低共熔溶劑提取桂花黃酮的工藝優(yōu)化

都宏霞，繆領珍，2，胡梓恒，嚴忠杰

（1.南京科技職業(yè)學院化學與材料工程學院，江蘇南京 210048）（2.東南大學成賢學院，江蘇南京 210088）

桂花（Osmantus fragrans），又名木犀、巖桂、金粟、九里香等，系木犀科常綠灌木或小喬木，屬珍貴的芳香型鑒賞植物。味辛，可入藥；芳香，可用于食品、化妝品；清雅高潔，香飄四溢，《本草綱目》中早有記載，在我國廣泛種植，深受人們喜愛。桂花中含有黃酮、多糖、多酚、精油等多種生物活性成分及抗氧化、降血脂、抗衰老、護肝、抑菌等多種活性功效[1-11]。研究表明，作為主要活性成分的桂花黃酮（Flavonoids ofOsmanthus fragrans，F(xiàn)OFs）具有抗氧化、抗炎、提高機體免疫力多種活性功能。目前，針對FOFs的提取方法主要是回流、酶提、微波、超聲波，但溶劑都采用傳統(tǒng)的有機溶劑，對環(huán)境十分不友好[3-5]。因此，探索一種綠色、高效的新提取技術十分必要。

低共熔溶劑(Deep Eutectic Solvents，DESs)由Abbott等人于2003年首次合成的一類綠色新型溶劑[12]，一般通過兩類化合物，即氫鍵受體（hydrogen-bond acceptor，HBA）和氫鍵供體（hydrogen-bond donor，HBD），通過氫鍵作用而合成，所制成的低共熔溶劑熔點低于其任一組分的熔點，且具有高熱穩(wěn)定性。與傳統(tǒng)溶劑相比，具有綠色、低成本、低毒、低揮發(fā)、高密度、高極性、高表面張力等優(yōu)良特點，同時，易于制備、易于存儲、生物可降解、可回收，是傳統(tǒng)溶劑和離子液體的良好替代品，已受到極大關注，并在天然產(chǎn)物活性成分提取方面證實了明顯的優(yōu)勢和巨大潛力[13,14]。

本文設計并制備6種低共熔溶劑，首次用于FOFs的提取，并在比較了醇提、凍融、超聲波和微波提取四種技術，在單因素研究的基礎上，結合響應面法探索FOFs的最佳提取工藝，旨在為進一步開發(fā)桂花資源和拓展低共熔溶劑在天然產(chǎn)物綠色提取方面提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桂花，北京同仁堂藥店；蘆丁標準樣品，北京恒元啟天化工技術研究所；氯化膽堿，Aladdin公司；三氯化鋁、乙醇、醋酸鉀、三乙醇胺、1,3-丁二醇、1,2-丙二醇、蔗糖、山梨醇均為分析純。

1.2 儀器與設備

ME204E-02型電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；FS-250N型超聲波提取儀，上海生析超聲儀器有限公司；TDL-50B型低速臺式離心機，上海安亭科學儀器廠；7600型紫外分光光度計，上海菁華科學儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標準曲線繪制[15,16]

準確稱取蘆丁標準品5.0 mg，用濃度為50%的乙醇定容至25.0 mL。準確稱取蘆丁標準品（0.2 mg/mL）0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于6只比色管中，分別用5.0 mL的50%乙醇，3.0 mL的0.1 M AlCl3溶液和5.0 mL的1 M醋酸鉀溶液，搖勻，同法制成空白對照：靜置反應40 min，充分接觸混合，通過紫外分光光度計在波長415 nm處檢測其吸光度值，建立蘆丁標準曲線，測定FOFs的含量。

1.3.2 提取技術比較研究

準確稱取桂花花粉10 g，通過凍融（Freeze Thawing，F(xiàn)T）、醇提（Ethanol Extraction，ET）[17,18]、超聲波提?。║ltrasonic Extraction，UA）[19-21]、微波提取[22-24]（Microwave Extraction，MA）四種技術來提取FOFs，提取條件詳見表1，將提取液以轉速4000 r/min的速度離心10 min，取上層清液，過0.45 μm濾膜，使用預處理后的D101大孔樹脂上樣，吸附平衡后，用純水、質(zhì)量濃度為30%、50%、70%、90%的乙醇溶液依次洗脫，每個濃度均洗脫3柱體積(BV)，流速為1 BV/h，收集90%乙醇濃度的洗脫液，于45 ℃旋轉蒸發(fā)進行濃縮后，再用50%的乙醇溶液進行稀釋[25]得到FOFs，根據(jù)1.3.1所述方法測其吸光度，計算得出FOFs含量。

表1 提取條件表Table 1 Factors of different technology

表2 不同類型的低共熔溶劑Table 2 Different types of DESs

1.3.3 DESs的合成

參考Abbott的方法[26]，設計了6組DESs（見表2），選擇氯化膽堿作為氫鍵受體，分別與不同的氫鍵供體按一定摩爾比，在85 ℃水浴條件下加熱攪拌，直至溶液澄清，冷卻至室溫，分別得到DES1-6，備用。

1.3.4 FOFs的提取

精確稱取桂花花粉10 g，通過超聲波輔助DES1-6，在超聲波150 W、液料比20:1、時間10 min的條件下分別提取FOFs。

1.3.5 FOFs提取量的測定

式中：Y為FOFs提取量，mg/g；c為試樣的測定質(zhì)量濃度，mg/mL；V為濾液體積，mL；D為稀釋倍數(shù)；m為原料質(zhì)量，g。

1.3.6 超聲波輔助DES-4提取FOFs的單因素實驗

1.3.6.1 液料比對FOFs提取量的影響

在含水量60 mol，超聲時間10 min，超聲功率150 W，氯化膽堿:山梨醇:1,2-丙二醇=1:1:1的條件下，分別取液料比20:1、30:1、40:1、50:1、60:1，研究液料比對FOFs提取量的影響。

1.3.6.2 摩爾比對FOFs提取量的影響

在液料比50:1，含水量60 mol，超聲時間10 min，超聲功率150 W的條件下，取氯化膽堿:山梨醇:1,2-丙二醇的摩爾比為1:1:1、1:1:2、1:1:3、1:1:4、2:1:4、3:1:4作為變量，研究摩爾比對FOFs提取量的影響。

1.3.6.3 含水量對FOFs提取量的影響

在液料比50:1，超聲時間10 min，超聲功率150 W，氯化膽堿:山梨醇:1,2-丙二醇的摩爾比為2:1:4的條件下，分別取含水量40、50、60、70、80 mol作為變量，研究含水量對FOFs提取量的影響。

1.3.6.4 超聲功率對FOFs提取量的影響

在液料比50:1，超聲時間10 min，含水量60 mol，氯化膽堿:山梨醇:1,2-丙二醇的摩爾比為2:1:4的條件下，分別取超聲功率30、60、90、120、150 W作為變量，比較超聲功率對FOFs提取量的影響。

1.3.6.5 超聲時間對FOFs提取量的影響

在液料比50:1，含水量60 mol，氯化膽堿:山梨醇:1,2-丙二醇的摩爾比為2:1:4，超聲功率150 W的條件下，分別取超聲時間5、10、15、20、25 min作為變量，比較超聲時間對FOFs提取量的影響。

1.3.7 響應面法優(yōu)化FOFs最優(yōu)提取工藝條件

使用Design-Expert.V 8.0.6軟件中Box-Behnken組合設計來探索FOFs最優(yōu)工藝[27-30]，在單因素實驗基礎上，選擇含水量、液料比和時間作為3因素，每個因素選擇三個對FOFs提取量影響較大的水平，進行3因素3水平的響應面試驗，并以提取量作為響應值，各因素的三個水平分別采取-1、0、1作為編碼，如表3。

表3 響應面試驗分析因素水平表Table 3 Factors and levels of response surface methodology

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Origin 8和Design-Expert.V 8.0.6進行數(shù)據(jù)處理、圖表制作及數(shù)據(jù)分析。

2 結果與分析

2.1 蘆丁標準曲線的結果分析

經(jīng)標準曲線測定及分析，得回歸方程Y=32.87X+0.14，其系數(shù)R2=0.9998，在測定范圍內(nèi)線性關系良好。

圖1 蘆丁標準曲線Fig.1 Standard curve of Rutin

2.2 FOFs提取技術比較分析

通過凍融（FT）、醇提（ET）、超聲波(UA)、微波(MA)四種技術提取FOFs，如圖2所示，數(shù)據(jù)表明：超聲波提取>微波提取>乙醇提取>凍融提取，最佳技術為超聲波提取，提取量為1.65 mg/g。因此，采用超聲波輔助進行FOFs提取和進一步優(yōu)化分析。

圖2 FOFs提取技術的比較Fig.2 Comparison of different technology for extraction of FOFs

2.3 DESs的篩選

圖3 DESs的篩選Fig.3 Comparison of different DESs

設計并制備了6種DESs提取FOFs，數(shù)據(jù)表明：低共熔溶劑的提取FOFs的效果整體優(yōu)于凍融、醇提、超聲波和微波提取技術，其中DES-4，即以氯化膽堿和山梨醇和1,2-丙二醇所構成的三元體系提取效果最好，F(xiàn)OFs提取量為2.33 mg/g，結果見圖3。為了得到FOFs提取的最佳工藝條件，本研究以超聲波輔助-DES-4（UA-DES-4）進行進一步研究。

2.4 單因素實驗

2.4.1 液料比對FOFs提取量的影響

圖4 液料比對FOFs提取量的影響Fig.4 Effect of liquid-material ratio on extraction yield of FOFs

如圖4所示：當液料比在20:1到50:1區(qū)間，F(xiàn)OFs提取量呈上升趨勢，之后趨于平穩(wěn)。其中在50:1時，提取量最高，為4.72 mg/g。主要原因是增加提取溶劑的體積可以增加溶劑與溶質(zhì)之間的接觸面積，使溶解度升高，促進黃酮成分的溢出，當溶解度大到一定程度時，會發(fā)生飽和的現(xiàn)象，導致部分黃酮無法溶解，提取量降低。

2.4.2 摩爾比對FOFs提取量的影響

圖5 摩爾比對FOFs提取量的影響Fig.5 Effect of molar ration on extraction yield of FOFs

結果如圖5所示：FOFs提取量隨著DES-4體系中氯化膽堿和1,2-丙二醇摩爾比的增加而增加，當摩爾比為2:1:4時，提取量最高，為6.19 mg/g。主要原因是1,2-丙二醇摩爾比的增加有效的調(diào)節(jié)了DES-4體系的粘度及表面張力，促進了黃酮物質(zhì)的擴散，提高了提取量，而氯化膽堿的比例低會弱化黃酮物質(zhì)與溶劑的相互作用。當摩爾比為2:1:4時，剛好達到最佳效果[31]。

2.4.3 含水量對FOFs提取量的影響

圖6 含水量對FOFs提取量的影響Fig.6 Effect of water content on extraction yield of FOFs

DESs的含水量是影響提取效果的重要因素，本研究考察了含水量40~80 mol對FOFs提取量的影響，結果如圖6所示：含水量從40到60 mol時，F(xiàn)OFs的提取量逐漸上升，含水量為60 mol時，提取量最高，為6.29 mg/g，含水量從60~80 mol時，提取量降低。主要原因隨著水含量的增加，可以明顯降低DES的粘度，同時調(diào)節(jié)體系極性，有益于黃酮成分的溢出，增加提取量，但當含水量超過60 mol后，隨著極性的增加，會引起分子間氫鍵的斷裂，影響提取效果[32]。

2.4.4 超聲功率對FOFs提取量的影響

圖7 超聲功率對FOFs提取量的影響Fig.7 Effect of ultrasonic power on extraction yield of FOFs

結果如圖7所示：FOFs的提取量隨著超聲波功率的提高而逐漸上升，當功率為150 W時，提取量最高，為6.29 mg/g[20]。因為超聲波會促進黃酮物質(zhì)在溶劑中的分散與滲透，增大接觸面積，促使黃酮物質(zhì)的釋放。因此最佳超聲功率為150 W。

2.4.5 超聲時間對FOFs提取量的影響

結果如圖8所示：在5~15 min時FOFs提取量呈上升趨勢，之后有所下降，最佳超聲時間是15 min，此時提取量為6.30 mg/g。這是因為時間越長，超聲波產(chǎn)生的能量就越大，在溶液中所形成的空化效應就越強，對桂花細胞壁的破壞程度就越強，提取量就越高。但是，隨著超聲波作用時間的延長，溫度也會增加，體系同時處于超聲輻射和熱效應的作用之下，可能會產(chǎn)生雙重降解[33]，并且長時間的提取黃酮物質(zhì)內(nèi)部化學結構會發(fā)生改變，DES與樣品的相互作用變得不穩(wěn)定，影響提取效果[34]。

圖8 超聲時間對FOFs提取量的影響Fig.8 Effect of extraction time on extraction yield of FOFs

2.5 響應面試驗結果與優(yōu)化分析

2.5.1 響應模型的建立與分析

基于單因素試驗結果，選取含水量(A)、液料比(B)和超聲時間(C)三個主要因素為自變量，以FOFs提取量為響應值(Y)，采用Design-expert軟件按照Box-Behnken實驗設計了15組實驗，12組為析因點實驗，3組為重復零點實驗，進行交叉設計實驗，結果見表4，方差與誤差統(tǒng)計分析見表5。

利用Design-Expert軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，得到二次多項回歸方程：

R=8.67+0.059A+1.74B+0.16C+0.80AB+0.020AC+0.22BC-1.97A2-0.98B2-1.38C2

其中R為提取量，A、B和C分別為對應含水量、液料比和超聲時間的編碼。

由表5的數(shù)據(jù)可知：模型的p值為0.0037，模型極顯著（p<0.01）；失擬項p值為0.0712，結果不顯著（p>0.05），表明擬合狀況良好。方程決定系數(shù)R2=0.9659，CV為9.27%<10%，能真實的反映本模型，可用此模型分析響應面的變化。信噪比（Adeq Precision）為11.286大于4，表示模型合理。

由方差F值可知，各因素對提取量影響為：B（料液比）>C（超聲時間）>A（含水量）。由表5還得知，因素中B、A2、C2的影響極顯著（p<0.01），因素AB、B2的影響顯著（p<0.05），而A、C、AC、BC的影響不顯著，表明該方程可適用。

表4 響應面分析實驗設計與結果Table 4 Design and results of the response surface methodology (RSM) and Box-Behnken

表5 提取量響應面擬合回歸方程的方差分析結果Table 5 ANOVA results of extraction rate response surface fitting regression equation

2.5.2 響應面交互作用分析與優(yōu)化

各因素間交互作用得到響應面曲線圖。圖9~圖11分別顯示含水量、料液比、超聲時間的交互作用對FOFs提取量的影響結果。曲線走勢越陡，表明該因素影響越顯著；曲線走勢越平滑，則表明該因素影響較小[32-34]。圖9中，隨著含水量的增加，F(xiàn)OFs提取量呈現(xiàn)出先升后降的趨勢，影響顯著，含水量在62 mol時達到最高點。圖10中，提取量隨著液料比的增加，影響十分顯著，在液料比為60:1（mL/g）左右時出現(xiàn)最大值，之后逐漸降低；圖11中，隨著超聲時間的增加，F(xiàn)OFs提取量逐漸上升，在16 min左右時達到最大，之后緩慢降低。

2.5.3 驗證試驗

根據(jù)Design-Expert軟件得出在含水量、超聲時間和料液比交互作用影響下，最優(yōu)提取工藝為：液料比為59.90:1，含水量為62.17 mol，超聲時間為15.69 min，在此條件下模型預測的提取率為9.55 mg/g。

結合實驗室具體情況，修正實際提取條件為液料比60:1 (mL/g)，超聲波功率150 W，含水量62 mol，摩爾比2:1:4，超聲時間16 min，所得FOFs提取量為10.06 mg/g，與預測值相差0.51 mg/g，說明模型與實際數(shù)據(jù)擬合較好，證實根據(jù)此模型優(yōu)化的工藝條件可靠。

圖9 含水量與超聲時間交互作用對提取量的影響Fig.9 Response Surface of Y=f(A,C)

圖10 含水量與液料比交互作用對提取量的影響Fig.10 Response Surface of Y=f(A,B)

圖11 超聲時間與液料比交互作用對提取量的影響Fig.11 Response Surface of Y=f(B,C)

3 結論

本文結合超聲波輔助低共熔溶劑提取，建立了一種高效、環(huán)保的FOFs提取工藝。通過設計并制備6種低共熔溶劑用于提取FOFs，并使用傳統(tǒng)的醇提、凍融、超聲波及微波技術進行提取，證實低共熔溶劑的提取效果整體優(yōu)于其他技術。其中，三元DES體系氯化膽堿/山梨醇/1,2-丙二醇的效果最好。因此，選用此體系，在單因素的基礎上，結合響應面優(yōu)化實驗和實驗室實際條件，得到FOFs提取最佳工藝是：氯化膽堿:山梨醇:1,2-丙二醇=2:1:4，含水量62 mol，液料比60:1 (mL/g)，超聲波功率150 W，超聲時間16 min，在此條件下，F(xiàn)OFs的提取量達到10.06 mg/g；FOFs提取量比傳統(tǒng)的醇提提高了8.93 mg/g，相當于其890%，同時，提取效果也優(yōu)于文獻報道[4]中采用微波-超聲聯(lián)合輔助提取最優(yōu)工藝得到的7.86 mg/g，說明超聲波輔助低共熔溶劑提取FOFs的高效性。本工藝綠色、高效、環(huán)保，為天然植物活性成分綠色提取和桂花的深度開發(fā)提供了數(shù)據(jù)支撐。