UPLC-MS/MS同時測定鐵皮石斛莖、葉、花中酚類組分的含量

黃 彪，何 偉，吳建鴻，王紅梅，李 巍

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，福建 福州 350003；2.福建省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350003；3.福建連天福生物科技有限公司，福建 龍巖 366200）

鐵皮石斛（Dendrobium officinale）是蘭科石斛屬中草藥植物，為2015版《中華人民共和國藥典》收載的珍稀名貴中藥材，位居“九大仙草之首”。鐵皮石斛中含有多糖[1-2]、生物堿[3-4]、聯(lián)芐衍生物[5-6]、氨基酸[7-8]、類黃酮[9-10]、酚酸[11-12]等多種活性成分，具有抗氧化[13-14]、抗腫瘤[15-16]、增強(qiáng)免疫[17]等作用。在本草考證中以莖為藥用部分，但在《中國藥典》及很多現(xiàn)代文獻(xiàn)中均將石斛全草為藥用部分，以前市場上的鐵皮石斛制品如石斛楓斗、膠囊、石斛粉主要是以石斛莖部原料加工成產(chǎn)品，而較少以石斛葉、花為原料。近年來，隨著石斛種植面積的不斷擴(kuò)大，鐵皮石斛多樣性產(chǎn)品的不斷豐富，對鐵皮石斛莖以外的材料如葉、花部位的化學(xué)成分深入研究也引起了研究者興趣[18-21]。

植物多酚是一類存在于植物中的多羥基酚類化合物的總稱，具有抗氧化、防癌抗癌、殺菌、抗炎等功效。已有報道多為對鐵皮石斛中總酚含量的分析[22-24]，有關(guān)鐵皮石斛中酚類物質(zhì)具體組分的研究較少，文獻(xiàn)中有關(guān)鐵皮石斛中酚類化合物的研究僅有李燕[11]和李巖[12]等關(guān)于鐵皮石斛莖部酚酸類組分的分析，鐵皮石斛莖、葉、花中酚類組分的分析鮮見報道。

相對于液相色譜儀，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）儀分析速度更快，靈敏度更高，抗基質(zhì)“干擾”能力更強(qiáng)。UPLC-MS/MS儀將目標(biāo)物簡單分離后，通過誘導(dǎo)碰撞使目標(biāo)化合物母離子能夠裂解為特定的碎片離子，進(jìn)一步確證化合物的結(jié)構(gòu)，可以有效避免假陽性結(jié)果，對于基質(zhì)復(fù)雜、干擾嚴(yán)重的痕量化合物能夠進(jìn)行很好的定性、定量，非常適用于中藥材樣品中多組分化合物的快速、準(zhǔn)確分析。本研究基于相關(guān)方法基礎(chǔ)[25-28]，建立UPLC-MS/MS同時測定多種酚類組分的方法，對鐵皮石斛莖、葉、花中酚類組分含量進(jìn)行測定，旨在為鐵皮石斛莖、葉、花營養(yǎng)功能成分的深入認(rèn)識提供數(shù)據(jù)支撐，為鐵皮石斛多樣性產(chǎn)品的開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鐵皮石斛莖、葉、花（干樣）采集于福建省龍巖市連城縣福建連天福生物科技有限公司鐵皮石斛生產(chǎn)基地。

3,5-二羥基苯甲酸、橘皮素、綠原酸、槲皮素、蘆丁、對羥基苯甲酸、2,5-二羥基苯甲酸、咖啡酸、丁香酸、香草酸、根皮苷、山柰酚、對香豆酸、芥子酸、阿魏酸、3-羥基肉桂酸、2-羥基肉桂酸、水楊酸（純度均不小于97%） 南京道斯夫生物技術(shù)股份限公司；甲醇、乙腈（均為色譜純） 德國Merck公司；乙酸銨、甲酸（LC-MS級） 美國Waters公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UPLC H-Class超高效液相色譜儀、Xevo TQ-S三重四極桿質(zhì)譜 美國Waters公司；Direct-Q5超純水儀美國Millipore公司；SYG-2水浴恒溫振蕩器 常州朗越儀器有限公司；KQ-600B型超聲清洗器 昆山市超聲儀器公司；XW-80A旋渦混合器 上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 UPLC條件

色譜柱：Waters T3 C18柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）；柱溫30.0 ℃；流速0.2 mL/min；進(jìn)樣量4 μL；流動相A為0.1%甲酸溶液，流動相B為乙腈；梯度洗脫程序：0～4 min，90%～30% A，10%～70% B；4～6 min，30% A，70% B；6～8 min，30%～50% A，70%～50% B；8～9 min，50%～90% A，50%～10% B；9～10 min，90% A，10% B。

1.3.2 MS條件

檢測方式：電噴霧離子源正、負(fù)離子模式，多反應(yīng)監(jiān)測；毛細(xì)管電壓1.5 kV；錐孔氣流：氮?dú)猓魉?0 L/h；脫溶劑溫度500 ℃，流速800 L/h；離子源溫度150 ℃；霧化氣壓力0.28 MPa；碰撞氣：高純氬氣。以500.0 μg/L的各酚類化合物的單標(biāo)溶液進(jìn)行質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化，確定特征母離子和子離子。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取3,5-二羥基苯甲酸等18 種標(biāo)準(zhǔn)品各10.0 mg，分別用甲醇溶解定容至10.00 mL，得到各化合物質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的單標(biāo)母液，稀釋母液配制10.0 mg/L的單標(biāo)中間液，于-20 ℃冰箱中保存。用于制作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的不同質(zhì)量濃度混標(biāo)溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.4 樣品前處理

鐵皮石斛中活性成分的提取參考黃琴等[23]的方法稍加改進(jìn)，稱取0.500 g磨碎的干燥的鐵皮石斛樣品加入5 mL 70%甲醇溶液于棕色玻璃管中，于70 ℃水浴中振蕩提取30 min，提取后自然冷卻至室溫，將提取液轉(zhuǎn)移至離心管中，5 000 r/min離心5 min，然后將上清液全部轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶。殘?jiān)偌尤? mL 70%甲醇溶液提取一次，重復(fù)以上操作。合并提取液定容至10.0 mL，搖勻，0.22 μm濾膜過濾，濾液待上機(jī)分析用。

1.4 數(shù)據(jù)處理

Excel 2007對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，每個樣品進(jìn)行3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)；DPS 7.05進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動相的選擇

實(shí)驗(yàn)中考察以甲醇-水和乙腈-水作為流動相以及在流動相中添加甲酸、乙酸銨對目標(biāo)化合物離子色譜峰峰形及響應(yīng)信號的影響。實(shí)驗(yàn)表明：采用0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸銨溶液和乙腈為流動相，在正、負(fù)離子掃描模式下，大多數(shù)酚類組分有良好的峰形。因此，實(shí)驗(yàn)中采用0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸銨溶液和乙腈作為流動相。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

表1 酚類化合物檢測的質(zhì)譜參數(shù)條件Table 1 Mass spectrometric parameters for detection of phenolic compounds

Waters三重四極桿質(zhì)譜條件的優(yōu)化主要包括選擇各化合物的母離子、子離子、錐孔電壓、碰撞能量等參數(shù)的確定。配制500.0 μg/L的18 種酚類組分單標(biāo)溶液，流動相A為0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸銨溶液，流動相B為乙腈（1∶1，V/V），標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)質(zhì)譜直接進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用電噴霧正離子模式和負(fù)離子模式通過自動調(diào)諧的方式分別對各化合物單標(biāo)溶液進(jìn)行母離子、子離子掃描。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)橘皮素、槲皮素、根皮苷在正離子掃描模式，更容易得到穩(wěn)定的母離子及子離子，響應(yīng)信號更好。而其他化合物則在負(fù)離子掃描模式下，更容易得到穩(wěn)定的母離子及子離子。優(yōu)化條件下相關(guān)質(zhì)譜檢測參數(shù)見表1，各化合物的多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖見圖1。

圖1 18種酚類化合物多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of 18 phenolic compounds

2.3 色譜柱的選擇

在實(shí)驗(yàn)中比較了分別使用Waters BEH C18柱和Waters T3 C18柱，在選用甲醇-水和乙腈-水不同流動相體系對18 種酚類組分的保留和分離情況。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Waters T3 C18對極性的酚類組分分離效果更好，具有更窄的峰形，因此實(shí)驗(yàn)中選用Waters T3 C18作為分離柱。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)的影響

基質(zhì)效應(yīng)是指樣品分析液中由于分析物以外的其他組分的作用影響了分析物的響應(yīng)值，從而影響定量分析的準(zhǔn)確度和重復(fù)性。因?yàn)榇郎y樣品中本身含有待測組分，為考察未知組分基質(zhì)的影響，采用標(biāo)準(zhǔn)添加法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)中，測定樣品中加入各待測組分2.00 mg/kg和5.00 mg/kg的響應(yīng)值，2 次測得的響應(yīng)值之差記為C，實(shí)際加入的標(biāo)準(zhǔn)溶液理論值之差記為C0。平行測定6 次，取平均值，用C/C0的比值確定基質(zhì)效應(yīng)。比值越接近1，基質(zhì)效應(yīng)越小。斜率比在0.80～1.20之間，則認(rèn)為基質(zhì)效應(yīng)影響不明顯；反之，則認(rèn)為基質(zhì)效應(yīng)對定量檢測具有較大的影響，不可忽略。如表2所示，對大部分待測物鐵皮石斛樣品的基質(zhì)抑制效應(yīng)影響不明顯。

表2 基質(zhì)效應(yīng)的影響Table 2 Evaluation of matrix effect

2.5 線性范圍、檢測限和定量限結(jié)果

按照目標(biāo)化合物離子的響應(yīng)情況，配制不同質(zhì)量濃度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照優(yōu)化的條件進(jìn)樣，以標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（x，μg/L）與對應(yīng)的峰面積（y）建立標(biāo)準(zhǔn)曲線得出線性回歸方程。如表3所示，在2.5～8 000 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，各目標(biāo)化合物線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.996 1～0.999 8。方法的檢出限和定量限分別為0.4～5.6 μg/L和1.2～15.2 μg/L。

表3 18種目標(biāo)化合物檢測的方法學(xué)驗(yàn)證Table 3 Figures of merit for the determination of 18 analytes by UPLC-MS/MS

2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

分別稱取鐵皮石斛莖、葉、花樣品，稱取0.500 g平行6 份，精密稱量，按照1.3.4節(jié)方法進(jìn)行樣品前處理，將制備的待測液進(jìn)行UPLC-MS/MS分析，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程得出待測物含量及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），檢出分析物的RSD均小于5.2%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.7 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

低、中、高水平加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)重復(fù)6 次。根據(jù)樣品中酚類化合物的含量及各化合物的線性范圍，確定各化合物在基質(zhì)中合適的加標(biāo)量；對未檢出的組分在定量限水平參考GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》中要求進(jìn)行加標(biāo)。加標(biāo)實(shí)驗(yàn)平均回收率為73.4%～99.8%，RSD為1.2%～8.9%，見表4。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明分析方法準(zhǔn)確度較好，能滿足檢測的要求。

表4 酚類化合物的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)Table 4 Spiked recoveries and relative standard deviations of phenolic compounds

2.8 鐵皮石斛莖、葉、花中酚類組分含量的檢測分析

按建立的UPLC-MS/MS法對鐵皮石斛莖、葉、花各部分的酚類化合物成分進(jìn)行檢測分析，每個樣品重復(fù)測定3 次。如表5所示，在鐵皮石斛樣品中共檢出15 種酚類化合物，相對于其他酚類組分，蘆丁在鐵皮石斛莖、葉、花中的含量均為最高，其中鐵皮石斛莖、葉、花中蘆丁的含量分別為（60.74±1.88）、（107.24±9.89）、（145.21±9.26）mg/kg，三者之間存在極顯著性差異（P＜0.01）。鐵皮石斛不同部位多酚組分含量為花＞葉＞莖；鐵皮石斛不同部位主要酚類組分表現(xiàn)出一定的差別：鐵皮石斛花中含量較高的為蘆丁、咖啡酸、阿魏酸和對羥基苯甲酸，鐵皮石斛葉中蘆丁和阿魏酸的含量相對較高，而在鐵皮石斛莖部主要酚類組分則為蘆丁、阿魏酸與香草酸。

表5 鐵皮石斛樣品中酚類化合物含量Table 5 Contents of phenolic compounds in D. officinale samples as determined by UPLC-MS/MS mg/kg

鐵皮石斛位居“九大仙草之首”，因其較高的保健作用與藥用價值，在《中國藥典》中單列以區(qū)別于其他石斛。鐵皮石斛中石斛多糖的含量較高，《中國藥典》中以石斛多糖和甘露糖作為鐵皮石斛質(zhì)量控制的指標(biāo)。隨著鐵皮石斛多樣性產(chǎn)品的開發(fā)，對鐵皮石斛莖部以外的部分如葉、花材料的化學(xué)成分的研究也逐漸加深。酚類是植物中的天然抗氧化劑，被認(rèn)為與清除自由基、抗氧化、抗衰老相關(guān)。鐵皮石斛莖、花部位含有較為豐富的酚類及黃酮類物質(zhì)[22-24]，黃琴等[23]的研究表明鐵皮石斛不同極性提取物具有較強(qiáng)的體外抗氧化活性，且各提取物抗氧化活性與總酚含量和總黃酮含量之間有明顯的相關(guān)性，說明酚類或黃酮類成分是鐵皮石斛抗氧化活性的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。近年研究表明，石斛酚類化合物中雙聯(lián)芐類化合物具有良好的生物活性[29]，不同結(jié)構(gòu)的酚類化合物的生物活性也有一定的差異。有關(guān)鐵皮石斛中酚類物質(zhì)具體組分的研究較少，分析探究鐵皮石斛不同部位抗氧化活性成分如酚類與黃酮類物質(zhì)的具體組成，對于鐵皮石斛資源藥用價值的探究具有一定的參考作用。

在石斛樣品不同部分中各檢測組分的含量，蘆丁最高，阿魏酸、對羥基苯甲酸、咖啡酸等亦有較高含量，分析所得的鐵皮石斛莖中酚類組分含量高低與呂朝耕[10]、李巖[12]等報道的數(shù)據(jù)結(jié)果較為一致。而本研究通過鐵皮石斛莖、葉、花中酚類組分的比較也表明，鐵皮石斛花中蘆丁、阿魏酸、對羥基苯甲酸的含量均高于鐵皮石斛莖部位，從抗氧化性活性組分的利用方面考慮，將鐵皮石斛花材料作為莖的補(bǔ)充材料加以利用具有一定的實(shí)際意義。

3 結(jié) 論

通過對色譜、質(zhì)譜條件的優(yōu)化，建立同時、快速檢測18 種酚類化合物的UPLC-MS/MS法，并用所建立的方法分析鐵皮石斛莖、葉、花中酚類組分的含量。鐵皮石斛不同部位多酚組分含量為花＞葉＞莖，相對于其他酚類組分，蘆丁在鐵皮石斛莖、葉、花中的含量均為最高。鐵皮石斛不同部位主要酚類組分的含量表現(xiàn)出顯著性差異：鐵皮石斛花中主要含有蘆丁、咖啡酸、阿魏酸和對羥基苯甲酸，鐵皮石斛葉中蘆丁和阿魏酸的含量相對較高，而鐵皮石斛莖部主要酚類組分則為蘆丁、阿魏酸與香草酸。這些酚類物質(zhì)可能與鐵皮石斛的抗氧化、增強(qiáng)免疫力、抗種類等功效有密切關(guān)系。研究結(jié)果有利于對鐵皮石斛中活性組分的深入研究，對鐵皮石斛多樣性產(chǎn)品的開發(fā)利用也有一定的參考價值。