靈芝多糖對人肺癌A549細胞增殖凋亡的作用

李志強，何玉霞

（滄州市傳染病醫(yī)院結(jié)核三科，河北滄州 061001）

肺癌是一種在臨床上比較常見的惡性腫瘤，由呼吸系統(tǒng)出現(xiàn)故障所引起，能夠?qū)颊叩纳眢w健康造成嚴(yán)重威脅，甚至能夠威脅患者的生命安全[1,2]。據(jù)相關(guān)流行病數(shù)據(jù)表明，在我國，肺癌呈明顯上升的趨勢，且相比其他的惡性腫瘤，肺癌具有更高的發(fā)病率和病死率[3,4]。據(jù)臨床調(diào)查顯示，男性肺癌的發(fā)病率要高于女性肺癌的發(fā)病率，且長期抽煙人群的發(fā)病率要高于非抽煙人群20倍左右[5,6]。

有大量實驗研究結(jié)果表明，植物多糖與臨床上常用的抗癌藥物相比，植物多糖對細胞毒性作用更小，更安全[7,8]。靈芝多糖能夠修復(fù)人體老化細胞，能夠預(yù)防疾病的發(fā)生，提高免疫能力，能對慢性疾病起到防治作用，具有非常好的食療調(diào)節(jié)功能。靈芝多糖可制作為保健食品，靈芝多糖可添加進口服液、飲料等之中，可以豐富食品市場[9,10]。靈芝多糖能夠融于熱水之中，能夠起到促進血液循環(huán)、提升免疫能力、糖衰老、降血糖等作用。靈芝可用于食品、化妝品等多個行業(yè)，對食品和化妝品市場進行了豐富。有學(xué)者在研究中表示，使用靈芝多糖肽對肝癌細胞進行干預(yù)，能夠抑制癌細胞遷移，誘導(dǎo)癌細胞凋亡，但是目前關(guān)于使用靈芝多糖對肺癌進行干預(yù)的研究還相對較少。對靈芝多糖影響肺癌細胞生物學(xué)行為的作用進行觀察研究，能夠為肺癌的臨床治療提供新的研究方向。

Bcl-2、PI3K、Akt是臨床常用的細胞凋亡蛋白，三者表達變化與癌細胞增殖、凋亡能力變化具有密切聯(lián)系[11,12]。本研究設(shè)計實驗，培養(yǎng)肺癌A549細胞，使用靈芝多糖進行干預(yù)，檢測癌細胞增殖、凋亡能力變化及Bcl-2、PI3K、Akt相對表達量，探究靈芝多糖對人肺癌A549細胞的干預(yù)效果。

1 材料與方法

1.1 材料

人肺癌A549細胞株購于ATCC；主要試劑：小鼠抗大鼠PI3K抗體，BD公司；大鼠抗兔Akt抗體，上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司；小鼠抗大鼠Bcl-2抗體，Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1 靈芝多糖制備

將靈芝放置在70 ℃的環(huán)境中對其進行干燥處理，在經(jīng)過3 h處理后，粉碎后過60目篩網(wǎng)，取靈芝粉末50 g，使用石油醚500 mL對其進行回流2 h，之后再進行抽濾，揮干。清除蛋白質(zhì)沉淀后應(yīng)用丙酮、95%乙醇、無水乙醇、乙醚等洗滌至溶液無色，70 ℃環(huán)境中干燥處理得粗多糖，以蒸餾水進行溶解過濾，去除沉淀，重復(fù)洗滌后干燥，得靈芝粗多糖。

1.2.2 靈芝多糖提取物分離純化

1.2.2.1 離子交換樹脂脫色

稱取適量的靈芝多糖粗提取物，配置成配成2 mg/mL的溶液，給予樹脂交換加入8 g/100 mL D-201陰離子，使用75 r/min在恒溫振蕩器中，脫色處理2 h在40 ℃環(huán)境進行，過濾處理后，在濾液中得到脫色提取物溶液。

1.2.2.2 Sevag法除蛋白

取適量的脫色提取物溶液，加入1/3體積氯仿-正丁醇混合液（體積比為5:1），4000 r/min離心處理10 min，使用分液漏斗進行靜置分層，其變性蛋白層是中間層，氯仿-正丁醇混合液是下層，對上清提取物溶液層進行收集，需要重復(fù)8次操作，包括：上清液透析、濃縮、冷凍、干燥，最后得到靈芝多糖純化提取物。

1.2.2.3 靈芝多糖提取物純化

稱取1.0 g靈芝多糖純化提取物，溶解于3 mL蒸餾水中，上樣于平衡好的DEAE-52（OH）纖維素柱(2.5 cm×25 cm)，加入NaCl（0.075 mol/L）、NaCl（0.1 mol/L）、NaCl（0.125 mol/L）進行洗脫，其流速設(shè)置為1.0 mL/min，采用分步收集，每試管中為10 mL。之后采用苯酚-硫酸法對收集到的組分進行檢測。對提取物組分進行收集，得到靈芝多糖提取物。

1.2.3 細胞培養(yǎng)及分組

在40 ℃的環(huán)境中對凍存的肺癌A549細胞進行火浴處理（40 ℃），之后進行充分搖晃，將搖晃均勻的肺癌A549細胞置于2 mL的培養(yǎng)基（10% PBS、1%雙抗（青鏈霉素）RPMI-1640培養(yǎng)基500 mL）之內(nèi)，之后使用2000 r/min的離心機進行離心處理，進行重懸處理后將細胞傳代，使用CO2培養(yǎng)箱對培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h、換液，細胞融合率達90%后傳代。將本研究細胞分為空白組、藥物對照組、低、中、高濃度組，種板后1 d更換培養(yǎng)液時加入靈芝多糖預(yù)處理，1 d后變換培養(yǎng)液，加入靈芝多糖，1次/d，2 d后提取細胞蛋白。空白組使用生理鹽水干預(yù)，藥物對照組使用2 mg/L順鉑進行干預(yù)，低濃度組、中濃度組、高濃度組細胞分別加入5、10、20 μmol/L靈芝多糖。

1.2.4 細胞毒性、增殖抑制試驗

96孔板上接種細胞，將100 μL培養(yǎng)液加入，將其放置在37 ℃環(huán)境下對其進行培養(yǎng)1 d，細胞貼壁生長后分離上清液并清洗。加入各濃度靈芝多糖，并設(shè)置對照，常溫下培養(yǎng)24 h，對上清液進行分離，每個孔使用PBS進行清洗，將50 μL亞甲基藍著色液加入每孔中，常溫下培養(yǎng)1 h。去除染色液后洗板，將100 μL洗脫緩沖液加入每個孔中，搖晃0.5 h后對比各組細胞區(qū)別。亞甲基藍比色法對靈芝多糖抗細胞細胞增殖作用進行檢測。

1.2.5 細胞增殖檢測

MTT法檢測各組細胞增殖能力。將各組細胞加入96孔板中，分別于12、24、48、72 h后再每孔中加入30 μL的MTT液，37 ℃孵育4 h，棄培養(yǎng)液，加入150 μL的DMSO，酶標(biāo)儀在2.498 nm波長處檢測每孔的OD值。

1.2.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡

常溫環(huán)境中使用20 μg/mL蛋白酶K培養(yǎng)0.5 h后去除蛋白，使用PBS緩沖液進行徹底清洗，之后將平衡緩沖液100 μL加入其中，室溫環(huán)境中平衡10 min，之后滴入TdT酶反應(yīng)液100 μL，避光、室溫環(huán)境中孵育1 h，之后加入100 μL SSC溶液，常溫環(huán)境中靜置20 min后進行清洗3次，之后使用DAPI進行復(fù)染，避光培養(yǎng)10 min后再次進行浸洗，封片觀察。DAPI復(fù)染細胞核呈藍色，凋亡細胞細胞核呈綠色，取每切片3視野進行觀察、計算細胞凋亡率，計算平均值。

1.2.7 Bcl-2、PI3K、Akt表達檢測

使用PBS緩沖液對標(biāo)本沖洗之后裂解30 min，測定蛋白濃度。取20 μg/孔蛋白質(zhì)，添加蛋白緩沖液后進行電泳，10 min后將電轉(zhuǎn)膜置于10%的牛奶中浸泡，常溫環(huán)境下封閉90 min。之后結(jié)合一抗、稀釋，孵育1 d，取出后使用TBST液沖洗，結(jié)合二抗，60 min后清洗、顯色。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果與討論

2.1 抗增殖能力和細胞毒性比較

如表1所示，靈芝多糖對肺癌A549細胞進行干預(yù)，EC25值為低濃度：247.48 mg/mL、中濃度：251.46 mg/mL、高濃度：249.54 mg/mL；EC50值分別為低濃度：309.54 mg/mL、中濃度：311.47 mg/mL、高濃度：313.39 mg/mL，未檢測到細胞毒性，說明靈芝多糖抗細胞增殖能力和自身的細胞毒性無關(guān)。

表1 抗增殖能力和細胞毒性比較Table 1 Comparison of antiproliferative ability and cytotoxicity

2.2 不同濃度靈芝多糖對肺癌A549細胞增殖的影響

表2 不同濃度靈芝多糖對肺癌A549細胞增殖的影響Table 2 Effects of different concentrations of Ganoderma lucidum polysaccharides on the proliferation of lung cancer A549 cells [, %]

表2 不同濃度靈芝多糖對肺癌A549細胞增殖的影響Table 2 Effects of different concentrations of Ganoderma lucidum polysaccharides on the proliferation of lung cancer A549 cells [, %]

注：同列右肩字母不同表示差異性顯著，p＜0.05，下同。

組別 增殖率/%24 h 48 h 72 h空白組 69.53±8.69a 69.18±8.76 a 68.95±8.86a藥物對照組 50.63±8.11b 32.46±6.01b 26.46±4.36b低濃度組 65.34±9.24a 54.37±8.65c 50.87±7.69c中濃度組 60.42±8.74c 50.42±7.51d 36.48±5.36d高濃度組 44.37±7.48d 31.34±5.64b 20.11±2.98e

薛偉等[13]在研究中表示，對肺癌細胞進行干預(yù)，能夠抑制肺癌細胞增殖。如表2所示，高濃度組細胞增殖率均低于其他組別，且空白組最高，并且時間越長，細胞增殖率均出現(xiàn)下降越多，空白組自73.84%下降至65.82%，藥物對照組自50.63%下降至26.46%，低濃度組自65.34%下降至50.87%，中濃度組自60.42%下降36.48%，高濃度組自44.37%下降至20.11%。靈芝多糖食品有著預(yù)防腫瘤、抑制腫瘤的作用，能夠軟化血管、促進血液循環(huán)的作用，這一結(jié)果經(jīng)過了眾多學(xué)者的肯定，本文研究中使用靈芝多糖進行干預(yù)，能夠?qū)Ψ伟〢549細胞的增殖、擴散起到抑制作用。

2.3 靈芝多糖對細胞凋亡的影響

表3 靈芝多糖對細胞凋亡的影響Table 3 Effect of Ganoderma polysaccharide on apoptosis%]

表3 靈芝多糖對細胞凋亡的影響Table 3 Effect of Ganoderma polysaccharide on apoptosis%]

組別 凋亡率/%24 h 48 h 72 h空白組 3.25±0.68a 3.31±0.59a 3.37±0.63a藥物對照組 43.25±3.78b 51.34±4.38b 72.42±6.05b低濃度組 10.42±1.49c 27.86±2.62c 37.64±3.12c中濃度組 29.38±2.59d 47.43±3.47d 59.33±5.01d高濃度組 40.52±3.96b 50.16±4.65b 67.93±6.16e

有學(xué)者在研究中表示，肺癌細胞凋亡率較低，對肺癌細胞進行干預(yù)，對肺癌細胞凋亡能夠起到促進的作用[14,15]。本文使用靈芝多糖對肺癌A549細胞進行干預(yù)后，結(jié)果如表3所示，高濃度組凋亡率均高于其他組別，且空白組最低，并且隨著時間的推移，各組凋亡率均出現(xiàn)上升，藥物對照組細胞凋亡率自43.25%上升至72.42%，低濃度組細胞凋亡率自10.42%上升至37.64%，中濃度組細胞凋亡率自29.38%上升至59.33%，高濃度組凋亡率自40.52%上升至67.93%。靈芝多糖食品能夠提高自身免疫能力，通過提升自身免疫能力來起到抗癌和防癌的作用，本文研究中使用靈芝多糖進行干預(yù)，能夠促進肺癌A549細胞凋亡。

2.4 靈芝多糖對凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、PI3K、Akt相對表達量

在細胞凋亡的表達中，Bcl-2、PI3K、Akt與其有著密切聯(lián)系[16,17]。Bcl-2作為線粒體通路中起著調(diào)節(jié)作用的重要基因之一，有促進細胞凋亡的能力[18]。PI3K能夠?qū)π盘杺鲗?dǎo)、細胞形態(tài)和細胞的生理功能起到重要作用[19]。Akt作為一種靶蛋白，能夠起到促使細胞生長的作用[20]。本文研究中對凋亡相關(guān)蛋白表達量進行了檢測，如表4所示，各組肺癌A549細胞Bcl-2相對表達量均低于空白組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05）；各組肺癌A549細胞PI3K相對表達量分別為均低于空白組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05）；各組肺癌A549細胞Akt相對表達量均低于空白組。說明靈芝多糖能夠調(diào)控Bcl-2、PI3K、Akt表達，從而起到促進肺癌A549細胞凋亡的作用。

表4 各組細胞Bcl-2、PI3K、Akt表達對比Table 4 Comparison of the expression of Bcl-2, PI3K and Akt in each group

圖1 各組細胞Bcl-2、PI3K、Akt表達Fig.1 The expression of Bcl-2, PI3K and Akt in each group

3 結(jié)論

3.1 靈芝多糖具有一定的抗細胞增殖能力，靈芝多糖食物較為溫和，能夠軟化血管、促進血液循環(huán)的作用，并且有預(yù)防腫瘤發(fā)生，本文研究中使用靈芝多糖干預(yù)，肺癌A549細胞增殖率出現(xiàn)下降，并且靈芝多糖抗細胞增殖能力和自身的細胞毒性無關(guān)。

3.2 在靈芝多糖的調(diào)控下，細胞凋亡率明顯提高，且靈芝多糖的濃度和使用時間與凋亡率有密切聯(lián)系，靈芝多糖能夠提高自身免疫能力，通過提升自身免疫能力來起到抗癌和防癌的作用，本文研究中使用靈芝多糖對肺癌A549細胞進行調(diào)控，能夠?qū)Ψ伟〢549細胞凋亡起到促進作用。

3.3 在靈芝多糖的干涉下，凋亡相關(guān)蛋白表達得到了調(diào)控，說明靈芝多糖能夠通過對細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的調(diào)控，起到促進細胞凋亡、抑制細胞增殖。

3.4 綜上所述，靈芝多糖能夠抑制細胞增殖，促進細胞凋亡，調(diào)控細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達，說明靈芝多糖能夠?qū)θ朔伟〢549細胞增殖凋亡起到調(diào)控。