佐夫色綠藻高產(chǎn)蝦青素的誘導(dǎo)條件及發(fā)酵工藝優(yōu)化

何健澤，陳俊輝，姜雪亞，魏東

（華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640）

蝦青素（Astaxanthin），化學(xué)名稱(chēng)3,3’-二羥基-4,4’-二酮基-β’β-胡蘿卜素，是一種脂溶性紫紅色的類(lèi)胡蘿卜素，普遍存在于多種微生物和蝦蟹等海洋生物中[1]。蝦青素獨(dú)特的結(jié)構(gòu)使其具有超強(qiáng)的抗氧化性，是β-胡蘿卜素的10倍，維生素E的500倍，可延緩皮膚衰老、提高機(jī)體免疫力，在食品、醫(yī)藥和化妝品行業(yè)具有廣闊市場(chǎng)前景和應(yīng)用價(jià)值[2,3]。微生物發(fā)酵法是天然蝦青素生產(chǎn)的重要生產(chǎn)方式，常用的微生物有紅發(fā)夫酵母、雨生紅球藻等，但紅發(fā)夫酵母生產(chǎn)的蝦青素為全反構(gòu)型，主要作為三文魚(yú)類(lèi)等的餌料著色劑[4]。目前天然蝦青素工業(yè)生產(chǎn)的藻種主要是利用雨生紅球藻進(jìn)行的，但是培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞密度低、培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)、易污染，并且需要高光照等誘導(dǎo)脅迫條件，這制約了天然蝦青素的生產(chǎn)[5,6]。

佐夫色綠藻（Chromochloris zofingiensis）是一種淡水單細(xì)胞圓形綠藻，直徑范圍為2～15 μm，通過(guò)產(chǎn)生孢子細(xì)胞進(jìn)行繁殖[5]。佐夫色綠藻能夠進(jìn)行自養(yǎng)、異養(yǎng)和混養(yǎng)的多營(yíng)養(yǎng)方式生長(zhǎng)，積累多種高價(jià)值代謝產(chǎn)物，并且可以在現(xiàn)有微生物發(fā)酵裝置中進(jìn)行高密度培養(yǎng)。因此，目前色綠藻被認(rèn)為是大規(guī)模生產(chǎn)蝦青素的潛在替代藻種，相對(duì)于雨生紅球藻，佐夫色綠藻具有生長(zhǎng)速率快、細(xì)胞產(chǎn)率高、不易污染、細(xì)胞壁易破碎從而易于提取蝦青素等優(yōu)勢(shì)，有望進(jìn)一步降低天然蝦青素的生產(chǎn)成本[7]。

佐夫色綠藻雖然具有諸多優(yōu)點(diǎn)，但現(xiàn)階段胞內(nèi)蝦青素含量仍達(dá)不到雨生紅球藻的積累水平。如何顯著提高佐夫色綠藻胞內(nèi)蝦青素的生產(chǎn)水平，就成為當(dāng)前研究的難點(diǎn)和技術(shù)瓶頸。近年來(lái)研究表明佐夫色綠藻在特定誘導(dǎo)條件（包括高光誘導(dǎo)、過(guò)氧化氫和乙醇等氧化誘導(dǎo)[5,8]）的作用下可以顯著提高胞內(nèi)蝦青素含量。這主要是由于在這些誘導(dǎo)方式下，藻細(xì)胞內(nèi)氧化壓力增強(qiáng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生的活性氧（ROS）和自由基與蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA等發(fā)生反應(yīng)，對(duì)細(xì)胞造成氧化損傷，而藻細(xì)胞則會(huì)誘導(dǎo)合成蝦青素等抗氧化物質(zhì)來(lái)消除ROS和自由基，以保護(hù)細(xì)胞免受損傷以抵抗逆境[9]。因此，通過(guò)不同誘導(dǎo)脅迫條件來(lái)提高細(xì)胞ROS水平，就可以間接提高佐夫色綠藻生產(chǎn)積累蝦青素的水平[10]。目前文獻(xiàn)中報(bào)道的佐夫色綠藻培養(yǎng)的最高生物量可以達(dá)到98.40 g/L，蝦青素產(chǎn)量最高為73.30 mg/L[11]，基本達(dá)到雨生紅球藻的生產(chǎn)效率，但是蝦青素含量還較低。因此，進(jìn)行多誘導(dǎo)條件和發(fā)酵工藝的優(yōu)化，進(jìn)一步提高蝦青素含量，將有助于推動(dòng)利用佐夫色綠藻商業(yè)化生產(chǎn)制備蝦青素的進(jìn)程，因而具有重要的研究?jī)r(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景。

本研究以佐夫色綠藻為研究對(duì)象，采用葡萄糖和醋酸鈉為混合碳源進(jìn)行混合培養(yǎng)，研究了混養(yǎng)條件下混合碳源和過(guò)氧化氫誘導(dǎo)劑對(duì)佐夫色綠藻生長(zhǎng)和蝦青素積累的影響，從中獲得最佳培養(yǎng)條件，并在5 L光發(fā)酵罐中進(jìn)行了放大驗(yàn)證和發(fā)酵工藝優(yōu)化，為佐夫色綠藻商業(yè)化生產(chǎn)天然蝦青素提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本研究強(qiáng)化了佐夫色綠藻積累蝦青素能力并且驗(yàn)證了利用光發(fā)酵罐培養(yǎng)色綠藻生產(chǎn)蝦青素的可行性，為佐夫色綠藻生產(chǎn)制備天然蝦青素提供關(guān)鍵技術(shù)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藻種與培養(yǎng)基

佐夫色綠藻（Chromochloris zofingiensisATCC 30412）購(gòu)自美國(guó)American Type Culture Collection（ATCC）菌種保藏中心，采用Bristol’s medium（BM）培養(yǎng)基進(jìn)行藻種的保藏和培養(yǎng)[12]。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

本研究所采用的主要試劑有過(guò)氧化氫、乙醇、硫酸亞鐵、甲醇、二氯甲烷、葡萄糖、硝酸鈉以及培養(yǎng)基所需微量元素等均為分析純，購(gòu)自本地試劑公司。本研究主要儀器有高效液相分析儀（P680）購(gòu)自美國(guó)DIONEX公司；液相色譜柱YMC carotenoid column C30購(gòu)自美國(guó)Waters公司；流式細(xì)胞儀（Accuri C6）購(gòu)自美國(guó)BD公司；pH計(jì)（SevenEasy）購(gòu)自Mettler Toledo；生物傳感分析儀（SBA-40D）購(gòu)自山東省科學(xué)院；高速冷凍離心機(jī)（Alledra 25R）購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 藻種活化與種子液制備

從斜面培養(yǎng)基上挑取藻種，接種到裝有100 mL BM培養(yǎng)基（外加10 g/L葡萄糖）的250 mL三角瓶中，初始pH為6.50，在光照強(qiáng)度為10 μmol/m2·s，溫度為26 ℃，轉(zhuǎn)速為150 r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)4～5 d進(jìn)行活化。將培養(yǎng)好的藻液以10%的接種量接種到含有上述相同營(yíng)養(yǎng)成分培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中培養(yǎng)4 d，作為一級(jí)種子液。然后，再按10%的接種量轉(zhuǎn)接到裝有改良BM培養(yǎng)基的250 mL的三角瓶中（裝液量100 mL），其中改良培養(yǎng)基中初始葡萄糖30 g/L，硝酸鈉作為氮源，控制碳氮比為34，初始pH為6.50。在相同培養(yǎng)條件下將藻細(xì)胞培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期末期或穩(wěn)定期初期，作為二級(jí)種子液用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 混合碳源優(yōu)化

采用不同混合碳源的無(wú)氮BM培養(yǎng)基進(jìn)行佐夫色綠藻的搖瓶培養(yǎng)，研究不同混合碳源組合對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和蝦青素積累的影響?；诒緦?shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)葡萄糖濃度為20～30 g/L對(duì)于佐夫色綠藻生長(zhǎng)性能和蝦青素積累具有較好的促進(jìn)效果，并且培養(yǎng)結(jié)束后，20 g/L葡萄糖能夠消耗完，不會(huì)造成浪費(fèi)[13]。而且1.50～3.00 g/L醋酸鈉有助于提高蝦青素產(chǎn)量，其中醋酸鈉濃度為2.50 g/L時(shí)蝦青素產(chǎn)量最高[14]。本實(shí)驗(yàn)為了探究以葡萄糖和醋酸鈉為混合碳源取代單一碳源的可行性及其效果，故選擇五種不同的混合碳源條件進(jìn)行佐夫色綠藻的培養(yǎng)，具體條件分別為：只加20 g/L的葡萄糖（Glu）；只加2.50 g/L的醋酸鈉（NaAC）；同時(shí)加20 g/L的Glu和1.50 g/L的NaAC；同時(shí)加20 g/L的Glu和2.50 g/L的NaAC；同時(shí)加20 g/L的Glu和3.00 g/L的NaAC。醋酸鈉通過(guò)配置母液過(guò)濾除菌后加入。本實(shí)驗(yàn)在恒溫?fù)u瓶中培養(yǎng)，溫度為26 ℃，轉(zhuǎn)速為150 r/min，光照為130 μmol/m2·s，培養(yǎng)10 d，以蝦青素產(chǎn)量和產(chǎn)率為最優(yōu)評(píng)價(jià)指標(biāo)。

1.3.3 過(guò)氧化氫濃度優(yōu)化

以無(wú)氮的BM培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，初始葡萄糖濃度為20 g/L，醋酸鈉為2.50 g/L，設(shè)置不同的過(guò)氧化氫濃度梯度0、77.50、107.50、137.50 mg/L，并加入18 μmol/L硫酸亞鐵，研究過(guò)氧化氫誘導(dǎo)脅迫對(duì)佐夫色綠藻細(xì)胞生長(zhǎng)和蝦青素積累的影響，以蝦青素產(chǎn)量和產(chǎn)率為最優(yōu)評(píng)價(jià)指標(biāo)。培養(yǎng)過(guò)程中監(jiān)測(cè)葡萄糖濃度變化，降至0～5 g/L時(shí)進(jìn)行補(bǔ)料，補(bǔ)至20 g/L。其它培養(yǎng)條件同1.3.2。

1.3.4 光發(fā)酵罐發(fā)酵工藝優(yōu)化

在5 L光發(fā)酵罐中，設(shè)置三種不同發(fā)酵工藝：恒定高光強(qiáng)、低光強(qiáng)-高光強(qiáng)、低光強(qiáng)-高光強(qiáng)-補(bǔ)加過(guò)氧化氫，研究不同發(fā)酵工藝對(duì)佐夫色綠藻細(xì)胞生長(zhǎng)和蝦青素積累的影響，以蝦青素產(chǎn)量和產(chǎn)率為最優(yōu)評(píng)價(jià)指標(biāo)。具體工藝參數(shù)如下：(1)采用外置光源，通過(guò)調(diào)節(jié)電流控制光照強(qiáng)度，調(diào)節(jié)電流至最大從而將光照強(qiáng)度提高為653 μmol/m2·s，并維持恒定高光強(qiáng)；(2)光照強(qiáng)度采用逐漸提高光強(qiáng)的方式進(jìn)行調(diào)節(jié)，培養(yǎng)過(guò)程中從169 μmol/m2·s不斷增加到653 μmol/m2·s；(3)光照強(qiáng)度采用先低光后高光的方式進(jìn)行調(diào)節(jié)，從312 μmol/m2·s不斷增加到653 μmol/m2·s，培養(yǎng)至72 h進(jìn)行過(guò)氧化氫補(bǔ)料，補(bǔ)料濃度為107.50 mg/L過(guò)氧化氫和18 μmol/L的硫酸亞鐵。培養(yǎng)基采用無(wú)氮的BM培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，并添加20 g/L葡萄糖和2.50 g/L醋酸鈉。培養(yǎng)過(guò)程pH設(shè)置范圍6.50～8.50，溫度設(shè)置范圍為26 ℃～28 ℃，通氣量為3.33 L/min，轉(zhuǎn)速為150 r/min。培養(yǎng)期間采用0.10 mol/L鹽酸和氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH，溫度通過(guò)冷卻循環(huán)泵控制。

1.4 分析測(cè)試

1.4.1 生物量

生物量濃度采取干重法進(jìn)行測(cè)定。吸取一定體積藻液置于事先烘干稱(chēng)重的2 mL離心管中，并將其置于8000 r/min的條件下離心3 min，棄上清，獲得藻泥，并用蒸餾水進(jìn)行洗滌。重復(fù)三次后將離心得到的藻泥置于60 ℃恒溫干燥箱中烘干至恒重，最后通過(guò)計(jì)算前后重量的差值獲得生物量。

1.4.2 比生長(zhǎng)速率

通過(guò)生物量計(jì)算佐夫色綠藻的比生長(zhǎng)速率μ（d-1），比生長(zhǎng)速率的計(jì)算公式為：

其中X2、X1分別為t2、t1時(shí)間測(cè)定的生物量（g/L）。

1.4.3 細(xì)胞密度

細(xì)胞密度采用美國(guó)貝克曼CytoFLEX型流式細(xì)胞儀進(jìn)行測(cè)定。首先將藻液離心獲得藻泥，然后用超純水洗滌多次，稀釋到約1×106CFU/mL的細(xì)胞密度后進(jìn)行流式細(xì)胞儀測(cè)定，控制流式細(xì)胞儀的流速為35 μL/min，記錄時(shí)間為30 s，記錄10000個(gè)以上的細(xì)胞數(shù)據(jù)，并使用CytExpert 1.2軟件分析細(xì)胞密度。

1.4.4 葡萄糖濃度

利用SBA-40D生物傳感分析儀測(cè)定培養(yǎng)基內(nèi)葡萄糖濃度。首先將待測(cè)樣品上清液過(guò)濾并稀釋至葡萄糖濃度在0.50～1.00 g/L的可測(cè)范圍內(nèi)進(jìn)行傳感儀測(cè)定，測(cè)定前先用1.00 g/L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品定標(biāo)，待定標(biāo)通過(guò)后，吸取25 μL稀釋后樣品進(jìn)行測(cè)定，將測(cè)定獲得的讀數(shù)乘以稀釋倍數(shù)即得培養(yǎng)基的葡萄糖濃度。

1.4.5 細(xì)胞內(nèi)色素含量

佐夫色綠藻細(xì)胞內(nèi)色素提取和成分測(cè)定參照相關(guān)文獻(xiàn)[15]。將離心收集的藻泥采用冷凍干燥機(jī)凍干成藻粉，準(zhǔn)確稱(chēng)量10 mg藻粉，置于裝有陶瓷珠的振蕩管中，采用甲醇/二氯甲烷混合液（體積比3:1，含有0.10%的2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚）作為提取試劑，采用高頻振蕩儀進(jìn)行破碎提取，反復(fù)操作直至藻細(xì)胞變成無(wú)色，合并收集的所有上清液并利用氮?dú)獯蹈?。然后用甲?MTBE混合溶劑（1:1，V/V）定容，過(guò)濾并轉(zhuǎn)移至棕色瓶用于高效液相色譜分析。以上操作全程需注意避光。佐夫色綠藻細(xì)胞內(nèi)色素提取和成分測(cè)定參照相關(guān)文獻(xiàn)[16]，依據(jù)上述HPLC的測(cè)定條件進(jìn)行樣品測(cè)定。

HPLC測(cè)定具體步驟如下：采用YMC C30類(lèi)胡蘿卜素色譜柱和PDA檢測(cè)器，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為20 μL，流速為0.8 mL/min，流動(dòng)相分別為甲醇（A）及MTBE（B），進(jìn)行梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為480 nm、645 nm和665 nm，并在300～800 nm下進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描以測(cè)定光譜。稱(chēng)取色素標(biāo)準(zhǔn)品蝦青素、葉黃素、角黃素、葉綠素b、葉綠素a并分別制成一系列不同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照上述同樣方法進(jìn)行測(cè)定，建立相應(yīng)的色素標(biāo)準(zhǔn)曲線，最后依據(jù)色素標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間和標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行樣品中色素的定性和定量分析。

1.4.6 得率測(cè)定

生物量得率（Yg/gsubstrate）或蝦青素得率（Ymg/gsubstrate）是指每消耗單位濃度（g/L)葡萄糖（或醋酸鈉）對(duì)應(yīng)生物量的增長(zhǎng)量(g/L)或蝦青素產(chǎn)量的增長(zhǎng)量（mg/L），計(jì)算公式為：

其中y1、y2為培養(yǎng)起始和結(jié)束時(shí)測(cè)得的生物量（g/L)或蝦青素產(chǎn)量（mg/L），c1、c2為培養(yǎng)起始和結(jié)束時(shí)測(cè)得的葡萄糖（或醋酸鈉）的濃度（g/L）。

1.4.7 數(shù)據(jù)分析

采用Microcal Origin 9.0和SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 混合碳源對(duì)佐夫色綠藻積累蝦青素的影響

本實(shí)驗(yàn)研究不同混合碳源對(duì)佐夫色綠藻細(xì)胞生長(zhǎng)和蝦青素積累的影響。由圖1可知，在葡萄糖和混合碳源的實(shí)驗(yàn)組中，培養(yǎng)前兩天，葡萄糖消耗速率較快，生物量增長(zhǎng)也最快，但是培養(yǎng)到第四天時(shí)，葡萄糖消耗和細(xì)胞生物量增加值均下降。之后，雖然葡萄糖濃度不斷降低，但是藻細(xì)胞生物量增加緩慢。培養(yǎng)結(jié)束后，采用混合碳源培養(yǎng)的藻細(xì)胞生物量高于單一碳源。其中，采用20 g/L葡萄糖與2.50 g/L的醋酸鈉作為碳源，獲得的生物量濃度最高為6.50 g/L，是單一葡萄糖生物量濃度的1.47倍，是單一醋酸鈉碳源生物量濃度的2.00倍。這說(shuō)明添加醋酸鈉有助于佐夫色綠藻同化葡萄糖，進(jìn)而促進(jìn)藻細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖。Helder等人[17]研究在BBM培養(yǎng)基中同時(shí)加入醋酸鈉和葡萄糖各 7.50 g/L作為混合碳源進(jìn)行Neochloris oleoabundans培養(yǎng)，獲得了最高1.75 g/L的生物量，結(jié)果優(yōu)于單一碳源，與本研究結(jié)果類(lèi)似。這表明適宜濃度的混合碳源有利于微藻生物量的積累。

圖1 不同碳源培養(yǎng)條件下佐夫色綠藻生物量(Biomass)和葡萄糖(Glucose)濃度的變化曲線Fig.1 Time courses of C.zofingiensis biomass and glucose concentration in the cultures with different carbon sources

圖2 不同碳源培養(yǎng)條件下佐夫色綠藻的色素含量(a)及各色素所占總色素百分比(b)的變化情況Fig.2 Pigment contents (a) and abundances (b) as percentages of the total pigments in C.zofingiensis in the cultures with different carbon sources

但是，當(dāng)混合碳源中醋酸鈉濃度增加到3.00 g/L時(shí)，生物量濃度呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，在培養(yǎng)結(jié)束即第十天時(shí)，生物量為5.27 g/L、葡萄糖消耗速率為0.72 g/(L·d)，均顯著低于醋酸鈉為1.50 g/L和2.50 g/L的實(shí)驗(yàn)組。起始醋酸鈉濃度為3.00 g/L的實(shí)驗(yàn)組，在培養(yǎng)起始第0～2 d時(shí)，葡萄糖消耗速率就較低，這表明過(guò)高濃度的醋酸鈉會(huì)一定程度上抑制細(xì)胞對(duì)葡萄糖的消耗能力，進(jìn)而抑制藻細(xì)胞的生長(zhǎng)。莊惠如等人[18]研究發(fā)現(xiàn)雨生紅球藻隨著醋酸鈉濃度的增加，細(xì)胞生物量先增加后減少，在0.50～1.00 g/L的低濃度的醋酸鈉條件下有利于雨生紅球藻的生長(zhǎng)，使得雨生紅球藻迅速進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期，并延長(zhǎng)生長(zhǎng)期，在1.00 g/L的醋酸鈉條件下最高生物量干重約為0.70 g/L。1.50～2.00 g/L的高濃度醋酸鈉則會(huì)抑制其細(xì)胞生長(zhǎng)，且初始醋酸鈉濃度過(guò)高導(dǎo)致延滯期增長(zhǎng)，并對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用。由此得出，在混合碳源條件下，添加醋酸鈉有利于藻細(xì)胞的生長(zhǎng)，但醋酸鈉濃度不宜高于2.50 g/L，否則會(huì)抑制藻細(xì)胞生長(zhǎng)。

混合碳源對(duì)佐夫色綠藻積累蝦青素的影響如圖2所示。由圖2a可知，采用葡萄糖或醋酸鈉作為單一碳源時(shí)，獲得的蝦青素含量最高，達(dá)到3.51 mg/g以上，兩者無(wú)顯著性差異，但均顯著高于混合碳源實(shí)驗(yàn)組（p＜0.05）。在混合碳源實(shí)驗(yàn)組，隨著醋酸鈉的濃度的增加，蝦青素的含量也隨之增加，最高為2.78 mg/g，蝦青素占總類(lèi)胡蘿卜素的含量達(dá)到70%以上?；旌咸荚磁囵B(yǎng)中蝦青素含量較低，推測(cè)其原因可能是由于培養(yǎng)過(guò)程中，藻細(xì)胞內(nèi)同時(shí)存在多種碳源代謝途徑，從而合成不同的目標(biāo)代謝產(chǎn)物，進(jìn)而影響到蝦青素的積累。在佐夫色綠藻培養(yǎng)中，藻細(xì)胞生長(zhǎng)和蝦青素積累并不是同步的[19]，僅提高藻細(xì)胞內(nèi)蝦青素含量或藻的生物量，并不會(huì)顯著提高蝦青素生產(chǎn)水平。

在本研究中，采用混合碳源有助于藻細(xì)胞同化葡萄糖，如表1所示，葡萄糖平均消耗速率均在0.72 g/(L·d)以上，顯著高于單獨(dú)采用葡萄糖作為碳源的對(duì)照組（p＜0.05）。雖然混合碳源在一定程度上降低了蝦青素的含量，但是當(dāng)醋酸鈉濃度為2.50 g/L時(shí)，藻細(xì)胞密度較高，生物量相對(duì)于碳源的得率也最高達(dá)到0.51 g/g葡萄糖，最終獲得的蝦青素產(chǎn)量和產(chǎn)率也最高，分別達(dá)到16.98 mg/L和1.06 mg/(L·d)，顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組。但是，蝦青素得率為2.23 mg/g，稍低于單獨(dú)葡萄糖培養(yǎng)的對(duì)照組。由此可知，采用混合碳源有助于提高佐夫色綠藻蝦青素產(chǎn)量和產(chǎn)率。Wang等人[20]研究也發(fā)現(xiàn)葡萄糖和乙酸鈉組合碳源，相對(duì)于單獨(dú)的葡萄糖或單獨(dú)的乙酸鈉而言，具有潛在的培養(yǎng)優(yōu)勢(shì)，能夠顯著提高Coccomyxa subellipsoidea生物量和脂質(zhì)合成等生物學(xué)指標(biāo)。

綜上，在無(wú)氮條件下，以葡萄糖和醋酸鈉為混合碳源有助于提高佐夫色綠藻生產(chǎn)積累蝦青素的能力，尤其是當(dāng)葡萄糖濃度為20 g/L和醋酸鈉濃度為2.50 g/L時(shí)為最優(yōu)組合條件，可以顯著提高藻細(xì)胞生物量和蝦青素產(chǎn)量。

表1 不同碳源條件下佐夫色綠藻對(duì)葡萄糖消耗和蝦青素積累情況的對(duì)比Table 1 Comparisons of average glucose consumption and astaxanthin accumulation in C.zofingiensis cultures with different carbon sources

2.2 不同過(guò)氧化氫濃度對(duì)佐夫色綠藻積累蝦青素的影響

本實(shí)驗(yàn)研究不同過(guò)氧化氫濃度對(duì)佐夫色綠藻細(xì)胞生長(zhǎng)和蝦青素積累的影響。由圖3可知，添加過(guò)氧化氫不會(huì)抑制藻細(xì)胞生長(zhǎng)及其葡萄糖的消耗利用，反而有助于藻細(xì)胞的生長(zhǎng)。隨著過(guò)氧化氫添加量的增加，藻細(xì)胞生物量不斷增加，當(dāng)過(guò)氧化氫濃度為137.50 mg/L時(shí)，生物量達(dá)到最大值22.88 g/L，相對(duì)于對(duì)照組增加了37.50%，增加較顯著（p＜0.05）。培養(yǎng)到第6 d時(shí)，培養(yǎng)基中葡萄糖基本消耗完畢，而且添加過(guò)氧化氫的實(shí)驗(yàn)組中藻細(xì)胞對(duì)葡萄糖的消耗速率還會(huì)加快。Yu等人[21]對(duì)雨生紅球藻進(jìn)行了過(guò)氧化氫的處理后，發(fā)現(xiàn)過(guò)氧化氫對(duì)細(xì)胞密度有聚集效應(yīng)，與本研究中過(guò)氧化氫促進(jìn)藻細(xì)胞生長(zhǎng)的結(jié)果類(lèi)似?？赡苁沁^(guò)氧化氫會(huì)誘導(dǎo)藻細(xì)胞產(chǎn)生氧化脅迫，但適量過(guò)氧化氫不會(huì)影響藻細(xì)胞的質(zhì)膜功能及胞內(nèi)代謝酶的活性，反而因?yàn)樘岣吲囵B(yǎng)基中飽和氧的水平而促進(jìn)藻細(xì)胞生長(zhǎng)。

圖3 不同過(guò)氧化氫濃度下佐夫色綠藻生物量(Biomass)及葡萄糖(Glucose)消耗情況的變化曲線Fig.3 Time courses of biomass and glucose concentration in C.zofingiensis cultures with different concentrations of hydrogen peroxide

不同過(guò)氧化氫濃度對(duì)佐夫色綠藻積累蝦青素的影響如圖4所示。由圖4a中可知，當(dāng)過(guò)氧化氫濃度在0～107.50 mg/L之間時(shí)，隨著過(guò)氧化氫濃度的升高，蝦青素含量逐漸升高，且在過(guò)氧化氫濃度為107.50 mg/L，蝦青素含量最高為3.23 mg/g，顯著高于對(duì)照組（p＜0.05）。推測(cè)其原因可能是Fe2+與過(guò)氧化氫發(fā)生Haber-Weiss和Fenton反應(yīng)，進(jìn)而產(chǎn)生活性氧，對(duì)佐夫色綠藻形成一定的氧化脅迫，誘導(dǎo)藻細(xì)胞內(nèi)的蝦青素合成以抵抗氧化損傷[22]。同時(shí)，F(xiàn)e2+也是類(lèi)胡蘿卜素合成中的羥化酶和酮化酶的輔因子，從而提高酶活，促進(jìn)了蝦青素的積累[23]。隨后繼續(xù)提高過(guò)氧化氫濃度至137.50 mg/L，蝦青素的含量為3.21 mg/g，與過(guò)氧化氫濃度為107.50 mg/L下的蝦青素含量（3.23 mg/g)相比并沒(méi)有顯著性增加，反而有所下降，這可能是因?yàn)檫^(guò)量的過(guò)氧化氫會(huì)影響蝦青素的合成，導(dǎo)致蝦青素積累量降低。當(dāng)繼續(xù)增加過(guò)氧化氫到137.50 mg/L或更高濃度時(shí)，可能會(huì)超過(guò)藻細(xì)胞的承受程度，從而會(huì)對(duì)蝦青素合成起抑制作用，反而導(dǎo)致蝦青素含量下降。Ip等人[24]發(fā)現(xiàn)在不添加過(guò)氧化氫條件下，佐夫色綠藻生物量最高約為9.00 g/L，而添加0.10 mM過(guò)氧化氫時(shí)，生物量降低到約7.50 g/L，但蝦青素含量從約1.10 mg/g增加到約1.70 mg/g，之后繼續(xù)增加其濃度，生物量和蝦青素積累量均呈降低趨勢(shì)。同樣，Yu等人[21]研究雨生紅球藻在（0～1.00 mM）過(guò)氧化氫濃度下，隨著過(guò)氧化氫濃度的增加先增加后減少，在0.70 mM時(shí)達(dá)到最大，與對(duì)照組相比提高了10%，并且在1.00 mM時(shí)，蝦青素降低到對(duì)照組水平，說(shuō)明適宜濃度活性氧濃度能夠促進(jìn)蝦青素積累，達(dá)到飽和之后，再繼續(xù)增加過(guò)氧化氫會(huì)導(dǎo)致氧化損傷。由本研究可知，添加適宜濃度的過(guò)氧化氫有利于促進(jìn)藻細(xì)胞生長(zhǎng)和蝦青素積累[25]。

圖4 不同過(guò)氧化氫濃度下佐夫色綠藻色素含量（a）和各色素所占總色素百分比（b）Fig.4 Pigment contents (a) and abundances (b) as percentages of the total pigments in C.zofingiensis in the cultures with different hydrogen peroxide concentrations

不同過(guò)氧化氫濃度對(duì)佐夫色綠藻生長(zhǎng)和蝦青素積累影響的綜合對(duì)比分析如表2所示。添加過(guò)氧化氫不會(huì)抑制藻細(xì)胞對(duì)葡萄糖的消耗，反而可以提高葡萄糖消耗速率，最高為2.80 g/(L·d)，顯著高于對(duì)照組（p＜0.05）。當(dāng)過(guò)氧化氫濃度從77.50 mg/L增加到137.50 mg/L時(shí)，蝦青素產(chǎn)量和產(chǎn)率也達(dá)到最大值，分別為73.45 mg/L和4.59 mg/L/d，相較于空白組，分別提高了82.93%和82.87%，增長(zhǎng)非常顯著（p＜0.05）。過(guò)氧化氫濃度為137.50 mg/L的條件下，生物量得率和蝦青素得率也為最大值，分別為0.45 g/g葡萄糖和2.66 mg/g葡萄糖。Ip等人[8]研究了異養(yǎng)條件下過(guò)氧化氫對(duì)佐夫色綠藻的影響，其研究結(jié)果表明過(guò)氧化氫的添加有利于蝦青素的積累，這與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，但其蝦青素的產(chǎn)量最高為12.58 mg/L，遠(yuǎn)低于本實(shí)驗(yàn)結(jié)果。由此得出：過(guò)氧化氫的最適濃度范圍為107.50～137.50 mg/L，從蝦青素含量和生產(chǎn)成本方面的角度考慮，認(rèn)為107.50 mg/L過(guò)氧化氫最優(yōu)。

表2 不同乙醇濃度下佐夫色綠藻對(duì)葡萄糖消耗和蝦青素積累情況的對(duì)比Table 2 Comparisons of average glucose consumption and astaxanthin accumulation in C.zofingiensis cultures with different hydrogen peroxide concentration

2.3 發(fā)酵工藝優(yōu)化以強(qiáng)化佐夫色綠藻生產(chǎn)蝦青素性能

在前期多誘導(dǎo)條件優(yōu)化基礎(chǔ)上，本研究在5 L光發(fā)酵罐中進(jìn)行佐夫色綠藻放大培養(yǎng)，進(jìn)一步分析比較了恒定高光強(qiáng)、低光強(qiáng)-高光強(qiáng)、低光強(qiáng)-高光強(qiáng)-補(bǔ)加過(guò)氧化氫三種發(fā)酵工藝對(duì)佐夫色綠藻生產(chǎn)蝦青素的影響，從而獲得最佳發(fā)酵工藝以強(qiáng)化佐夫色綠藻生產(chǎn)蝦青素的性能。由圖5a～c可知，三種不同發(fā)酵培養(yǎng)中，溫度和pH值均處于藻細(xì)胞適宜生長(zhǎng)的條件，但是不同光強(qiáng)及其變化對(duì)佐夫色綠藻細(xì)胞生長(zhǎng)和葡萄糖消耗有直接影響。如圖5a、5d所示，在恒定高光強(qiáng)組，藻細(xì)胞生物量增加較慢，葡萄糖消耗速率也較低，培養(yǎng)144 h結(jié)束后，共消耗葡萄糖濃度6.30 g/L，藻細(xì)胞密度為1.15×108CFU/mL，生物量較低，僅為8.05 g/L。這說(shuō)明653 μmol/(m2·s)的高光直接抑制了藻細(xì)胞生長(zhǎng)并減緩其對(duì)葡萄糖吸收利用，這是因?yàn)楦吖鈺?huì)損傷光系統(tǒng)PSII，從而影響了細(xì)胞的生長(zhǎng)及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，從而抑制了細(xì)胞分裂[26]。此外，需要注意的是高光培養(yǎng)效果還與培養(yǎng)體系有直接關(guān)系，如Del Campo等人[19]在460 μmol/(m2·s)恒定光強(qiáng)的圓柱狀反應(yīng)器中進(jìn)行佐夫色綠藻培養(yǎng)10 d后，生物量從約0.30 g/L增加到7.00 g/L，生物量增加比較顯著，此時(shí)高光強(qiáng)并沒(méi)有抑制藻細(xì)胞生長(zhǎng)，推測(cè)5 L發(fā)酵罐和圓柱反應(yīng)器等不同培養(yǎng)體系因結(jié)構(gòu)差異而對(duì)于外界光線具有不同光衰減效果，從而影響了光照培養(yǎng)效果。

而在先低光后高光實(shí)驗(yàn)組（圖5b、e），藻細(xì)胞消耗葡萄糖的速率較快，在培養(yǎng)到36 h后，葡萄糖濃度就降低到6 g/L以下，之后補(bǔ)加到20 g/L后繼續(xù)培養(yǎng)，之后葡萄糖消耗速率略有降低，培養(yǎng)結(jié)束后共消耗葡萄糖24.70 g/L。藻細(xì)胞生長(zhǎng)速率也較快，在0～24 h及48～60 h的時(shí)間段內(nèi)細(xì)胞數(shù)有顯著增加，培養(yǎng)到72 h時(shí)生物量達(dá)到最大值16.15 g/L，之后略有降低并趨于平穩(wěn)，培養(yǎng)結(jié)束后藻細(xì)胞生物量為14.75 g/L，同恒定高光強(qiáng)組相比增加83.23%，有顯著的增長(zhǎng)（p＜0.05）。Chen等人[4]在搖瓶體系中采用兩階段培養(yǎng)策略，即先在35 μmol/(m2·s)弱光培養(yǎng)4 d，然后在80 μmol/(m2·s)強(qiáng)光下培養(yǎng)8 d，將藻細(xì)胞生物量從3.65 g/L提高到6.75 g/L以上，增加非常顯著（p＜0.01），這與本研究結(jié)果相似，但本研究獲得的生物量更高。其中圖5b中溫度波動(dòng)范圍大的原因可能是由于外置光源強(qiáng)度的階段式增大和發(fā)酵罐制冷系統(tǒng)響應(yīng)不及時(shí)，導(dǎo)致培養(yǎng)24～72 h時(shí)培養(yǎng)體系的溫度出現(xiàn)波動(dòng)，但是基本都維持在藻細(xì)胞適宜生長(zhǎng)的溫度范圍25～30 ℃之內(nèi)[5]，此時(shí)藻細(xì)胞生物量依然不斷增加，這說(shuō)明低光是影響藻細(xì)胞生長(zhǎng)的主要因素。當(dāng)培養(yǎng)到72 h時(shí)，光強(qiáng)從312.06 μmol/(m2·s)顯著增加到539.46 μmol/(m2·s)，此時(shí)高光和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏等脅迫條件協(xié)同作用從而誘導(dǎo)藻細(xì)胞內(nèi)蝦青素的積累，但會(huì)抑制藻細(xì)胞生長(zhǎng)，因此藻細(xì)胞生長(zhǎng)呈現(xiàn)出達(dá)到最大值后略有降低并趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)。

在低光強(qiáng)-高光強(qiáng)-補(bǔ)加過(guò)氧化氫的發(fā)酵工藝優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中，在培養(yǎng)前12 h采用低光培養(yǎng)促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)并縮短延滯期，在培養(yǎng)到72 h后添加誘導(dǎo)劑過(guò)氧化氫從而強(qiáng)化藻細(xì)胞內(nèi)蝦青素的積累，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5c、f所示。培養(yǎng)前12 h細(xì)胞生長(zhǎng)速率較快，之后提高光強(qiáng)后，細(xì)胞生物量和細(xì)胞數(shù)短暫下降，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，生物量才開(kāi)始逐漸增加，培養(yǎng)結(jié)束后達(dá)到11.08 g/L，但是還是顯著高于恒定高光強(qiáng)組。這說(shuō)明前12 h低光培養(yǎng)還是有助于細(xì)胞生長(zhǎng)，但可能時(shí)間還是太短，之后突然提高光強(qiáng)，產(chǎn)生了過(guò)多的光自由基，導(dǎo)致部分藻細(xì)胞損傷。培養(yǎng)前24 h的葡萄糖消耗速率較快，但之后也受到高光的抑制，培養(yǎng)結(jié)束后葡萄糖消耗量為16.10 g/L，顯著低于低光強(qiáng)-高光強(qiáng)實(shí)驗(yàn)組。綜上，低光強(qiáng)-高光強(qiáng)以及低光強(qiáng)-高光強(qiáng)-補(bǔ)加過(guò)氧化氫的生物量濃度分別為16.15 g/L和11.08 g/L顯著高于恒定高光強(qiáng)（8.15 g/L）（p＜0.05），從積累生物量角度而言，低光強(qiáng)-高光強(qiáng)的培養(yǎng)方式更有利于佐夫色綠藻生長(zhǎng)。

圖5 不同光發(fā)酵罐培養(yǎng)過(guò)程中溫度、pH值、光照強(qiáng)度以及佐夫色綠藻生長(zhǎng)和葡萄糖消耗情況隨培養(yǎng)時(shí)間的變化曲線Fig.5 Time courses of the changes of temperature, pH and light intensity, glucose consumption, and cell growth of C.zofingiensis grown in 5 L photo-fermenter with different culture conditions

三種不同發(fā)酵工藝對(duì)佐夫色綠藻積累蝦青素的影響如圖6所示。由圖6a可知，在恒定高光強(qiáng)組，蝦青素含量和產(chǎn)量隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而呈現(xiàn)穩(wěn)步上升的趨勢(shì)，且培養(yǎng)到108 h時(shí)達(dá)到最大值，分別為2.80 mg/g和21.50 mg/L，分別是初始蝦青素含量和產(chǎn)量的3.50倍和4.60倍，增加非常顯著。Del Campo等人[19]采用圓筒裝置對(duì)佐夫色綠藻在460 μmol/m2·s或者920 μmol/m2·s恒定光強(qiáng)下進(jìn)行培養(yǎng)，其蝦青素產(chǎn)量最高為19.00 mg/L，低于本實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在低光強(qiáng)-高光強(qiáng)組（圖6b），前期蝦青素積累速率較慢，但培養(yǎng)至36 h之后，隨著光強(qiáng)的提高，蝦青素的含量和產(chǎn)量快速增長(zhǎng)，推測(cè)其原因可能是葡萄糖的加入和光強(qiáng)增加會(huì)使得藻所在的環(huán)境處于適合藻生長(zhǎng)和蝦青素積累的高光及高C/N的條件[5,12]。在培養(yǎng)至96 h之后蝦青素含量的增長(zhǎng)速度降低，并在培養(yǎng)到132 h時(shí)蝦青素含量達(dá)到最大值為2.66 mg/g，之后基本處于穩(wěn)定狀態(tài)，可能原因是培養(yǎng)至后期，細(xì)胞密度以及體積逐漸增大、細(xì)胞之間相互遮擋等因素，從而使得有效的光照強(qiáng)度降低，但低光強(qiáng)有助于細(xì)胞生長(zhǎng)，故蝦青素產(chǎn)量在培養(yǎng)至132 h時(shí)達(dá)到最大，為38.38 mg/L，相較于高光強(qiáng)條件下，盡管蝦青素的含量略有降低，然而蝦青素的產(chǎn)量提高了78.84%。Chen等人[4]同樣采用低光強(qiáng)-高光強(qiáng)的培養(yǎng)策略進(jìn)行培養(yǎng)288 h后，蝦青素含量從1.80 mg/g增加到2.19 mg/g，而產(chǎn)量從6.58 mg/L增加到14.80 mg/L。這說(shuō)明采用低光強(qiáng)-高光強(qiáng)能夠提高佐夫色綠藻積累蝦青素的能力，且在這種培養(yǎng)方式下不會(huì)顯著降低細(xì)胞內(nèi)蝦青素含量。

在低光強(qiáng)-高光強(qiáng)-補(bǔ)加過(guò)氧化氫實(shí)驗(yàn)條件下，在培養(yǎng)前期蝦青素含量雖然呈現(xiàn)不斷增加趨勢(shì)，但是增長(zhǎng)較緩慢，與恒定高光強(qiáng)組的現(xiàn)象基本一致，結(jié)果如圖6c所示。而在補(bǔ)加過(guò)氧化氫后的72～120 h內(nèi)，蝦青素含量的增加非常顯著，從2.30 mg/g增加到3.82 mg/g。這相對(duì)于高光強(qiáng)和低光強(qiáng)-高光強(qiáng)實(shí)驗(yàn)組，分別提高了36.92%和43.60%，增加非常顯著（p＜0.05）。這說(shuō)明補(bǔ)加過(guò)氧化氫對(duì)蝦青素的積累具有顯著的效果。此時(shí)，蝦青素產(chǎn)量也達(dá)到最大值41.41 mg/L，產(chǎn)率為11.50 mg/L/d。之后繼續(xù)培養(yǎng)，蝦青素含量和產(chǎn)量均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，這可能是由于細(xì)胞后期耐受高光強(qiáng)的能力下降，從而受到光氧化損傷，從而導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)和生物量干重及蝦青素含量和產(chǎn)量均呈下降的趨勢(shì)。此外，由低光強(qiáng)-高光強(qiáng)-補(bǔ)加過(guò)氧化氫實(shí)驗(yàn)組的蝦青素含量和產(chǎn)量變化可知（圖6c），最佳的培養(yǎng)時(shí)間為120 h，此時(shí)采收可以確保獲得最大蝦青素生產(chǎn)效率并降低培養(yǎng)成本，相較于前兩種培養(yǎng)方式能夠獲得更高的蝦青素含量和產(chǎn)量。這種培養(yǎng)策略結(jié)合了低光強(qiáng)-高光強(qiáng)的模式的增加生物量濃度的優(yōu)點(diǎn)，又提高了佐夫色綠藻的蝦青素含量，最適宜用于佐夫色綠藻培養(yǎng)生產(chǎn)蝦青素。

圖6 不同光發(fā)酵罐培養(yǎng)條件下佐夫色綠藻胞內(nèi)蝦青素含量和產(chǎn)量隨培養(yǎng)時(shí)間的變化曲線Fig.6 Time courses of the content and yield of astaxanthin in C.zofingiensis grown in 5 L photo-fermenter with different culture conditions

為了綜合分析不同發(fā)酵培養(yǎng)條件對(duì)佐夫色綠藻生產(chǎn)積累蝦青素的影響，本實(shí)驗(yàn)將不同培養(yǎng)條件下的藻細(xì)胞生產(chǎn)指標(biāo)進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果如表3所示。

表3 三種不同發(fā)酵培養(yǎng)條件對(duì)佐夫色綠藻生產(chǎn)蝦青素性能的影響對(duì)比分析Table 3 Comparisons of the effects of three different culture conditions on astaxanthin production by C.zofingiensis

由表3可知，在低光強(qiáng)-高光強(qiáng)實(shí)驗(yàn)組獲得的藻細(xì)胞平均比生長(zhǎng)速率最高為0.13 d-1，生物量產(chǎn)率達(dá)到最大值，為1.39 g/(L·d)，顯著高于恒定高光實(shí)驗(yàn)組。在蝦青素積累方面，采用先低光后高光培養(yǎng)條件，在蝦青素含量方面與恒定高光組無(wú)顯著差異，但是由于生物量增長(zhǎng)顯著的原因，蝦青素產(chǎn)量和產(chǎn)率也有顯著提高。Liu等人[27]在350 μmol/(m2·s)高強(qiáng)光下進(jìn)行C.zofingiensis的半連續(xù)培養(yǎng)，可以獲得的生物量產(chǎn)率為0.79 g/(L·d)，蝦青素含量和產(chǎn)率分別為3.40 mg/g和2.70 mg/(L·d)。相對(duì)而言，本研究采用先低光后高光的發(fā)酵工藝，在不影響蝦青素積累的前提上，可以顯著提高佐夫色綠藻生產(chǎn)蝦青素的能力。更進(jìn)一步，采用培養(yǎng)中期補(bǔ)加過(guò)氧化氫的發(fā)酵培養(yǎng)，有助于提高藻細(xì)胞吸收利用葡萄糖的能力，最大消耗速率為2.68 g/(L·d)，同時(shí)可以在此基礎(chǔ)上顯著提高蝦青素的含量和產(chǎn)率。但培養(yǎng)結(jié)束后得到的藻細(xì)胞生物量得率和蝦青素得率較低，僅為0.27 g/g和1.60 mg/g，這說(shuō)明過(guò)多的葡萄糖消耗并沒(méi)有被有效轉(zhuǎn)化為生物量和蝦青素，其中原因還有待深入研究?？傊捎玫凸鈴?qiáng)-高光強(qiáng)-補(bǔ)加過(guò)氧化氫的培養(yǎng)工藝最有利于佐夫色綠藻生產(chǎn)積累蝦青素。

目前關(guān)于佐夫色綠藻的研究報(bào)道很多，然而利用發(fā)酵罐裝置進(jìn)行佐夫色綠藻培養(yǎng)積累蝦青素的大多采用異養(yǎng)發(fā)酵。Sun等人[28]采用3.70 L的發(fā)酵裝置在異養(yǎng)條件下對(duì)佐夫色綠藻培養(yǎng)了16 d，其最終獲得蝦青素產(chǎn)量為32.40 mg/L，低于本實(shí)驗(yàn)中采用低光強(qiáng)-高光強(qiáng)-補(bǔ)加過(guò)氧化氫發(fā)酵模式的結(jié)果。而Liu等人[29]利用3.70 L的發(fā)酵裝置異養(yǎng)培養(yǎng)積累蝦青素，盡管其最終獲得蝦青素產(chǎn)量為56.10 mg/L，然而其蝦青素含量?jī)H為1.23 mg/g，蝦青素含量低于本研究中的結(jié)果。Chen等人[4]實(shí)驗(yàn)表明低光強(qiáng)-高光強(qiáng)兩步法最有利于提高佐夫色綠藻生物量和蝦青素產(chǎn)量，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，并且本研究在此基礎(chǔ)上產(chǎn)生加入了氧化誘導(dǎo)劑過(guò)氧化氫，進(jìn)一步提高了蝦青素產(chǎn)量。Zhang等人[11]采用兩步法對(duì)佐夫色綠藻培養(yǎng)了16 d，其最高生物量濃度可達(dá)98.40 g/L，蝦青素產(chǎn)量為73.30 mg/L，而其蝦青素產(chǎn)率為5.24 mg/(L·d)，低于本研究結(jié)果。以上研究結(jié)果進(jìn)一步證明了本實(shí)驗(yàn)所采用于發(fā)酵罐中進(jìn)行低光強(qiáng)-高光強(qiáng)-補(bǔ)加過(guò)氧化氫的發(fā)酵方式的科學(xué)性和優(yōu)越性。

綜上所述，采用光發(fā)酵罐的發(fā)酵模式進(jìn)行佐夫色綠藻發(fā)酵培養(yǎng)具有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)在培養(yǎng)前期（0～72 h）采用先低光后高光的階梯式提高光強(qiáng)的培養(yǎng)策略有助于佐夫色綠藻細(xì)胞生長(zhǎng)，而在培養(yǎng)中后期（72～120 h）通過(guò)添加過(guò)氧化氫進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)則有助于藻細(xì)胞內(nèi)蝦青素的高效積累。通過(guò)這兩種培養(yǎng)策略可以使得佐夫色綠藻的蝦青素生產(chǎn)性能得到顯著提升，這可以為佐夫色綠藻的發(fā)酵培養(yǎng)優(yōu)化以及規(guī)?；囵B(yǎng)生產(chǎn)蝦青素提供理論指導(dǎo)和參考依據(jù)，有利于推動(dòng)佐夫色綠藻在天然蝦青素商業(yè)化生產(chǎn)中的應(yīng)用。

3 結(jié)論

本研究在搖瓶和光發(fā)酵罐中初步探索不同誘導(dǎo)條件和發(fā)酵工藝對(duì)佐夫色綠藻胞內(nèi)蝦青素積累的影響，從中可知采用葡萄糖和醋酸鈉作為混合碳源優(yōu)于單一碳源，同時(shí)添加過(guò)氧化氫進(jìn)行誘導(dǎo)可優(yōu)化佐夫色綠藻積累蝦青素的效果。進(jìn)一步在5 L光發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)中對(duì)上述優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證，從而得出低光強(qiáng)-高光強(qiáng)-補(bǔ)加過(guò)氧化氫的發(fā)酵工藝最利于佐夫色綠藻積累蝦青素，同時(shí)兼顧生物量和蝦青素積累量，從而獲得了最優(yōu)的蝦青素產(chǎn)量。本研究結(jié)果為高產(chǎn)蝦青素的微藻規(guī)?；P(guān)鍵培養(yǎng)技術(shù)提供了重要研究基礎(chǔ)。