紅樹莓果汁降酸發(fā)酵過(guò)程中活性成分的變化

陳思睿，唐 瑩，董 丹，蔣 瑩，何紅英，王金玲,2,*

（1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江省森林食品資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150040）

紅樹莓屬薔薇科（Rosaceae）懸鉤子屬（RubusL.）植物，果實(shí)中含有豐富的類黃酮、酚酸、丹寧等酚類化合物[1]，具有抗氧化[2]、抗炎、降血脂、降血糖等多種功效[3]。樹莓酮是紅樹莓的特征性香氣成分，能夠提供甜果香并具有一定預(yù)防肥胖和降血脂作用[4]。這些成分是影響紅樹莓功能和營(yíng)養(yǎng)特性的重要因素[5]。

紅樹莓適合進(jìn)行多類型的食品開發(fā)利用，然而高檸檬酸含量[6]影響了其口感風(fēng)味，限制了相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)。生物降酸是指利用能以有機(jī)酸為碳源的微生物，分解果汁或果酒中的有機(jī)酸，是一種有效的降酸方法，同時(shí)還能夠增加果汁或果酒的風(fēng)味[7]。降酸菌發(fā)酵動(dòng)態(tài)過(guò)程中，果汁中營(yíng)養(yǎng)成分會(huì)隨之發(fā)生變化。生物降酸的研究集中在總酸和有機(jī)酸含量的變化，而降酸對(duì)活性成分影響的研究很少。馬旭藝[8]對(duì)山葡萄酒采用化學(xué)法協(xié)同生物法降酸，僅研究了有機(jī)酸含量和比例組成的變化。李靜[9]在獼猴桃酒中接入植物乳桿菌降解蘋果酸，僅對(duì)成品的總酚含量進(jìn)行了測(cè)定。

本研究探討利用陸生伊薩酵母（Issatchenkia terricola）WJL-G4菌株降酸過(guò)程對(duì)紅樹莓果汁中活性成分的影響，測(cè)定發(fā)酵過(guò)程中活性成分的變化，采用相關(guān)性分析和主成分分析（principal component analysis，PCA）法分析發(fā)酵過(guò)程與活性成分之間的關(guān)系，以期為闡明該降酸菌的發(fā)酵特征及其在高酸果汁降酸的應(yīng)用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅樹莓：品種為秋福，購(gòu)于黑龍江省尚志市，速凍處理后運(yùn)回東北林業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程實(shí)驗(yàn)室凍藏。

降酸酵母菌：由本實(shí)驗(yàn)室在紅樹莓鮮果中篩選分離得到，經(jīng)菌株形態(tài)學(xué)觀察、生理生化實(shí)驗(yàn)和分子生物學(xué)鑒定為陸生伊薩酵母，命名為陸生伊薩酵母WJL-G4[10]，以下簡(jiǎn)稱為降酸菌。

檸檬酸培養(yǎng)基：(NH4)2SO42 g，KH2PO42.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1 g，酵母膏0.5 g，檸檬酸20 g，瓊脂粉25 g，溶于1 L蒸餾水。

熊果苷、沒(méi)食子酸、隱綠原酸、對(duì)羥基苯甲酸、綠原酸、新綠原酸、咖啡酸、表兒茶素、丁香酸、對(duì)香豆酸、樹莓酮、芥子酸、金絲桃苷、蘆丁、鞣花酸、槲皮素、木犀草素、黃芩素（分析標(biāo)準(zhǔn)品） 上海源葉生物科技有限公司；甲醇（色譜純） 賽默飛世爾（中國(guó)）有限公司；甲酸（色譜純） 天津市大茂化學(xué)試劑廠；常規(guī)藥品試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1FD型單人凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；DH6000A型電熱恒溫培養(yǎng)箱 天津市泰斯特儀器有限公司；5030-PVL型高壓滅菌鍋 長(zhǎng)春百奧生物儀器有限公司；721N型可見分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；1260 Infinity II高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 美國(guó)安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 紅樹莓果汁的降酸處理

紅樹莓凍果自然解凍后，打漿1 min，果膠酶（40 000 U/g）添加量為0.02%（m/m），50 ℃酶解2 h。酶解后90 ℃滅酶5 min，8 層紗布過(guò)濾取果汁，置于滅菌錐形瓶中，巴氏殺菌后冷卻。

處理組：菌株接種于裝有100 mL檸檬酸培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，28 ℃、120 r/min培養(yǎng)24 h制成種子液，將活菌數(shù)為8×107CFU/mL的降酸菌種子液，以接種量4%（V/V）接種于上述紅樹莓果汁中，果汁裝液量為50 mL/250 mL錐形瓶，于28 ℃靜置培養(yǎng)8 d。

對(duì)照組：以在相同培養(yǎng)條件放置的未接種的紅樹莓果汁作為對(duì)照。

發(fā)酵所使用的紅樹莓果汁總酸質(zhì)量濃度為25.16 g/L，pH值為3.08。前期實(shí)驗(yàn)得出，以8 d為降酸發(fā)酵周期，總酸降酸率可達(dá)60.41%，pH值可由3.08上升為3.36[10]，本實(shí)驗(yàn)的處理組和對(duì)照組在降酸發(fā)酵的第0、1、2、3、4、5、6、7、8天取樣，進(jìn)行測(cè)定。

1.3.2 活性成分測(cè)定

總酚測(cè)定采用Folin-Ciocalteu比色法[11]，765 nm波長(zhǎng)處吸光度為y，沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度為x（μg/mL），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得到：y=0.007 2x+0.033 7，R2=0.993 5；總黃酮測(cè)定采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法[12]，510 nm波長(zhǎng)處吸光度為y，蘆丁質(zhì)量濃度為x（μg/mL），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得到：y=0.001x+0.071 3，R2=0.996 2；花色苷測(cè)定采用pH值示差法[13]。

1.3.3 HPLC分析

色譜柱：Agilent ZORBAX Extend-C18（250 mm×4.6 mm）；流動(dòng)相：A為甲醇，B為0.02%甲酸溶液；梯度洗脫程序：0～5 min，0～10% A，100%～90% B；5～10 min，10%～20% A，90%～80% B；10～20 min，20%～35% A，80%～65% B；20～35 min，35%～40% A，65%～60% B；35～40 min，40%～75% A，60%～25% B；40～45 min，75%～10% A，25%～90% B；流速：0.8 mL/min，進(jìn)樣量：10 μL，柱溫：35 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm。依次測(cè)定標(biāo)樣系列和樣品。用標(biāo)樣濃度對(duì)峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定樣品中的活性成分含量。

標(biāo)準(zhǔn)曲線：分別用甲醇溶解標(biāo)準(zhǔn)品配制成不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)行HPLC分析，得到峰面積（x）和活性成分質(zhì)量濃度（y）的回歸方程及相關(guān)系數(shù)。

樣品處理：果汁樣品4 000 r/min離心15 min，吸取上清液，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后測(cè)定。

1.3.4 分析方法

1.3.4.1 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3 次重復(fù)，采用Excel軟件對(duì)測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行整理統(tǒng)計(jì)，計(jì)算活性成分的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差。采用Origin 8.5軟件進(jìn)行作圖。采用SPSS 19.0軟件中Duncan法進(jìn)行多重差異顯著性分析[14]。

1.3.4.2 適用性檢驗(yàn)

采用SPSS 19.0分析軟件中的Pearson分析法對(duì)活性成分的含量進(jìn)行相關(guān)系數(shù)矩陣的直觀檢驗(yàn)，根據(jù)相關(guān)系數(shù)矩陣中相關(guān)系數(shù)反映出的原始變量之間的線性相關(guān)程度進(jìn)行適用性檢驗(yàn)[15]。

1.3.4.3 PCA

采用SPSS 19.0分析軟件對(duì)活性成分的含量進(jìn)行PCA，得到解釋的總方差表，其中包括相關(guān)矩陣的特征值、方差貢獻(xiàn)率、累計(jì)方差貢獻(xiàn)率，抽取其中特征值大于1.00的因子作為PC。根據(jù)載荷向量、得分等對(duì)發(fā)酵過(guò)程中紅樹莓果汁活性成分進(jìn)行分析。PCA載荷向量除以方差的算術(shù)平方根得到系數(shù)（特征向量），根據(jù)系數(shù)得到PC的函數(shù)表達(dá)式[16]，計(jì)算各PC得分并制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 降酸菌對(duì)紅樹莓果汁活性成分的影響

發(fā)酵所使用的紅樹莓果汁總酚質(zhì)量濃度為1.33 mg/mL，總黃酮質(zhì)量濃度為0.69 mg/mL，花色苷質(zhì)量濃度為30.22 mg/L。在28 ℃靜置發(fā)酵8 d，以未接菌的紅樹莓果汁為對(duì)照，測(cè)定發(fā)酵過(guò)程中不同時(shí)間所取樣品中總酚、總黃酮和花色苷含量。

由圖1A可知，處理組和對(duì)照組總酚含量在發(fā)酵0～2 d顯著降低（P＜0.05），在第3天時(shí)二者相差不大；4～7 d處理組含量略高于對(duì)照組。發(fā)酵8 d，處理組總酚質(zhì)量濃度為0.95 mg/mL，對(duì)照組為1.04 mg/mL，分別為初始質(zhì)量濃度的71.87%和78.38%。與對(duì)照組對(duì)比可知處理組在0～2 d總酚含量顯著降低（P＜0.05）的原因可能包括菌株發(fā)酵和放置環(huán)境，菌株生長(zhǎng)繁殖代謝產(chǎn)生的酶，會(huì)分解多酚等大分子物質(zhì)[17]；趙玉等[18]研究指出多酚在高溫、過(guò)酸或過(guò)堿、光照條件下含量均顯著降低，且多酚同樣對(duì)溫度和光照敏感；趙廣河等[19]研究表示有些發(fā)酵過(guò)程會(huì)導(dǎo)致丹寧的溶出、酸性環(huán)境下多酚分子重排、多酚的自聚合及與其他大分子的互作。

由圖1B可知，處理組總黃酮含量先減少后上升，第7天與第0天相比總黃酮含量顯著升高（P＜0.05），對(duì)照組發(fā)酵過(guò)程沒(méi)有顯著變化（P＞0.05）。發(fā)酵8 d，處理組總黃酮質(zhì)量濃度為0.77 mg/mL，對(duì)照組為0.67 mg/mL，分別為初始質(zhì)量濃度的111.32%和97.04%，處理組與對(duì)照組相比含量升高。降酸處理后總黃酮含量增加可能是因?yàn)榻湍妇拇x活動(dòng)起到促進(jìn)作用，酶促反應(yīng)有利于黃酮的釋放[20]，也可能是經(jīng)酵母菌代謝其他物質(zhì)轉(zhuǎn)化而來(lái)。有研究表明，微生物可合成黃酮類物質(zhì)或者改善合成途徑[21]。Cao Hui等[22]指出動(dòng)物雙歧桿菌可以改變綠茶多酚中黃酮類化合物，說(shuō)明某些微生物生物轉(zhuǎn)化能夠產(chǎn)生黃酮類物質(zhì)。

圖1 降酸發(fā)酵過(guò)程中紅樹莓果汁中活性成分變化Fig.1 Variation of bioactive components in red raspberry juice during fermentation

由圖1C可知，處理組和對(duì)照組花色苷含量均呈逐漸下降趨勢(shì)，5 d后含量均無(wú)顯著變化（P＞0.05）。發(fā)酵8 d，處理組質(zhì)量濃度為21.92 mg/L，對(duì)照組為22.54 mg/L，分別為初始質(zhì)量濃度的72.51%和74.59%。處理組與對(duì)照組對(duì)比可知，含量下降程度相似，因此認(rèn)為降酸發(fā)酵對(duì)花色苷影響小，主要是環(huán)境因素導(dǎo)致花色苷損失。Turker等[23]研究發(fā)現(xiàn)，25 ℃貯藏90 d的胡蘿卜中花色苷隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，單體花色苷含量和色度降低，花色苷降解后生成聚合物進(jìn)而導(dǎo)致褐變。本實(shí)驗(yàn)降酸發(fā)酵溫度為28 ℃，此溫度下放置可能導(dǎo)致花色苷受溫度影響含量降低。

2.2 HPLC分析

標(biāo)準(zhǔn)品和0 d紅樹莓果汁的HPLC如圖2所示。在45 min內(nèi)，各種活性成分能得到較好分離，從紅樹莓果汁中共檢測(cè)出18 種活性成分，通過(guò)色譜峰與標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間的對(duì)照，確定圖2中的1～18峰分別為熊果苷、沒(méi)食子酸、隱綠原酸、對(duì)羥基苯甲酸、綠原酸、新綠原酸、咖啡酸、表兒茶素、丁香酸、對(duì)香豆酸、樹莓酮、芥子酸、金絲桃苷、蘆丁、鞣花酸、槲皮素、木犀草素和黃芩素?？梢苑诸悶?0 種酚酸（峰2、3、4、5、6、7、9、10、12、15）[24]、7 種類黃酮（峰1、8、13、14、16、17、18）和芳香類化合物樹莓酮（峰11）。王錕等[25]從樹莓酒中測(cè)出21 種多酚類物質(zhì)，其中包括蘆丁、對(duì)羥基苯甲酸、綠原酸、鞣花酸、槲皮素、沒(méi)食子酸、咖啡酸、對(duì)香豆酸和芥子酸。孫僑冶[26]利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)從“秋?！奔t樹莓果實(shí)中共鑒定出5 種非花色苷酚類物質(zhì)，分別為咖啡酸、兒茶素、香草酸、鞣花酸和槲皮素。Lugasi等[2]通過(guò)反相HPLC對(duì)紅樹莓中黃酮類物質(zhì)進(jìn)行定量，檢測(cè)到鞣花酸和槲皮素，未檢測(cè)到木犀草素。本研究測(cè)定結(jié)果基本涵蓋了上述種類。

表1 紅樹莓果汁降酸發(fā)酵過(guò)程中活性成分的組成和含量Table 1 Contents of bioactive components in red raspberry juice during fermentation

由表1可知，在紅樹莓果汁降酸發(fā)酵過(guò)程中，活性成分呈現(xiàn)幾種不同的變化趨勢(shì)，且與總酚和總黃酮含量變化相似。其中熊果苷、沒(méi)食子酸、對(duì)羥基苯甲酸、綠原酸、新綠原酸、咖啡酸、表兒茶素、丁香酸和鞣花酸含量顯著降低（P＜0.05）；隱綠原酸、對(duì)香豆酸、樹莓酮、蘆丁和槲皮素含量顯著升高（P＜0.05）；芥子酸含量先升高后降低；金絲桃苷、木犀草素、黃芩素?zé)o顯著性變化（P＞0.05）。作為對(duì)照的果汁在靜置過(guò)程中，熊果苷、沒(méi)食子酸、對(duì)羥基苯甲酸、綠原酸、新綠原酸、咖啡酸、丁香酸和鞣花酸的含量顯著降低（P＜0.05）；對(duì)香豆酸、蘆丁和槲皮素含量顯著升高（P＜0.05）；芥子酸含量先降低再升高后穩(wěn)定，樹莓酮含量略微下降后保持在相對(duì)穩(wěn)定水平；隱綠原酸、表兒茶素和金絲桃苷含量變化無(wú)顯著性（P＞0.05）；木犀草素和黃芩素含量呈波動(dòng)變化且無(wú)顯著性差異（P＞0.05），未檢出槲皮素。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)品混合液（a、b）和紅樹莓果汁中活性成分（c）的HPLC圖Fig.2 HPLC chromatograms of mixed reference substances (a, b)and bioactive components in red raspberry juice (c)

第8天處理組和對(duì)照組中，顯著下降（P＜0.05）的成分含量保留率分別為：熊果苷為95.12%和90.00%、沒(méi)食子酸為87.63%和84.83%、對(duì)羥基苯甲酸為67.15%和76.57%、綠原酸為86.60%和89.44%、新綠原酸為88.56%和69.81%、咖啡酸為80.61%和67.34%、丁香酸為83.16%和89.12%、鞣花酸為94.08%和97.20%，說(shuō)明環(huán)境因素是導(dǎo)致這些成分下降的主要原因。對(duì)羥基苯甲酸、綠原酸、丁香酸和鞣花酸保留率比對(duì)照略低，說(shuō)明這些成分也受到降酸發(fā)酵的影響。原因可能是總酸含量的下降會(huì)對(duì)酚類化合物的穩(wěn)定性造成影響，導(dǎo)致部分酚類化合物含量降低，其次可能是因酵母生長(zhǎng)代謝被消耗或轉(zhuǎn)化為其他化合物。有研究表明，沒(méi)食子酸和對(duì)羥基苯甲酸經(jīng)過(guò)發(fā)酵后含量會(huì)減少[27]；綠原酸是多酚氧化酶在有氧條件下的主要底物，綠原酸的減少可能是由于在多酚氧化酶存在下的酸降解[28]；Clark等[29]研究發(fā)現(xiàn)白葡萄酒中的黃烷醇型酚類化合物例如表兒茶素會(huì)發(fā)生氧化反應(yīng)，隨后發(fā)生聚合反應(yīng)；芥子酸是常見的肉桂酸型酚酸[30]，羥基肉桂酸易與其他物質(zhì)形成酯的形式存在[31]；鞣花酸常以不同形式存在，如鞣花鞣質(zhì)、鞣花酸糖苷等，很少是游離鞣花酸[32]，有些酵母產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物與鞣花酸結(jié)合產(chǎn)生沉淀[33]，導(dǎo)致其含量降低。還有部分成分含量有所提升，蘆丁和隱綠原酸含量明顯增加；槲皮素含量升高推測(cè)是由其他物質(zhì)如肉桂酸和柚皮苷等經(jīng)過(guò)生化代謝途徑轉(zhuǎn)化而來(lái)[34]，部分蘆丁發(fā)生降解，槲皮素含量也會(huì)增加[35]；姜燕等[4]探討樹莓酒在主發(fā)酵期間樹莓酮含量的變化，采用HPLC測(cè)定樹莓酮含量有所提高，說(shuō)明微生物發(fā)酵可以提高樹莓酮的含量。樹莓酮是具有典型樹莓風(fēng)味特征的關(guān)鍵風(fēng)味成分[36]，其含量的提高對(duì)果汁整體風(fēng)味有積極作用。

表2 相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis

2.3 降酸發(fā)酵中紅樹莓果汁活性成分的PCA

2.3.1 適用性分析

PCA將原來(lái)眾多具有一定相關(guān)性的指標(biāo)進(jìn)行簡(jiǎn)化，重新組合成一組新的互相無(wú)關(guān)的綜合指標(biāo)代替原來(lái)的指標(biāo)[37]，以解決多重相關(guān)性問(wèn)題的目的。相關(guān)性分析能夠反映各活性成分間密切程度，活性成分相關(guān)系數(shù)矩陣直觀檢驗(yàn)結(jié)果如表2所示，除金絲桃苷外，其他酚酸物質(zhì)、類黃酮物質(zhì)和樹莓酮的含量之間存在普遍顯著正相關(guān)或負(fù)相關(guān)關(guān)系，多數(shù)成分之間的相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值大于0.5[15]，表明活性成分含量之間有較強(qiáng)相關(guān)性，可以通過(guò)PCA方法研究紅樹莓果汁中活性成分與降酸發(fā)酵的關(guān)系。

2.3.2 PCA

根據(jù)表1顯示的活性成分質(zhì)量濃度，用于PCA。由表3可知，提取出的3 個(gè)PC的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為93.098%＞80%，即可解釋原變量93.098%的信息且基本反映了所有原變量的信息。以這3 個(gè)PC作為數(shù)據(jù)分析的有效成分，生成的PC載荷矩陣，其絕對(duì)值越大，對(duì)該P(yáng)C影響越主要[38]。PC1的特征值為13.749，貢獻(xiàn)率為76.382%，代表了全部信息的76.382%，主要反映了熊果苷、沒(méi)食子酸、隱綠原酸、對(duì)羥基苯甲酸、綠原酸、新綠原酸、咖啡酸、表兒茶素、丁香酸、對(duì)香豆酸、樹莓酮、芥子酸、蘆丁、鞣花酸、槲皮素的含量，PC1與熊果苷、沒(méi)食子酸、對(duì)羥基苯甲酸、綠原酸、新綠原酸、咖啡酸、表兒茶素、丁香酸、芥子酸和鞣花酸高度正相關(guān)，與隱綠原酸、對(duì)香豆酸、樹莓酮、蘆丁和槲皮素高度負(fù)相關(guān)，對(duì)PC1貢獻(xiàn)最大的為對(duì)羥基苯甲酸和表兒茶素，載荷量分別為0.988和0.980，對(duì)PC1貢獻(xiàn)最小的是樹莓酮，載荷量為-0.973（表4）；PC2的特征值為1.715，貢獻(xiàn)率為9.528%，主要代表金絲桃苷和木犀草素的含量；PC3特征值為1.294，貢獻(xiàn)率為7.188%。

表3 PC特征值及解釋的總方差Table 3 Eigenvalues and total variance explained in principal components analysis

表4 PC載荷矩陣和特征向量Table 4 PC loading matrix with eigenvectors

PC的特征向量如表4所示。可利用F1、F2和F3這3 個(gè)新的綜合指標(biāo)替代原來(lái)的18 個(gè)指標(biāo)對(duì)紅樹莓果汁中活性成分進(jìn)行分析。PC1的特征向量分別乘以18 個(gè)原始變量標(biāo)準(zhǔn)化之后的變量即為PC1的函數(shù)表達(dá)式，同理可以得出PC2、PC3的函數(shù)表達(dá)式，計(jì)算整理得到的3 個(gè)PC的函數(shù)表達(dá)式分別如下（其中Z熊果苷～Z黃芩素為標(biāo)準(zhǔn)化變量）：

圖3 降酸發(fā)酵過(guò)程中活性成分散點(diǎn)圖Fig.3 Scatter plots of principal components 1 versus 2 for bioactive ingredients in red raspberry juice during fermentation

圖4 PCA得分圖Fig.4 Score plot of principal component analysis

保留前2 個(gè)PC簡(jiǎn)化結(jié)果，紅樹莓果汁在降酸過(guò)程中活性成分的PC1和PC2相關(guān)散點(diǎn)圖和PCA得分圖如圖3、4所示，其中發(fā)酵2 d和3 d的紅樹莓果汁分布在PC1和PC2的正向區(qū)間，熊果苷、沒(méi)食子酸、對(duì)羥基苯甲酸、綠原酸、新綠原酸、咖啡酸、表兒茶素、丁香酸、芥子酸、鞣花酸和黃芩素在PC1和PC2上呈正向分布，即這些活性成分和發(fā)酵2 d和3 d的紅樹莓果汁均與PC1、PC2呈正相關(guān)；發(fā)酵5 d和8 d的紅樹莓果汁分布在第2象限，說(shuō)明其與PC1呈負(fù)相關(guān)，與PC2呈正相關(guān)，隱綠原酸、對(duì)香豆酸、樹莓酮、蘆丁和槲皮素在PC1為負(fù)向分布，即于坐標(biāo)軸原點(diǎn)遠(yuǎn)端發(fā)酵8 d的紅樹莓果汁中，這些成分較為豐富；發(fā)酵6 d和7 d的紅樹莓果汁和隱綠原酸、對(duì)香豆酸、樹莓酮、蘆丁和槲皮素均分布在PC1和PC2的負(fù)向區(qū)間，均與PC1、PC2呈負(fù)相關(guān)，即于坐標(biāo)軸原點(diǎn)遠(yuǎn)端發(fā)酵7 d的紅樹莓果汁中，這些成分較為豐富；發(fā)酵0、1 d和4 d的紅樹莓果汁處于第4象限，與PC1呈正相關(guān)，與PC2呈負(fù)相關(guān)，熊果苷、沒(méi)食子酸、對(duì)羥基苯甲酸、綠原酸、新綠原酸、咖啡酸、表兒茶素、丁香酸、芥子酸、鞣花酸和黃芩素在PC1上呈正向分布，即于坐標(biāo)軸原點(diǎn)遠(yuǎn)端發(fā)酵0 d和1 d的紅樹莓果汁中，這些成分含量較多，而隱綠原酸、對(duì)香豆酸、樹莓酮、蘆丁和槲皮素含量較低。由于PC1能夠代表絕大多數(shù)的活性成分的信息，對(duì)得分的影響最大，可以選擇處于PC1正向區(qū)間的發(fā)酵時(shí)間，即降酸發(fā)酵1～4 d，能夠保證絕大多數(shù)成分的保留。

3 結(jié)論與討論

陸生伊薩酵母WJL-G4在降酸發(fā)酵過(guò)程中，紅樹莓果汁總酚和花色苷含量呈現(xiàn)逐漸下降趨勢(shì)，與對(duì)照果汁趨勢(shì)相似，總黃酮含量明顯增加。采用HPLC測(cè)定降酸過(guò)程和對(duì)照的果汁中活性成分，共鑒定出10 種酚酸、7 種類黃酮、1 種芳香類化合物。顯著下降（P＜0.05）的成分中，熊果苷、沒(méi)食子酸、新綠原酸和咖啡酸完全受環(huán)境因素影響；對(duì)羥基苯甲酸、綠原酸、丁香酸和鞣花酸主要受環(huán)境因素影響，其次受降酸發(fā)酵影響；表兒茶素主要受降酸發(fā)酵影響。處理組中，隱綠原酸、對(duì)香豆酸、樹莓酮、蘆丁和槲皮素含量增加；芥子酸含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)；金絲桃苷、木犀草素、黃芩素含量基本保持穩(wěn)定。黃鷺強(qiáng)[39]將具有降解蘋果酸能力的重組酵母菌投放于枇杷原酒進(jìn)行降酸發(fā)酵，24 ℃條件下發(fā)酵5 d，降酸量達(dá)1.80 g/L，降酸處理后2 種枇杷酒總黃酮質(zhì)量濃度略微下降，分別由0.87 mg/L下降為0.81 mg/L，0.91 mg/L下降為0.84 mg/L；孫慧燁[40]利用植物乳桿菌降解蘋果酒中蘋果酸，降酸率達(dá)到31.5%，總酚質(zhì)量濃度由1 217.865 mg/L下降為1 138.090 mg/L，均說(shuō)明降酸發(fā)酵對(duì)活性成分略有影響。

對(duì)紅樹莓果汁中18 種活性成分進(jìn)行PCA，提取的3 個(gè)PC反映原變量93.098%的信息，通過(guò)PC1和PC2的載荷分布圖和得分圖得出，隨著發(fā)酵進(jìn)行，PC1（76.382%）得分逐漸下降，總體得分也呈逐漸下降趨勢(shì)，降酸發(fā)酵1～4 d分布于PC1的正向區(qū)間，得分較高。說(shuō)明隨著菌株發(fā)酵時(shí)間越長(zhǎng)，紅樹莓果汁活性成分的變化也越大，可以選擇在1～4 d范圍內(nèi)結(jié)束降酸，保證活性成分含量的較高水平。通過(guò)PCA能為降酸發(fā)酵前后果汁中活性成分含量變化提供一定參考依據(jù)，在后續(xù)研究中可以加入感官評(píng)價(jià)和香氣物質(zhì)等指標(biāo)更全面地描述降酸發(fā)酵對(duì)果汁品質(zhì)的影響，上述問(wèn)題將在后續(xù)研究中繼續(xù)探討。