馮曉文,趙曉涵,潘驍琦,王卓然,谷瑞增,劉文穎
(1.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司,北京市蛋白功能肽工程技術研究中心,北京 100015)(2.北京城市學院生物醫(yī)藥學部,北京 100094)(3.北京農(nóng)學院食品科學與工程學院,北京 102206)
三文魚因其英文Salmon音似三文而得名,也叫鮭魚、大馬哈魚或大麻哈魚,主要產(chǎn)于北冰洋、大西洋與太平洋的交界水域,如加拿大、挪威、日本和美國等國家。三文魚肉質(zhì)鮮美,口感好,富含n-3系列不飽和脂肪酸、人腦神經(jīng)和視覺神經(jīng)中主要的脂質(zhì)成分二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)等生物活性物質(zhì),還富含VA、VB1、VB2、VB12和VD,不僅能降低血液中的膽固醇含量,有效防治心、腦血管疾病及減輕因風濕、牛皮癬等疾病帶來的痛苦,還可預防慢性疾病、糖尿病和某些類似的疾病,且多吃三文魚有助于保持腸道健康,降低結(jié)腸炎等腸道疾病風險,被譽為 “ 魚中至尊 ” , “ 水中珍品 ” , “ 冰海之皇 ”[1,2]。
隨著人民生活水平的顯著提高,對海產(chǎn)品的消費需求日趨增長。三文魚肉色為紅色或鮮橘紅色,以其獨特的口味、豐富的營養(yǎng),在消費者食物中所占比例不斷增長。目前,國內(nèi)對三文魚肉的研究報道主要是對其營養(yǎng)價值的闡述,對于三文魚酶解物海洋魚蛋白低聚肽的研究鮮有報道。本中心使用酶解法酶解三文魚肉制得海洋魚蛋白低聚肽,通過體外模擬人體胃腸消化系統(tǒng),以分子量分布測定法、紫外全波長掃描法及圓二色光譜掃描法表征海洋魚蛋白低聚肽消化前后結(jié)構(gòu)方面的變化,以DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力、鐵離子還原能力(FRAP)、氧自由基吸收能力(ORAC)4個抗氧化指標揭示海洋魚蛋白低聚肽消化前后抗氧化活性的變化。
通過探索海洋魚蛋白低聚肽結(jié)構(gòu)和抗氧化活性的消化穩(wěn)定性,以期為三文魚肉在抗氧化領域高附加值產(chǎn)品的多元化開發(fā)提供理論基礎。
三文魚肉,北京中食海氏生物技術有限公司提供;堿性蛋白酶(20000 U/g)、中性蛋白酶(200000 U/g),諾維信公司;無水乙醇、氫氧化鈉、濃鹽酸、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、過硫酸鉀、醋酸鈉,北京化學試劑公司;胃蛋白酶,美國Sigma公司;胰蛋白酶,美國Solarbio公司;2,2-二苯基-1-苦味肼基自由基(DPPH)、偶氮二異丁脒鹽酸鹽(AAPH)、Fluorescein(熒光指示劑)、Trolox(水溶性維生素E),色譜純,美國Sigma公司;2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS),分析純,南京森貝伽生物科技有限公司;2,4,6-三吡啶基-1,3,5-三嗪(TPTZ),酷爾化學科技(北京)有限公司;三氯化鐵、硫酸亞鐵,廣東汕頭市西隴化工有限公司。
YG30型噴霧干燥機,無錫市陽光干燥設備廠;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋,普瑞斯機械有限公司;FE20K型pH計,瑞士梅特勒-托利多公司;KQ-250E超聲波振蕩器,昆山市超聲儀器有限公司;J-810圓二色譜儀,美國Jasco公司;Spectra MR多功能酶標儀,美國Dynex公司;SpectraMax i3x多功能酶標儀,美國MD公司;LC-20AD型高效液相色譜儀,日本島津公司;UV-1780紫外可見分光光度計,日本SHIMADZU公司。
1.2.1 海洋魚蛋白低聚肽的制備
解凍三文魚肉,稱取50 g于1 L的超純水中,90 ℃水浴加熱10 min,降溫至55 ℃后,用2 mol/L NaOH或HCl調(diào)節(jié)pH值為8.50,按每克蛋白質(zhì)3000單位的酶量的用量加入堿性蛋白酶,酶解3 h;調(diào)節(jié)溶液pH值為7,溫度為45 ℃,按每克蛋白質(zhì)2000單位的酶量加入中性蛋白酶,酶解2 h。酶解完畢,沸水浴滅酶15 min。10000 r/min離心30 min,上清液待用。用截留分子量為1000 u的超濾膜過濾上清液,濾過液經(jīng)噴霧干燥機處理到海洋魚蛋白低聚肽干粉[3]。噴霧干燥機條件為:進料溫度25 ℃,進料速度14 mL/min,進風溫度135 ℃,進風壓力20 kPa。
1.2.2 體外模擬胃腸道消化實驗
1.2.2.1 胃蛋白酶消化實驗
取15 mL 50 g/L的海洋魚蛋白低聚肽溶液,調(diào)節(jié)溶液pH值為2,溫度為37 ℃,然后加入3%(E/S)胃蛋白酶(≥250 units/mg),混勻,消化時間為3 h,100 ℃左右滅酶10 min,得胃蛋白酶消化組樣品溶液。另移取15 mL未消化樣品溶液為對照組樣品[4]。
1.2.2.2 胰蛋白酶消化實驗
取15 mL 50 g/L的海洋魚蛋白低聚肽溶液,調(diào)節(jié)pH值為6.8,溫度為37 ℃,加熱1 min后,加入3%(E/S)胰蛋白酶(≥250 units/mg),混勻,消化時間為3 h,100 ℃左右滅酶10 min,得胰蛋白酶消化組樣品溶液[4]。
1.2.2.3 先胃蛋白酶消化后胰蛋白酶消化實驗
取15 mL 50 g/L的海洋魚蛋白低聚肽溶液,按1.2.2.1消化后,再按1.2.2.2消化,然后100 ℃左右滅酶10 min。得先胃蛋白酶消化后胰蛋白酶消化組樣品溶液[4]。
1.2.3 分子質(zhì)量分布測定
測定條件為:色譜柱:TSKgel G2000 SWXL(300×7.80 mm)凝膠柱;流動相:乙腈、水、三氟乙酸體積比為45:55:0.10;流速:0.50 mL/min;進樣體積:10 μL;柱溫:30 ℃,紫外檢測波長:220 nm。經(jīng)流動相配制1 mg/mL的待測液,經(jīng)孔徑0.20 μm聚四氟乙烯過濾膜過濾,然后進行凝膠過濾,GPC軟件處理數(shù)據(jù)。將肽標準品乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(分子質(zhì)量189 u)、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(分子質(zhì)量451 u)、桿菌酶(分子質(zhì)量1450 u)和細胞色素C(分子質(zhì)量12500 u)分別配制成質(zhì)量分數(shù)0.10%的溶液,過膜后進樣,制作相對分子質(zhì)量校正曲線[5]。
1.2.4 紫外全波長掃描
將不同處理組的海洋魚蛋白低聚肽溶液稀釋到濃度為2 mg/mL,利用紫外可見分光光度計以石英比色皿為容器進行紫外全波長掃描,掃描條件為:掃描波長245~325 nm;狹縫1 mm;采樣間隔0.50 nm;慢速掃描。
1.2.5 圓二色光譜掃描
將不同處理組的海洋魚蛋白低聚肽溶液稀釋到濃度為1 mg/mL,使用圓二色光譜儀以石英比色皿為容器測定其二級結(jié)構(gòu)組成,圓二色光譜條件為:光源采用氙燈;氮氣輸出壓力為0.40 MPa;帶寬1 nm;光譜測量范圍180~260 nm;步進0.5 nm;數(shù)據(jù)點采樣時間為0.25 s。每個樣品采集三次,用CDNN 2.1-Simple Spectra軟件分析四組樣品的圓二色光譜圖。
1.2.6 DPPH自由基清除能力測定
制備1、2、5、10、15 mg/mL的海洋魚蛋白低聚肽溶液,樣品組(Ax):依次加入100 μL 0.10 mmol/L DPPH-無水乙醇溶液和100 μL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液;無水乙醇組(A0):依次加入100 μL無水乙醇和100 μL不同濃度的樣品溶液;對照組(A1):依次加入100 μL 0.10 mmol/L DPPH-無水乙醇溶液和100 μL蒸餾水。混勻,避光反應0.5 h,517 nm處測得吸光值[6,7]。根據(jù)式(1)計算清除率:
1.2.7 ABTS自由基清除能力測定
將7 mmol/L的ABTS儲備液:2.45 mmol/L的過硫酸鉀溶液=1:1(V/V)混勻,25 ℃避光反應12~16 h,得ABTS工作母液。用0.10 mol/L PBS稀釋ABTS母液35倍得ABTS工作液,使其在734 nm處的吸光值為0.70±0.02。標準曲線檢測孔中各加入200 μL的ABTS工作液和10 μL不同質(zhì)量濃度的Trolox標準溶液;樣品檢測孔各加入200 μL的ABTS工作液和1 mg/mL的樣品10 μL,輕輕晃動96孔板片刻,25 ℃靜置5 min,于734 nm處測定OD值。以不同濃度的Trolox溶液為橫坐標,相應的OD值為縱坐標,繪制標準曲線,如圖1所示。根據(jù)標準曲線計算樣品的ABTS自由基清除能力,以mmol Trolox/L表示[8,9]。
圖1 ABTS標準曲線Fig.1 ABTS standard curve
1.2.8 FRAP值測定
圖2 FRAP標準曲線Fi.2 FRAP standard curve
300 mmol/L醋酸鈉緩沖液(pH 3.60):10 mmol/L TPTZ溶液:20 mmol/L FeCl3溶液=10:1:1(V/V/V),混勻,得FRAP工作液。調(diào)節(jié)FRAP工作液溫度為37 ℃??瞻讓φ湛滓来渭尤?80 μL的FRAP工作液和5 μL的PBS;標準檢測孔中各加入180 μL的FRAP工作液和5 μL的不同濃度的FeSO4標準溶液;樣品檢測孔內(nèi)各加入180 μL的FRAP工作液和5 μL 1 mg/mL樣品溶液。搖床晃動96孔板片刻,37 ℃靜置5 min,于593 nm處測定OD值,以不同濃度的FeSO4標準溶液及對應的OD值得到標準曲線,如圖2所示。根據(jù)標準曲線計算樣品的FRAP值[10]。
1.2.9 ORAC值測定
圖3 Trolox標準曲線Fig.3 Trolox standard curve
配置pH=7.40,75 mmol/L PBS、不同濃度的Trolox標準溶液、0.80 μmol/L的Fluorescein(熒光指示劑)及150 mmol/L偶氮類化合物AAPH。取96孔板,依次加入25 μL 1 mg/mL樣品溶液和100 μL的Fluorescein,此為實驗組;25 μL不同濃度的Trolox標準溶液和100 μL的Fluorescein,此為標準曲線組;25 μL PBS和100 μL的Fluorescein,此為空白組。覆蓋一層錫箔紙避光,于37 ℃烘箱反應20 min,最后于上述各孔中迅速加入75 μL 150 mmol/L偶氮類化合物AAPH啟動反應,另外在空白組的基礎上做不加AAPH的對照。設定熒光酶標儀條件為:激發(fā)波長485 nm,發(fā)射波長530 nm,溫度37 ℃,每隔5 min測定一次,每次讀數(shù)前晃勻3~5 s,測定總時間為180 min。以不同濃度的Trolox標準溶液為橫坐標,熒光衰減曲線保護面積為縱坐標繪制標準曲線,如圖3。根據(jù)標準曲線計算待測樣品的ORAC值,結(jié)果表示為μmol Trolox/g[11]。
1.2.10 數(shù)據(jù)處理
每組數(shù)據(jù)均重復3次,實驗結(jié)果以平均值±標準偏差表示,使用Origin 2021軟件作圖。
如表1所示,模擬胃液組與未消化組分子量分布幾乎一致(p>0.05),表明海洋魚蛋白低聚肽具有很強的抗胃蛋白酶消化穩(wěn)定性;而模擬胰液組和先胃液消化后胰液消化組與未消化組相比,分子量大于1000 u的組分均減少,表明海洋魚蛋白低聚肽中大分子肽尤其是3000~5000 u的組分對胰蛋白酶的消化穩(wěn)定性不強;相應的,經(jīng)胰蛋白酶消化以后分子量在150~1000 u的組分有所增加,且分子量150~1000 u組分占總組分的84%以上。張韋唯[12]研究了體外模擬胃腸液消化對發(fā)酵菜粕抗氧化肽的影響,在經(jīng)模擬胃腸液消化處理后發(fā)酵菜粕抗氧化肽小于1000 u的組分所占的比例從72.51%分別上升到75.48%和79.84%,其分子質(zhì)量分布規(guī)律與本實驗一致。
四組海洋魚蛋白低聚肽溶液的紫外掃描圖如圖4所示,由圖可知,四組樣品均在270~280 nm處有一弱吸收峰,且經(jīng)模擬胃腸液處理后,與未消化組相比,其余三組最大吸收峰發(fā)生了一定程度的左移,其中未消化組吸收峰值為0.26,模擬胃液組吸收峰值為0.41;模擬胰液組、先胃后胰組與模擬胃液組相比,紫外吸收值無顯著差異(p>0.05),其原因可能是模擬胃腸液消化海洋魚蛋白低聚肽后,使得溶液中發(fā)色團和助色團如C=O、COOH、NH2的組成比例發(fā)生了變化,從而偏光性發(fā)生了變化[13]。
表1 不同處理的海洋魚蛋白低聚肽的分子質(zhì)量分布Table 1 Molecular weight distributions of MFPO with different treatments
圖4 不同處理的海洋魚蛋白低聚肽的紫外全波長掃描Fig.4 UV full wavelength scanning of MFPO with different treatments
圓二色光譜圖表征蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的組成,不同處理組的圓二色光譜圖結(jié)果如圖5所示,使用CDNN 2.1-Simple Spectra軟件分析樣品圓二色光譜圖得出了不同處理組溶液中二級結(jié)構(gòu)組成,如表2所示。分析可知,胃蛋白酶消化前后,海洋魚蛋白低聚肽二級結(jié)構(gòu)組成未發(fā)生顯著變化(p>0.05),表明了海洋魚蛋白低聚肽的二級結(jié)構(gòu)具有抗胃蛋白酶消化穩(wěn)定性;而經(jīng)模擬胰液消化后,海洋魚蛋白低聚肽中平行式β-折疊和不規(guī)則卷曲所占比例有一定程度的減少,同時α-螺旋和反平行式β-折疊所占比例有所增加,最大增加量為10.93%??傮w表明了海洋魚蛋白低聚肽在結(jié)構(gòu)方面對胃蛋白酶和胰蛋白酶具有較好的抗消化穩(wěn)定性。CD信噪比是根據(jù)蛋白質(zhì)或多肽的旋光性隨溫度或變性的變化而變化,主要是測定蛋白質(zhì)折疊的熱力學和蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。海洋魚蛋白低聚肽經(jīng)模擬胃腸液處理后,部分肽鏈二級結(jié)構(gòu)及穩(wěn)定性發(fā)生改變,從而使得信噪比有差異[14]。
圖5 不同處理的海洋魚蛋白低聚肽的圓二色光譜圖Fig.5 Circular dichroism spectrogram of MFPO with different treatments
表2 不同處理的海洋魚蛋白低聚肽的二級結(jié)構(gòu)Table 2 Secondary structures of MFPO with different treatments
圖6 Vc的DPPH自由基清除活性Fig.6 DPPH free radical scavenging activity of Vc
在抗氧化檢測方法中,DPPH自由基清除率是比較靈敏的方法之一,通過測定樣品清除自由基后吸光度的變化來評測樣品的抗氧化能力。如圖7所示,在1~15 mg/mL濃度范圍內(nèi),不同處理組海洋魚蛋白低聚肽的DPPH自由基清除率呈濃度依賴性增加。其中模擬胃液組DPPH自由基清除率15 mg/mL時最高,為67.86%,半抑制濃度(IC50值)約為4.50 mg/mL,模擬胰液組DPPH自由基清除率整體都比模擬胃液組低。陽性對照抗壞血酸(Vc)的DPPH自由基清除率趨勢與海洋魚蛋白低聚肽類似,呈劑量依賴性增長,半抑制濃度(IC50值)約為0.005 mg/mL,其DPPH自由基清除能力顯著高于海洋魚蛋白低聚肽。本中心前期以三文魚皮為原料制得三文魚皮膠原低聚肽,經(jīng)模擬胃腸液消化以后其DPPH自由基清除率在1~20 mg/mL濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴性,均從10%左右上升到了60%左右,其變化趨勢與海洋魚蛋白低聚肽一致[15]。
圖7 不同處理的海洋魚蛋白低聚肽的DPPH自由基清除活性Fig.7 DPPH free radical scavenging activities of MFPO with different treatments
圖8 Vc的ABTS自由基清除能力Fig.8 ABTS radical scavenging capacity of Vc
圖9 不同處理的海洋魚蛋白低聚肽的ABTS自由基清除能力Fig.9 ABTS radical scavenging capacity of MFPO treated with different treatments
通過酶標儀測定不同濃度的Trolox標準溶液相應的吸光值,得到ABTS標準曲線方程為:y=0.58x+1.15(R2=0.99)?;跇藴是€方程得出四組海洋魚蛋白低聚肽ABTS自由基清除能力,結(jié)果如圖9所示,與未消化組相比,其余三組ABTS自由基清除能力均有一定程度的增加,與陽性對照組0.3 mg/mL的Vc清除率相當,但均無顯著影響(p>0.05),這表明海洋魚蛋白低聚肽的ABTS自由基清除能力具有較好的抗消化穩(wěn)定性。海洋魚蛋白低聚肽的ABTS自由基清除率在模擬胃腸道消化后稍有提高的原因可能是:模擬胃腸液消化海洋魚蛋白低聚肽后,產(chǎn)生了較多的親水性的抗氧化活性肽段和具有抗氧化活性的氨基酸殘基,清除了大量的ABTS自由基,使得蛋白酶消化后的海洋魚蛋白低聚肽ABTS自由基清除能力有所提高。吳麗英[16]以瑪咖蛋白為研究對象,通過模擬體外消化,以ABTS為指標評價體外消化對瑪咖蛋白抗氧化活性的影響,結(jié)果表明經(jīng)過模擬消化處理的樣品的ABTS清除率和未經(jīng)過處理的樣品相比,分別增至原來的2.40倍和3.12倍,與本實驗變化趨勢基本一致。
圖10 不同濃度Vc的FRAP值Fig.10 FRAP values of different concentrations of Vc
表3 不同處理的海洋魚蛋白低聚肽的FRAP值Table 3 FRAP values of MFPO treated with different treatments
通過測定不同濃度的FeSO4·7H2O相應的OD值,得出鐵離子還原能力標準曲線表達式為:y=0.24x+0.04(R2=0.99)。由此得出了不同處理組海洋魚蛋白低聚肽的鐵離子還原能力,結(jié)果如表3所示。由表3可知,海洋魚蛋白低聚肽的FRAP值遠低于陽性對照組,且經(jīng)模擬胃腸液消化前后海洋魚蛋白低聚肽溶液的鐵離子還原能力只有輕微增加,無顯著影響(p>0.05),表明了海洋魚蛋白低聚肽的鐵離子還原能力具有抗消化穩(wěn)定性。Sae等[17]以超聲輔助法制備鮭魚鱗膠原蛋白,經(jīng)消化處理后,其鐵離子還原能力由0.05 μmol Trolox/mL升高到0.09 μmol Trolox/mL,其變化規(guī)律與本實驗保持一致。
圖11 不同濃度Trolox的動態(tài)熒光衰減曲線Fig.11 Dynamic fluorescence attenuation curves of Trolox at different concentrations
圖12 不同處理的海洋魚蛋白低聚肽的ORAC值Fig.12 ORAC values of MFBCO treated with different treatments
不同濃度Trolox標準液的動態(tài)熒光衰減曲線如圖11所示。由此得到Trolox標準曲線方程為:y=0.08x+2.08,(R2=0.99)。由此可得四組海洋魚蛋白低聚肽溶液的ORAC值如圖12。從圖12可得出,先胃后胰處理組極大地提高海洋魚蛋白低聚肽的ORAC值(p<0.01)。且海洋魚蛋白低聚肽分別經(jīng)模擬胃、腸液消化處理后,其ORAC值較未消化組相比,均有提高,最大值為59.594 μmol/L Trolox/g,陽性對照Vc的ORAC值為897.42 μmol Trolox/g。Pimentel[18]等證明蛋白質(zhì)水解后肽末端氨基酸的序列和暴露程度影響抗氧化活性,海洋魚蛋白低聚肽經(jīng)模擬胃、腸液消化處理后,分子質(zhì)量<1000 u的短肽所占比例均有不同程度的增加,最大可達11.69%,使得肽末端氨基酸的序列和暴露程度發(fā)生改變,這可能與其ORAC值增高有一定的關系。吳明澤[19]等以中華圓田螺肉酶解產(chǎn)物為研究對象,其ORAC值消化前800 μmol/L,在經(jīng)酶解后,酶解產(chǎn)物的ORAC最大可達1600 μmol/L,變化規(guī)律與本研究相似。
本實驗對海洋魚蛋白低聚肽進行體外模擬胃腸消化,分析其在消化期間抗氧化活性及結(jié)構(gòu)變化,主要結(jié)果如下:分子量分布結(jié)果表明海洋魚蛋白低聚肽較胃蛋白酶相比對胰蛋白酶的耐受性較差,分子量3000~5000 u的組分被胰蛋白酶大量水解,水解量最大高于80%;紫外全波長結(jié)果表明海洋魚蛋白低聚肽在消化前后其最大吸收峰發(fā)生了一定程度地變化,可能原因是經(jīng)模擬胃腸液消化以后溶液中發(fā)色團和助色團組成發(fā)生了改變;圓二色光譜對不同處理組的海洋魚蛋白低聚肽二級結(jié)構(gòu)組成進行了分析,發(fā)現(xiàn)胰蛋白酶消化前后,海洋魚蛋白低聚肽的二級結(jié)構(gòu)組成較胃蛋白酶組相比變化明顯,α-螺旋和反平行式β-折疊最大變化量為10.93%。上述結(jié)果表明海洋魚蛋白低聚肽在結(jié)構(gòu)上具有極強的抗胃蛋白酶消化穩(wěn)定性及相對較強的抗胰蛋白酶消化穩(wěn)定性。ABTS自由基清除率、FRAP值及ORAC值三個抗氧化指標結(jié)果表明消化后海洋魚蛋白低聚肽的抗氧化活性均提高,其中經(jīng)模擬胰液消化后的ORAC值提高最為顯著(p<0.01);DPPH自由基清除率經(jīng)模擬胰液消化后雖未提高,但清除率穩(wěn)定在20%~30%,仍具有一定的DPPH自由基清除能力。四個抗氧化指標表征了海洋魚蛋白低聚肽抗氧化活性具有抗消化穩(wěn)定性。海洋魚蛋白低聚肽作為一種新興蛋白資源,在結(jié)構(gòu)和抗氧化方面具有較好的抗消化穩(wěn)定性,這為三文魚肉的高附加值利用及相關產(chǎn)品的多元化開發(fā)提供了一定的理論基礎。