AOZ），呋喃它酮代謝物：5-嗎啉甲基-3-氨基-2-惡唑烷基酮（AMOZ），呋喃西林代謝物：氨基脲（SEM），呋喃妥因代謝物：1-氨基-2-內(nèi)酰脲（AHD），均購于德國Dr.Ehrenstorfer公司，純度≥99%；硝基呋喃代謝物內(nèi)標AOZ-D4，SEM-13C15N2，AMOZ-D5，AHD-13C3均購于德國Witega公司，純度≥99%；乙腈：HPLC級，美國Merck公司；甲酸：LC-MS級，F(xiàn)isher Scientific(中國)有限公司；2-硝基苯甲醛、鹽酸、磷酸氫二鉀、乙酸乙酯：AR級，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Qtrap 6500三重四級桿質(zhì)譜儀，美國AB SCIEX公司；Ultimate 3000液相色譜儀，美國Thermo Fisher公司；AcclaimTM RSLC 120 C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.2 μm），美國Thermo Scientific公司；Elmasonic P超聲儀，德國Elma公司；Allegra X-15R離心機，貝克曼庫爾特有限公司；N-EVAP 116氮吹儀，上海安譜科學儀器有限公司；Milli-Q超純水器，法國密理博公司；0.22 μm有機相微孔濾膜，天津市津騰實驗設備有限公司；YALBOYS渦旋混合器，上海安譜科學儀器有限公司；ME204電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 相關(guān)溶液的配制

（1）標準溶液的配制：分別準確稱取AOZ、SEM、AMOZ、AHD標準品，用甲醇溶解，配制成100 μg/mL的單標標準儲備液；移取適量單標標準儲備液，用水稀釋，配制成0.1 μg/mL的混合標準工作溶液，于-18 ℃冰箱中保存。

（2）內(nèi)標溶液的配制：分別準確稱取AOZ-D4，SEM-13C15N2，AMOZ-D5，AHD-13C3內(nèi)標標準品，用甲醇溶解并定容，配制成10 μg/mL的單標標準儲備液；移取適量單標內(nèi)標標準儲備液，用水稀釋，配置成0.1 μg/mL的混合內(nèi)標標準工作溶液，-18 ℃冰箱中保存。

（3）0.1%甲酸水溶液：準確吸取1 mL LC-MS級甲酸，用超純水定容至1 L。

（4）0.1 mol/L 2-硝基苯甲醛衍生劑：稱取1.5 g 2-硝基苯甲醛，用甲醇溶解并定容至100 mL。

（5）1.0 mol/L磷酸氫二鉀溶液：稱取87.1 g磷酸氫二鉀，溶解于500 mL水中。

（6）0.2 mol/L鹽酸溶液：量取濃鹽酸17 mL，用水稀釋至1000 mL。

1.3.2 樣品制備與前處理

克氏原鰲蝦樣品，經(jīng)去蝦殼、蝦線，取可食肉組織，絞碎混合均勻，于-20 ℃下避光保存，備用。

稱取絞碎的樣品2.0 g，置于50 mL離心管中，加入硝基呋喃代謝物混合內(nèi)標工作溶液50 μL，渦旋混合50 s，再加入10 mL 0.2 mol/L鹽酸溶液和100 μL 0.1 mol/L 2-硝基苯甲醛衍生劑，渦旋混勻50 s，將混勻后的離心管置于75 ℃恒溫超聲儀中超聲提取反應80 min，取出離心管冷卻至室溫，加入2 mL 1.0 mol/L K2HPO4溶液，渦旋混勻50 s，加入10 mL乙酸乙酯，旋轉(zhuǎn)混合20 min，4000 r/min離心5 min。上清液于40 ℃ N2吹干，殘渣用2.0 mL流動相渦旋混合溶解，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后上機測定。

1.3.3 液相色譜條件

色譜柱采用AcclaimTM RSLC 120 C18（100 mm×2.1 mm，2.2 μm），流動相A為乙腈，流動相B為0.1%甲酸水溶液，洗脫梯度程序為：0.0～2.0 min，B相保持90%，2.0～7.0 min，B相90%～5%，7.0～12.0 min，B相保持5%，12.1～15.0 min, B相90%。柱溫40 ℃；進樣量5 μL；流速0.4 mL/min。

1.3.4 質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子源；正離子模式；多反應監(jiān)測掃描；噴霧電壓5500 V；離子源溫度550 ℃；霧化氣流量（GS1）：55 L/h；氣簾氣流速（CUR）：35 L/h；輔助氣流量（GS2）：55 L/h；其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 4種目標物及4種內(nèi)標物的優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Optimized parameters of MS/MS for 4 target and 4 internal standard compounds

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用儀器配置的MultiQuant定量分析軟件，對采集樣品中目標化合物的定量離子對進行定量分析，采用化合物的定性離子對以及定性定量離子對豐度比進行定性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 衍生方式選擇

國家標準檢驗方法對硝基呋喃類藥物的檢測，前處理過程中的衍生步驟主要采用37 ℃恒溫箱過夜16 h[18]或37 ℃恒溫水浴避光振蕩16 h[19]，較為耗時，本研究比較超聲波輔助衍生和恒溫振蕩衍生兩種方式對硝基呋喃代謝物衍生效率的影響，設定溫度60 ℃，衍生1 h，得到兩種不同衍生方式下對應衍生產(chǎn)物的含量結(jié)果比較，見圖2。試驗結(jié)果表明，當采用標準溶液進行衍生反應時，兩種衍生方式下衍生產(chǎn)物的含量相當，但采用陽性樣品進行衍生比較試驗時，超聲波輔助衍生所得的衍生產(chǎn)物含量明顯高于恒溫振蕩衍生方式下的產(chǎn)物含量，這可能是由于硝基呋喃代謝物在動物組織中主要以結(jié)合態(tài)形式存在，需要在酸性條件下將目標代謝物從組織蛋白中水解游離出來，才能與衍生試劑發(fā)生反應生成相應的衍生產(chǎn)物，超聲波輔助衍生能加速不互溶兩相之間的質(zhì)量傳遞，從而加快硝基呋喃代謝物從組織結(jié)合蛋白中水解游離出來，并與2-硝基苯甲醛衍生試劑迅速反應生成相應的衍生產(chǎn)物，提高衍生效率。因此，選擇超聲波輔助衍生的方式進行樣品前處理。

圖2 超聲波輔助衍生和恒溫振蕩衍生對硝基呋喃藥物衍生效率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic and constant-temperature oscillation on the derivatization efficiency of nitrofuran drugs

2.2 衍生溫度的優(yōu)化

在空白基質(zhì)樣品中添加適當濃度的混合標準工作溶液，按照1.3.2節(jié)樣品制備方法進行前處理，并分別設置45、55、65、75、85、95 ℃進行衍生溫度的比較和優(yōu)化，結(jié)果見圖3，從圖3可以看出，當衍生溫度為75 ℃時，四種硝基呋喃類目標化合物衍生效果較好，衍生溫度為95 ℃時，AHD和AMOZ衍生效果變差，因此，選擇75 ℃作為衍生最佳溫度。

圖3 溫度對硝基呋喃藥物衍生效率的影響Fig.3 Effect of temperature on the derivatization efficiency of nitrofuran drugs

2.3 衍生時間的優(yōu)化

在選定衍生方法和衍生溫度的前提下，通過空白基質(zhì)樣品加標的方式進行衍生時間的比較，分別設置25、40、50、60、70、80、135、160、210 min進行衍生時間比較優(yōu)化，結(jié)果見圖4，從圖4中可以看出，當衍生時間為80 min時，4種硝基呋喃類化合物衍生效果最佳，因此選擇衍生時間為80 min進行試驗。

圖4 時間對硝基呋喃藥物衍生效率的影響Fig.4 Effect of time on the derivatization efficiency of nitrofuran drugs

2.4 色譜質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用1.3.2節(jié)樣品前處理方法對4種硝基呋喃代謝物混合標準工作溶液和4種內(nèi)標混合標準工作溶液分別進行衍生、提取、濃縮、復溶，對復溶后的衍生標準溶液，采用針泵以流動注射的方式進行各目標化合物質(zhì)譜條件的優(yōu)化，8種化合物均在正離子模式下具有較強的分子離子峰，因此在正離子模式下進行母離子全掃描，選定母離子，對母離子施加合適碰撞能量，使其產(chǎn)生子離子，并對子離子進行全掃描，選取豐度較強的兩對子離子作為定性離子，并同時優(yōu)化去簇電壓（DP）、碰撞能量(CE)，使靈敏度達到最佳，優(yōu)化后的質(zhì)譜條件見1.3.4節(jié)。4種硝基呋喃代謝衍生物及4種內(nèi)標衍生物的MRM圖如圖5所示。

采用0.1%甲酸水溶液-乙腈作為流動相，進行色譜條件優(yōu)化，改變流動相的洗脫梯度，比較各目標物在不同洗脫梯度條件下的分離度，發(fā)現(xiàn)在1.3.3節(jié)梯度條件下，8種目標化合物離子對的分離度、響應強度及色譜峰形均較好。另外，本研究中采用的色譜柱粒徑為2.2 μm，分別設置流速0.2、0.3、0.4 mL/min，比較考察色譜圖，并結(jié)合出峰時間和系統(tǒng)壓力綜合分析，發(fā)現(xiàn)流速為0.4 mL/min時峰形尖銳，且出峰時間在10 min內(nèi)，因此選擇0.4 mL/min流速進行試驗。

圖5 4種硝基呋喃代謝物及4種內(nèi)標物質(zhì)的定量離子色譜圖Fig.5 Chromatograms of four nitrofuran metabolites and four internal standards in MRM mode

表2 4種硝基呋喃代謝物的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限Table 2 Linear ranges, linear equations, correlation coefficients (R2) and limits of detection (LODs) of the four nitrofuran metabolites

2.5 定性定量離子對選擇

圖6 樣品中SEM 定性定量離子對Fig.6 Qualitative and quantitative ion pairs of SEM in samples

質(zhì)譜分析中主要通過對樣品離子質(zhì)荷比的分析而實現(xiàn)對樣品的定性和定量分析。表1質(zhì)譜參數(shù)顯示，4種硝基呋喃類代謝物均選擇了兩對子離子，一般情況下將靈敏度高的子離子做為定量離子，靈敏度低的子離子做為定性離子，本研究中除SEM外，其他化合物定性定量離子對選擇均遵循此規(guī)律，詳見表1，但在實際樣品分析中，SEM的209.0/166.0離子對響應高于209.0/192.0離子對，但209.0/166.0離子對在低濃度下存在樣品雜質(zhì)干擾，見圖6，從而導致定量不準確，而209.0/192.0離子對無干擾，因此選擇209.0/192.0離子對作為SEM的定量離子對。

2.6 方法學驗證

2.6.1 線性與檢出限

配制混合標準系列工作溶液，加入混合內(nèi)標溶液，采用1.3.2節(jié)樣品前處理方法進行處理，得到衍生后的標準溶液，按1.3.3節(jié)色譜條件和1.3.4節(jié)質(zhì)譜條件，進樣分析，以目標化合物的質(zhì)量濃度（ng/mL）為橫軸（x），相應的定量離子的峰面積與內(nèi)標峰面積的比值為縱軸（y），繪制標準曲線，得到線性回歸方程，結(jié)果見表2，采用空白樣品加標試驗確定檢出限，根據(jù)3倍信噪比進行計算，得到檢出限結(jié)果見表2。

2.6.2 回收率和精密度

表3 4種硝基呋喃代謝物的加標回收率和精密度Table 3 Recoveries and RSDs of four nitrofuran metabolites spiked in samples

在基質(zhì)中分別添加低、中、高3個質(zhì)量濃度的混合標準溶液進行加標回收試驗，每個加標水平重復6次，按照優(yōu)化后的方法進行處理并檢測，得到結(jié)果見表3，4種硝基呋喃代謝物的平均回收率為93.3%～104.9%，相對標準偏差＜10%，表明該方法的準確性和重復性良好，可以滿足克氏原鰲蝦樣品中硝基呋喃代謝物測定的分析要求。

2.7 實際樣品測定以及與國標方法比較

采用所建立的方法，對采集的20批次克氏原鰲蝦樣品進行檢測，并對檢出陽性的樣品采用國標方法進行結(jié)果比對，見表4，結(jié)果表明采用超聲波輔助衍生的方法所測得的樣品結(jié)果與國標方法所檢測結(jié)果基本保持一致，超聲波輔助衍生法能顯著縮短樣品處理時間，提高檢測效率，在實際應用中具有一定的優(yōu)勢。

表4 陽性樣品檢測結(jié)果對比Table 4 Comparison of detection results of positive samples(n=2)

3 結(jié)論

本試驗對克氏原鰲蝦樣品中的硝基呋喃類代謝物的檢測方法進行研究，優(yōu)化了衍生方式，以超聲波輔助衍生代替國家標準中的恒溫水浴振蕩衍生，優(yōu)化后的方法可加快樣品中目標化合物的水解速率和衍生反應速率，該方法操作簡單、重現(xiàn)性好、準確度高，適合于克氏原鰲蝦樣品中硝基呋喃類藥物代謝物的快速測定。但由于目前的研究發(fā)現(xiàn)甲殼類水產(chǎn)品中存在非呋喃西林來源的氨基脲成分，導致食品安全監(jiān)管部門在進行甲殼類水產(chǎn)品是否違法使用硝基呋喃藥物的行為判定上存在爭議，今后可開展研究，尋找硝基呋喃類藥物代謝的特征性標志物，以實現(xiàn)對樣品的科學判定。