HS-SPME-GC-MS分析山楂及其制品的揮發(fā)性成分

劉天琪，江漢美，李書帆

（湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖北省藥用植物研發(fā)中心，湖北武漢 430065）

山楂為薔薇科植物山里紅（Crataegus pinnatifidaBgevar majorNE Br.）或山楂（Crataegus pinnatifidaBge.）的干燥成熟果實(shí)，始載于唐代的《新修本草》，具有消食健胃、行氣散瘀、化濁降脂之功效，臨床用于肉食積滯、胃脘脹滿、瘀血經(jīng)閉、心腹刺痛、胸痹心痛、高脂血等證?，F(xiàn)代研究表明，山楂含有大量的有機(jī)酸、黃酮、三萜類化合物及多種微量元素，主要具有調(diào)節(jié)血脂、保肝、降壓、助消化、強(qiáng)心、抗氧化、抗腫瘤、抗菌等作用[1,2]。2015版藥典收載山楂的炮制品，為炒山楂和焦山楂[3]，山楂經(jīng)炮制后，其化學(xué)成分和含量發(fā)生了變化，從而改變了山楂性味和療效[4]，其中揮發(fā)性成分就是山楂中一類重要的化學(xué)成分，也是有效成分之一，在臨床上具有一定的藥理作用。固相微萃?。⊿PME）技術(shù)作為一項(xiàng)新穎的樣品前處理與富集技術(shù)，適合易揮發(fā)性化合物的檢出，且具有操作簡單、攜帶方便、操作費(fèi)用低廉等優(yōu)點(diǎn)，是最常用的樣品前處理方法之一[5]。主成分分析法（PCA）已普遍應(yīng)用于中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析中，通過對(duì)數(shù)據(jù)降維、變量提取與壓縮、確定中藥資源的分類和聚類，并從中獲取能用于中藥分析鑒別的有用信息[6]。目前國內(nèi)已發(fā)表關(guān)于山楂果肉揮發(fā)性成分分析的文獻(xiàn)，其中對(duì)揮發(fā)性成分貢獻(xiàn)最大的為酯類[7]，但在國內(nèi)外文獻(xiàn)中還沒有運(yùn)用HS-SPMEGC-MS對(duì)山楂及其制品的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析及對(duì)比的有關(guān)研究報(bào)道，故這次研究是第一次使用HS-SPME-GC-MS對(duì)山楂及其制品的揮發(fā)性成分來進(jìn)行分析以及比較，討論炮制對(duì)于山楂的揮發(fā)性成分的影響，旨在從揮發(fā)性成分的角度為臨床合理用藥提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料

1.1.1 藥材

山楂藥材（批號(hào)：20200913）購于國藥控股湖北有限公司，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室楊紅兵教授鑒定為薔薇科植物山楂（Crataegus pinnatifida Bge.）的干燥成熟果實(shí)。

1.1.2 山楂炮制品的制備

參照2015年版《中國藥典》（四部）炮制通則中的炮制方法：取凈山楂30 g，照清炒法炒至色變深，為炒山楂；取凈山楂30 g，照清炒法炒至表面焦褐色，內(nèi)部黃褐色，為焦山楂。

1.2 儀器

手動(dòng)固相微萃?。⊿PME）進(jìn)樣裝置，德國IKA公司；Agilent6890/5973型氣相-質(zhì)譜-計(jì)算機(jī)聯(lián)用儀，美國Hewlett-Packard公司；頂空瓶（15 mL）；65 μm聚二甲基硅氧烷-二乙烯基苯（PDMS/DVB）萃取纖維頭，美國Supelco公司；ALC-210.2型電子天平（d=0.01 g），北京賽多利斯天平有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 頂空固相微萃取條件

取山楂樣品0.40 g，置于15 mL頂空瓶中，插入裝有65 μm PDMS/DVB萃取纖維頭的手動(dòng)進(jìn)樣器，在80 ℃下平衡10 min后，再壓縮手柄伸出萃取頭萃取30 min，取出，立即插入氣相色譜儀進(jìn)樣口（溫度230 ℃）解析3 min。山楂炮制品實(shí)驗(yàn)條件同上。

1.3.2 GC-MS色譜與質(zhì)譜條件

GC條件：色譜條件HP-5MS石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：從50 ℃開始，以10 ℃/min升溫至230 ℃；載氣：高純度He（99.99%），柱流速：0.80 mL/min，進(jìn)樣口溫度：230 ℃；不分流進(jìn)樣。

MS條件：EI源；離子源溫度230 ℃，電離電壓70 eV；四級(jí)桿溫度150 ℃；掃描質(zhì)量范圍35～550m/z。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

采用峰面積歸一化法計(jì)算各組分的相對(duì)百分含量，并通過NIST08質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫對(duì)所出峰的質(zhì)譜圖進(jìn)行檢索，以鑒定各組分。通過SPSS 21.0軟件對(duì)山楂及其制品的揮發(fā)性成分及其含量進(jìn)行PCA。

2 結(jié)果與討論

2.1 山楂及其制品的揮發(fā)性成分分析

依照上述條件對(duì)山楂及其制品的揮發(fā)性成分進(jìn)行GC-MS分析，分別得到總離子流圖（見圖1、圖2、圖3）。分析可知，在山楂中鑒定出了29種成分，占揮發(fā)性成分總量的98.35%，其中主要為烯類化合物，占山楂總揮發(fā)性成分的88.05%。在山楂中占揮發(fā)性成分含量最高的為檸檬烯，占揮發(fā)性成分的52.63%，其次主要為γ-萜品烯（26.68%）、月桂烯（1.80%）、β-蒎烯（1.30%）等；在炒山楂中鑒定出了33種成分，占揮發(fā)性成分總量的97.15%，其中主要為烯類化合物，占炒山楂總揮發(fā)性成分的63.71%。炒山楂中揮發(fā)性成分含量最高的檸檬烯，占揮發(fā)性成分36.40%，其次主要為γ-萜品烯（23.10%）、桉葉油醇（7.60%）、4-萜烯醇（0.60%）等；在焦山楂中鑒定出了36種成分，占揮發(fā)性成分總量的84.78%，其中主要為醛類化合物，占焦山楂總揮發(fā)性成分的41.05%。焦山楂中揮發(fā)性成分含量最高的為糠酸甲酯，占揮發(fā)性成分15.13%，其次主要為5-羥甲基糠醛3-糠醛（14.95%）、5-甲基-5-己烯-2-酮（7.75%）、丁香酚（1.13%）等。具體信息見表1。

表1 山楂及其制品的揮發(fā)性成分Table 1 Volatile components of hawthorn and its processed products

注： “ - ” 表示成分不存在。

圖1 生山楂揮發(fā)性成分總離子流圖Fig.1 Total ion current diagram of volatile components in raw hawthorn

圖2 炒山楂揮發(fā)性成分總離子流圖Fig.2 Total ion current diagram of volatile components in fried hawthorn

圖3 焦山楂揮發(fā)性成分總離子流圖Fig.3 Total ion current diagram of volatile components in Hawthorn

2.2 山楂及其炮制品揮發(fā)性成分種類和相對(duì)質(zhì)量分析

從表2中可以看到山楂及其制品中揮發(fā)性成分主要是烯類、醛酮類、醇類。三者的共有揮發(fā)性成分有5種，分別為γ-萜品烯、壬醛、4-萜烯醇、癸醛、十二甲基環(huán)六硅氧烷，共有成分分別占山楂、炒山楂和焦山楂揮發(fā)性成分總量的29.50%、26.12%、3.73%。說明生品與炮制品的主要揮發(fā)性成分含量和種類具有較大的差異。山楂生品中，烯類化合物占山楂揮發(fā)性成分的86.21%，醛類化合物占2.06%，經(jīng)炮制后，炒山楂中烯類成分占揮發(fā)性成分的62.78%，醛類化合物占6.02%，焦山楂中烯類成分占揮發(fā)性成分的1.71%，醛類化合物占41.19%，這可能是由于烯類成分經(jīng)過氧化反應(yīng)轉(zhuǎn)變成醛類成分造成的。而在新鮮山楂中，酯類種類最多、相對(duì)含量達(dá)到78.41%，結(jié)合它們的香氣特征可知它們賦予了新鮮山楂果肉的特征香氣[7]，說明新鮮山楂與藥材山楂的揮發(fā)性成分已有所不同。

表2 山楂及其炮制品揮發(fā)性成分種類和相對(duì)質(zhì)量分析Table 2 Variety and relative quality analysis of volatile components in hawthorn and its processed products

2.3 山楂及其制品揮發(fā)性成分主成分分析

表3 主成分的特征值及其貢獻(xiàn)率Table 3 The eigenvalues of the principal components and their contribution rate

表4 山楂及其炮制品揮發(fā)性成分主成分得分和綜合得分Table 4 Principal component scores and comprehensive scores of volatile components of hawthorn and its processed products

由表1可見，3種劑型的揮發(fā)性成分含量數(shù)據(jù)離散，通過SPSS 21.0軟件對(duì)山楂及其炮制品的72種揮發(fā)性成分及其含量進(jìn)行PCA，得特征值和貢獻(xiàn)率見表3。由表3可得，第1主成分的貢獻(xiàn)率為43.752%，第2主成分的貢獻(xiàn)率為33.352%，2個(gè)主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到77.11%，能反映樣品的整體信息，故取這2個(gè)主成分作為數(shù)據(jù)分析的有效成分。各特征向量揮發(fā)性成分相對(duì)含量數(shù)據(jù)再通過SPSS 21.0軟件標(biāo)準(zhǔn)化后，各主成分得分見表4。由表4可知，主成分綜合評(píng)價(jià)中，生品和炮制品揮發(fā)性成分之間的PCA綜合評(píng)分具有較大差異，生山楂和炒山楂揮發(fā)性成分的綜合得分較高，其次為焦山楂。

2.4 山楂及其制品臨床應(yīng)用分析

山楂中的檸檬烯具有明顯的促胃腸動(dòng)力作用[8]，其在生品中的含量為52.63%，炒制中為36.40%，焦制中沒有，說明在胃腸推進(jìn)作用上，推進(jìn)進(jìn)度最大的就是生山楂，所以臨床上具有消積化滯作用的山楂丸、山楂內(nèi)消丸、小兒消食健胃丸、肥兒丸等中成藥處方中，均使用凈山楂，用以增強(qiáng)藥物消食能力[9]。但檸檬烯有一定的刺激性副作用[10]，經(jīng)炮制后，檸檬烯含量減少，較之生品藥性緩和，減少了對(duì)脾胃的刺激，臨床多用于消肉食積滯。同時(shí)炒山楂中的桉葉油醇具有抗菌、殺蟲等作用[11]，月桂烯有鎮(zhèn)痛、顯著的抗炎和抗分解代謝作用[12]，增強(qiáng)了山楂的藥理活性。焦山楂中的丁香酚具有抗菌作用和一定的健胃作用[13]，因此臨床上多用焦山楂治療伴有食積的瀉痢，但因焦山楂消食作用不如生山楂，藥理活性不如炒山楂，所以臨床使用的山楂飲片多為生山楂和炒山楂。

3 結(jié)論

通過PCA結(jié)果可知，生山楂和炒山楂揮發(fā)性成分的綜合得分較高，其次為焦山楂；通過揮發(fā)性成分的角度來看，生山楂和炒山楂的藥理活性更豐富；就山楂的炮制品來看，炒山楂的藥用價(jià)值較大。本研究首次采用HS-SPME-GCMS技術(shù)和PCA對(duì)山楂及其炮制品的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析鑒定，為山楂的臨床應(yīng)用提供了一定的科學(xué)依據(jù)，為中醫(yī)藥治療疾病方面做出一點(diǎn)貢獻(xiàn)。