傳統(tǒng)酸面團(tuán)菌群結(jié)構(gòu)及其酵制饅頭風(fēng)味物質(zhì)分析

李曉敏，韓 偉，黎 琪，王 晴，檀馨悅，鄒球龍，張曉琳,*

（1.中糧營(yíng)養(yǎng)健康研究院有限公司，營(yíng)養(yǎng)健康與食品安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，老年?duì)I養(yǎng)食品研究北京市工程實(shí)驗(yàn)室，北京 102209；2.國(guó)家糧食和物資儲(chǔ)備局科學(xué)研究院，北京 100037）

饅頭是我國(guó)特有的蒸制面食品，具有結(jié)構(gòu)緊密、口感適宜、便于消化、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的特點(diǎn)，深受我國(guó)人民喜愛(ài)[1]。與如今普遍使用商業(yè)化酵母發(fā)酵不同，傳統(tǒng)饅頭發(fā)酵使用的是自然發(fā)酵酸面團(tuán)。自然發(fā)酵酸面團(tuán)是取自上次發(fā)酵后經(jīng)妥善保存的少量樣品，即民間所謂“老面”、“面肥”、“面頭”、“酵子”、“酵面”和“面起子”[2]。

酸面團(tuán)發(fā)酵是一種古老的食品生物技術(shù)，因近年發(fā)現(xiàn)其對(duì)烘焙食品的感官、結(jié)構(gòu)、營(yíng)養(yǎng)及貨架期等均有積極意義而被重新審視[3-4]。酸面團(tuán)中復(fù)雜的乳酸菌組成與傳統(tǒng)發(fā)酵饅頭的風(fēng)味與口感直接相關(guān)。乳酸菌在發(fā)酵過(guò)程中會(huì)通過(guò)同型發(fā)酵和異型發(fā)酵產(chǎn)生非揮發(fā)性有機(jī)酸，并在發(fā)酵過(guò)程中與酵母菌互利共生，通過(guò)生化反應(yīng)產(chǎn)生醇、醛、酮、酯和羰基化合物，形成種類豐富的風(fēng)味物質(zhì)[5-6]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)于酸面團(tuán)菌群結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌有舊金山乳桿菌（Lactobacillus sanfranciscensis）、植物乳桿菌（L. plantarum）和類食品乳桿菌（L. paralimentarius）等，優(yōu)勢(shì)真菌有釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、扁平云假絲酵母（Candida humilis）、Kazachstania barnettii和K. exigua等，且微生物多樣性與原料，尤其是面粉種類存在一定相關(guān)性[7-8]。對(duì)酸面團(tuán)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，主要包括酮類、醇類、醛類、酸類和酯類化合物等，且采用的萃取檢測(cè)方法不同，風(fēng)味物質(zhì)的種類和含量也不同[9-10]。酸面團(tuán)作為一個(gè)微生態(tài)體系，菌群結(jié)構(gòu)復(fù)雜，在保存過(guò)程中菌群也在不斷變化，且各種微生物持續(xù)進(jìn)行如糖化反應(yīng)、蛋白質(zhì)分解、酯化反應(yīng)和產(chǎn)氣等一系列生化反應(yīng)，因此，采用酸面團(tuán)發(fā)酵技術(shù)制作饅頭難以保證產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性。目前利用該技術(shù)制作饅頭也僅限于手工限量生產(chǎn)，未廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中。與此同時(shí)，酸面團(tuán)發(fā)酵技術(shù)制作饅頭因其風(fēng)味和質(zhì)構(gòu)方面的優(yōu)勢(shì)，深受消費(fèi)者的喜愛(ài)。

本研究采用高通量測(cè)序手段解析傳統(tǒng)發(fā)酵酸面團(tuán)樣品中的微生物菌群結(jié)構(gòu)，得到優(yōu)勢(shì)菌群信息；同時(shí)運(yùn)用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜（headspace-solid phase microextraction-gas chromatograph-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）聯(lián)用技術(shù)分析其酵制饅頭風(fēng)味物質(zhì)成分，旨在探討酸面團(tuán)菌群結(jié)構(gòu)對(duì)風(fēng)味物質(zhì)的影響，為微生物菌群結(jié)構(gòu)影響風(fēng)味物質(zhì)形成的機(jī)理提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酸面團(tuán)分別采集自山西（SX）、河北（HB）、青海（QH）、甘肅（GS）和河南（HN）；小麥粉 北京古船食品有限公司。

MRS（Man Rogosa Sharpe）肉湯培養(yǎng)基（固體培養(yǎng)基添加1.5%的瓊脂）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)股份有限公司；E.Z.N.A.?Soil DNA Kit 美國(guó)Omega BioTek公司；其他試劑或藥品為國(guó)產(chǎn)分析純或化學(xué)純。

1.2 儀器與設(shè)備

S210 pH計(jì) 美國(guó)Mettler-Toledo公司；HJ-3數(shù)顯恒溫磁力攪拌器 常州榮華儀器制造有限公司；和面機(jī)美國(guó)北美電器；SMD-603S醒發(fā)箱 無(wú)錫勝麥機(jī)械有限公司；57330-U固相微萃取裝置、75 μm碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（carboxen/polydimethylsiloxane，CAR/PDMS）萃取頭 美國(guó)Supelco公司；GC-MS聯(lián)用儀日本Shimadzu公司；SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái) 蘇凈安泰空氣技術(shù)有限公司；LRH-250F型恒溫恒濕培養(yǎng)箱上海一恒科學(xué)儀器有限公司；HVE-50立式壓力蒸汽滅菌器 日本Hirayama公司。

1.3 方法

1.3.1 pH值和可滴定酸度（titratable acidity，TTA）的測(cè)定

稱取10 g酸面團(tuán)，加入90 mL去離子水，攪拌15 min至酸面團(tuán)完全混勻，測(cè)定pH值。以0.1 mol/L NaOH溶液滴定該懸濁液至pH 8.5時(shí)，消耗的NaOH溶液體積（mL）即為該樣品的TTA值。每個(gè)樣品平行測(cè)定3 次。

1.3.2 乳酸菌和酵母菌菌落數(shù)測(cè)定

稱取10 g酸面團(tuán)，加入90 mL質(zhì)量濃度為0.85 g/100 mL無(wú)菌生理鹽水，攪拌至酸面團(tuán)完全混勻，采用10 倍梯度稀釋，將稀釋液涂布于含有0.02%放線菌素的MRS培養(yǎng)基平板，37 ℃厭氧條件下恒溫培養(yǎng)48 h，記錄乳酸菌菌落數(shù)。將稀釋液涂布于含有0.03%鏈霉素PDA培養(yǎng)基平板，30 ℃恒溫培養(yǎng)60 h，記錄酵母菌菌落數(shù)。

1.3.3 菌群多樣性分析

根據(jù)E.Z.N.A.?Soil DNA Kit操作手冊(cè)提取酸面團(tuán)中微生物總DNA。采用338F-806R為引物擴(kuò)增16S rDNA V3-V4區(qū)序列。采用SSU 0817F-SSU 1196R為引物擴(kuò)增18S rDNA V4-V5區(qū)序列，將聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，Illumina MiSeq平臺(tái)測(cè)序。使用軟件UPARSE依據(jù)97%相似度對(duì)非重復(fù)序列進(jìn)行可操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚類。使用RDP Classifier貝葉斯算法對(duì)得到的OTU序列進(jìn)行分類學(xué)分析。

1.3.4 酸面團(tuán)發(fā)酵制作饅頭

稱取50 g酸面團(tuán)，加入300 mL去離子水，攪拌15 min至酸面團(tuán)完全混勻，再加入500 g面粉，混合均勻后揉至面團(tuán)表面光滑，放置在溫度37 ℃、相對(duì)濕度85%的醒發(fā)箱中醒發(fā)3 h，取出發(fā)酵膨脹的酸面團(tuán)，加入500 g面粉及3 g堿，揉勻后制成饅頭狀面坯，繼續(xù)在溫度37 ℃、相對(duì)濕度85%的醒發(fā)箱中醒發(fā)40 min，取出蒸汽條件下蒸制20 min，放冷后備用。

1.3.5 SPME-GC-MS檢測(cè)饅頭中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)

揮發(fā)性成分的萃?。悍Q取3 g饅頭樣品于15 mL樣品瓶中，將樣品瓶置于75 ℃水浴鍋內(nèi)，平衡30 min，將老化好的CAR/PDMS萃取頭插入樣品瓶的上空，75 ℃水浴鍋內(nèi)頂空萃取30 min后進(jìn)樣。每次萃取前，將萃取頭在250 ℃條件下洗脫10 min[10]。

GC條件：色譜柱為DB-5MS（60 m×0.32 mm，1 μm），載氣為 99.9999%高純氦氣，進(jìn)樣模式為不分流；柱箱升溫程序經(jīng)優(yōu)化為：初始爐溫50 ℃，保持2 min，以5 ℃/min升至220 ℃，保持3 min，再以3 ℃/min升至250 ℃，保持5 min。

MS條件：接口溫度280 ℃；連接桿溫度150 ℃；電子電離源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，采集方式為全掃描，質(zhì)量掃描范圍m/z40～550。

揮發(fā)性成分定性定量分析：GC-MS圖經(jīng)計(jì)算機(jī)和人工檢索把每個(gè)峰同時(shí)與NIST 08.Library和Wiley Library匹配，確定揮發(fā)性物質(zhì)的化學(xué)成分。峰面積表示物質(zhì)相對(duì)含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸面團(tuán)酸度與菌落總數(shù)分析

如表1所示，乳酸菌菌落數(shù)范圍為4.89～8.31（lg（CFU/g）），各地差異顯著（P＜0.05），以SX樣品最大，HN樣品最少。酵母菌菌落數(shù)變化范圍為4.75～6.08（lg（CFU/g）），SX和QH兩地樣品顯著高于其他地區(qū)（P＜0.05）。不同地區(qū)樣品乳酸菌和酵母的比例不同，SX和QH樣品中乳酸菌和酵母菌的比例大于100∶1，HB和GS樣品中兩者的比例為10∶1，而HN樣品中兩者的比例為1∶1，與其他研究結(jié)果一致[11-12]。由于SX和QH樣品中乳酸菌菌落數(shù)相對(duì)較高，則pH值較低，但所有樣品的pH值并無(wú)顯著性差異。所有樣品TTA值在3.73～4.30 mL（0.1 mol/L NaOH溶液）之間，SX和GS樣品的TTA值顯著高于其他樣品。結(jié)果表明傳統(tǒng)酸面團(tuán)樣品中富含乳酸菌和酵母菌，不同地區(qū)乳酸菌和酵母菌的含量和比例差異明顯，可能和當(dāng)?shù)氐牡乩砦恢?、氣候、面粉種類和發(fā)酵程度等因素有關(guān)[13]。而產(chǎn)酸微生物種類和數(shù)量不同，各樣品所產(chǎn)生的有機(jī)酸種類和含量也不同，成為影響酵制饅頭風(fēng)味物質(zhì)的關(guān)鍵因素[12,14]。

表1 酸面團(tuán)樣品酸度與菌落總數(shù)結(jié)果Table 1 Acidity and lactic acid bacteria and yeast counts in sourdough samples

2.2 酸面團(tuán)中菌群多樣性分析

2.2.1 細(xì)菌多樣性分析

圖1 酸面團(tuán)樣品細(xì)菌在門(mén)（A）和屬（B）水平的相對(duì)含量Fig.1 Relative abundance of bacterial community composition in sourdough samples at the phylum (A) and genus (B) levels

如圖1A所示，細(xì)菌分屬5 個(gè)門(mén)，分別為放線菌門(mén)（Actinobacteria）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、藍(lán)藻菌門(mén)（Cyanobacteria）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）和變形菌門(mén)（Proteobacteria）。厚壁菌門(mén)在所有樣品中都占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，除SX樣品相對(duì)含量達(dá)89.3%外，其余樣品中相對(duì)含量均在99%以上，藍(lán)藻菌門(mén)和變形菌門(mén)在SX樣品中相對(duì)含量分別達(dá)7.0%和3.6%，而在其余樣品中相對(duì)含量均不足1%。此外，擬桿菌門(mén)只在SX樣品中出現(xiàn)，放線菌門(mén)在SX、GS和HN樣品中都有出現(xiàn)，但相對(duì)含量很少，不足0.1%。

如圖1B所示，共有26 個(gè)屬被檢測(cè)到。SX樣品含有種類最多，為20 種，其次為HB和HN樣品，分別為12 種和15 種。5 個(gè)樣品中的優(yōu)勢(shì)屬有乳桿菌屬（Lactobacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）和乳球菌屬（Lactococcus）。乳桿菌屬在HN樣品中相對(duì)含量最多，為96.5%，在SX和QH樣品次之，分別為87.8%和32.4%，在HB和GS樣品中相對(duì)含量最少，分別為19.6%和16.2%。魏斯氏菌屬在HB和GS相對(duì)含量分別高達(dá)79.8%和83.2%，而在其余樣品中相對(duì)含量不足1%。除乳桿菌外，QH中的優(yōu)勢(shì)菌為乳球菌屬和明串珠菌屬（Leuconostoc），相對(duì)含量分別為57.7%和6.6%，而這兩種菌除明串珠菌屬在HN中相對(duì)含量達(dá)2.2%外，在其他樣品中相對(duì)含量相對(duì)較少，不足1%。SX樣品中另外兩種含量相對(duì)較多的為醋桿菌屬（Acetobacter）和chloroplast_norank（分別為2.7%和7.0%），chloroplast_norank在其他樣品中也有被檢測(cè)到，但含量很少。肉食桿菌屬（Carnobacterium）、金黃桿菌屬（Chryseobacterium）和埃希氏桿菌屬-志賀氏桿菌（Escherichia-Shigella）為SX樣品所特有，相對(duì)含量較少。芽孢桿菌屬（Bacillus）在所有樣品中均有出現(xiàn)，而假單胞菌屬（Pseudomonas）只在SX、HB和QH樣品中出現(xiàn)，兩者相對(duì)含量均不足0.1%，腸球菌屬（Enterococcus）、芽孢八疊球菌屬（Sporosarcina）和鏈球菌屬（Streptococcus）也只在QH樣品中出現(xiàn)。

與其他關(guān)于酸面團(tuán)的研究相似，乳桿菌屬為優(yōu)勢(shì)菌群[15-16]，且乳桿菌作為乳酸菌中最重要的組成部分，不僅對(duì)人體腸道平衡起重要作用，還是目前市場(chǎng)上比較成熟的益生菌產(chǎn)品[17]。有研究顯示，乳桿菌中產(chǎn)胞外多糖的菌種對(duì)于面團(tuán)的起酵性能有增強(qiáng)作用[18]。劉同杰等[12]對(duì)傳統(tǒng)酸面團(tuán)中的細(xì)菌進(jìn)行分離鑒定，得到大部分為乳桿菌屬，包括短乳桿菌（L. brevis）、植物乳桿菌和舊金山乳桿菌等。醋桿菌屬是香醋生產(chǎn)中的優(yōu)勢(shì)菌種，對(duì)于有機(jī)酸產(chǎn)生和風(fēng)味物質(zhì)形成均有重要作用[19]，有研究提出Chloroplast在天津獨(dú)流老醋醋酸發(fā)酵過(guò)程中為優(yōu)勢(shì)科[20]，然而，張海燕等[16]在老面的研究中提出葉綠體序列的出現(xiàn)可能是老面店鋪污染所致。乳球菌屬被報(bào)道對(duì)于泡菜的風(fēng)味形成起重要作用，同時(shí)在酸奶發(fā)酵過(guò)程中對(duì)于酸化和風(fēng)味形成至關(guān)重要[21-22]。明串珠菌被報(bào)道能產(chǎn)生葡聚糖和VK等物質(zhì)，在面制品風(fēng)味上擁有潛在的應(yīng)用價(jià)值，且其含量越高風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生可能越多[23-24]，而芽孢桿菌屬能夠分泌較高水平的α-淀粉酶，對(duì)樣品的糖化作用有利[25]。值得注意的是，埃希氏菌屬-志賀氏桿菌作為腸桿菌科（Enterobacteria）的一個(gè)屬，是糞便中的主要菌屬[26]，而腸桿菌科分條件致病菌和非條件致病菌，部分為腸道內(nèi)正常菌群，部分能降解糖產(chǎn)生有機(jī)酸[27]，研究發(fā)現(xiàn)腸桿菌在酒曲中為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，且對(duì)于米酒的酸味口感有重要作用[28]。

2.2.2 真菌多樣性分析

圖2 酸面團(tuán)樣品真菌在門(mén)（A）和屬（B）水平的相對(duì)含量Fig.2 Relative abundance of fungal community composition in sourdough samples at the phylum (A) and genus (B) levels

在圖2A中，共檢測(cè)出6 個(gè)真菌物種，除Eukaryota_unclassified未被鑒定外，其余分別為子囊菌門(mén)（Ascomycota）、擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycota）、纖毛門(mén)（Ciliophora）、Mucoromycotina和Phragmoplastophyta。與其他發(fā)酵食品研究結(jié)果一致[28-30]，子囊菌門(mén)為優(yōu)勢(shì)菌，除GS樣品中相對(duì)含量為83.9%外，其余樣品中相對(duì)含量均達(dá)到99.0%以上，在SX樣品中最高為99.96%，說(shuō)明其在酸面團(tuán)發(fā)酵中起重要作用。擔(dān)子菌門(mén)和Phragmoplastophyta在所有樣品中都有檢出，除擔(dān)子菌門(mén)在GS樣品中相對(duì)含量達(dá)到15.9%外，兩者在所有樣品中相對(duì)含量均不足1%，且纖毛門(mén)、Eukaryota_unclassified和Mucoromycotina分別只在GS、SX和HN樣品中出現(xiàn)，相對(duì)含量均很少。

在圖2B中，從屬水平看，共檢出30 個(gè)物種，不同樣品的優(yōu)勢(shì)菌種類和含量有所差異；其中GS樣品檢測(cè)種類最多，為22 種，QH樣品檢測(cè)種類最少，為13 種?？傮w來(lái)說(shuō)，真菌的優(yōu)勢(shì)屬為酵母屬（Saccharomyces）、畢赤酵母屬（Pichia）、假絲酵母屬（Candida）、耐堿酵母屬（Galactomyces）、曲霉屬（Aspergillus）、赤霉菌屬（Gibberella）和Filobasidiaceae_norank。SX樣品中優(yōu)勢(shì)屬為畢赤酵母屬、酵母屬和耐堿酵母屬，相對(duì)含量分別為92.0%、5.5%和1.4%。HB樣品中含量較多的是酵母屬和假絲酵母屬，分別達(dá)到77.3%和12.7%，其余為曲霉屬、畢赤酵母屬和赤霉菌屬，相對(duì)含量分別為3.9%、3.0%和1.6%。曲霉屬和赤霉菌屬在所有樣品中都有檢測(cè)到，除在GS樣品中相對(duì)含量分別達(dá)8.8%和4.6%外，在其余樣品中相對(duì)含量均不足1%。QH樣品中酵母屬占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，相對(duì)含量高達(dá)97.5%，另一優(yōu)勢(shì)菌為畢赤酵母屬，相對(duì)含量為1.9%。酵母屬在GS和HN中同樣為優(yōu)勢(shì)菌，相對(duì)含量分別高達(dá)68.4%和96.8%。此外，F(xiàn)ilobasidiaceae_norank在GS樣品中相對(duì)含量為12.9%，而在其余樣品中相對(duì)含量很少。剩余23 個(gè)屬為非優(yōu)勢(shì)菌屬，所有樣品中都出現(xiàn)但未鑒定的包括Liliopsida_norank和Onygenales_unclassified；Eukaryota_unclassified只出現(xiàn)在SX中，Ascomycota_unclassified、Hannaella和Microbotryomycetes_unclassified只在HB中出現(xiàn)，而只在HN樣品中出現(xiàn)的為Hypocreales_unclassified、Issatchenkia和毛霉屬（Mucor）。

毛霉在黃酒的生產(chǎn)過(guò)程中與風(fēng)味物質(zhì)含量呈正相關(guān)[31]，曲霉屬和赤霉菌屬在其他相關(guān)研究中也有發(fā)現(xiàn)[30]。曲霉屬屬于絲狀真菌，為醬香酒醅、醬香大曲[32]、濃香大曲[33]和黃酒麥曲中的優(yōu)勢(shì)功能菌屬[34]，代謝產(chǎn)生多種酶類、有機(jī)酸和脂肪酸等產(chǎn)物，對(duì)于酒體風(fēng)味的提升有重要作用[35-36]。酵母屬是酸面團(tuán)中的主要微生物，對(duì)于面團(tuán)的起酵性和疏松性有至關(guān)重要的作用，在發(fā)酵過(guò)程中，面粉中蛋白質(zhì)吸水膨脹形成面筋質(zhì)阻止釀酒酵母產(chǎn)生的二氧化碳溢出，從而提高面團(tuán)的保氣能力，同時(shí)增加面團(tuán)的營(yíng)養(yǎng)與風(fēng)味物質(zhì)[37]。劉建利等[30]對(duì)18 個(gè)面引子的真菌多樣性進(jìn)行分析證實(shí)，除其中1 個(gè)樣品的優(yōu)勢(shì)屬為哈薩克酵母屬外，其余17 個(gè)樣品優(yōu)勢(shì)屬均為酵母屬，此外，還在樣品中檢測(cè)出不同豐度的假絲酵母屬、曲霉屬和赤霉屬，與本研究結(jié)果一致。張國(guó)華[38]采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳法研究我國(guó)5 個(gè)小麥主產(chǎn)區(qū)的面食發(fā)酵劑中微生物結(jié)果顯示，除釀酒酵母為主要優(yōu)勢(shì)菌外，還發(fā)現(xiàn)杰丁畢赤酵母（P. jadinii）、異常畢赤酵母（P. anomala）、熱帶假絲酵母（C. tropicalis）等非釀酒酵母。非釀酒酵母（假絲酵母屬和畢赤酵母屬等）屬于好氧型酵母，對(duì)面團(tuán)發(fā)酵也顯示出一定的起酵性能[39]和風(fēng)味提升作用[40]。發(fā)酵過(guò)程中，非釀酒酵母可以產(chǎn)生甘油、乙酸乙酯、高級(jí)醇及其他揮發(fā)性化合物[41]，對(duì)葡萄酒、白酒和豆醬等發(fā)酵食品的風(fēng)味物質(zhì)形成有重要作用[41-43]。但也有非釀酒酵母對(duì)產(chǎn)品的感官特征產(chǎn)生不良?xì)馕逗陀绊懙膱?bào)道，張鵬[44]在泡菜發(fā)酵的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)畢赤酵母屬酵母的大量繁殖會(huì)使其表面有白膜產(chǎn)生并帶有一定的惡臭味；同樣，畢赤酵母在酸粥發(fā)酵過(guò)程中對(duì)風(fēng)味品質(zhì)形成無(wú)積極影響[45]。

2.3 酵制饅頭的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

利用酸面團(tuán)樣品發(fā)酵制作饅頭，采用HS-SPME-GC-MS檢測(cè)饅頭中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。經(jīng)解譜，樣品中共檢出42 種揮發(fā)性成分，包括醇類、醛類、酯類、芳香類、烴類等（表2、圖3）。其中HB樣品種類最多，為30 種，SX、QH和GS樣品分別為26 種，HN樣品為25 種，且不同饅頭樣品風(fēng)味物質(zhì)總含量排序?yàn)镾X＞HN＞GS＞QH＞HB。所有酸面團(tuán)饅頭的揮發(fā)性成分以醇類、醛類、酯類和芳香類為主，這與文獻(xiàn)[46-48]研究結(jié)果一致。

表2 不同饅頭揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析結(jié)果Table 2 Volatile flavor compounds identified in traditional sourdough and steamed bread made with it

續(xù)表2

圖3 不同饅頭中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)類別Fig.3 Relative contents of different classes of of volatile flavor compounds in steamed breads made with different sourdough samples

SX樣品中醇類、醛類和酯類約占70.0%，且醇類以苯乙醇為主，占總含量37.1%，遠(yuǎn)多于其他樣品，這可能是由于SX樣品中非釀酒酵母相對(duì)較多，產(chǎn)生更多高級(jí)醇的原因[49]。HB和GS樣品中醇、醛、酯和芳香類物質(zhì)含量分布比較均勻，GS中酯類相對(duì)含量較多，包括甲酸辛酯、辛酸乙酯、棕櫚酸乙酯和亞油酸乙酯等。QH樣品中相對(duì)含量較多的是芳香類，占總含量39.8%。HN樣品中醛類和芳香類物質(zhì)相對(duì)含量較多，且醛類物質(zhì)相對(duì)含量均高于其他樣品，包括苯甲醛、苯乙醛、2-十三烯醛和(E,E)-2,4-葵二烯醛等，(E,E)-2,4-葵二烯醛散發(fā)甜橙香氣，同時(shí)帶有脂肪氣息，此外，2-戊基呋喃作為一種不飽和醇，具有蘑菇、薰衣草和干草香氣，在其他老面饅頭中也有檢測(cè)到[50]。辛酸乙酯是GS中特有的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，苯并環(huán)庚三烯和1,2,3-三甲基-4-丙烯基-萘是HB中特有的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，亞硫酸壬基戊酯和二氫-5-戊基-2(3H)-呋喃酮是SX中特有的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，6-叔丁基-2,4-二甲基苯酚、4-仲丁基-2,6-二叔丁基苯酚和棕櫚酸是QH中特有的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，這些物質(zhì)共同組成了酸面團(tuán)制品的獨(dú)特香氣。苯乙醇多存在蘋(píng)果、草莓和蜂蜜等天然植物中，具有玫瑰花香味，是饅頭的重要呈香物質(zhì)[51]。苯乙醛可以作為香精使用，具有濃郁的玫瑰花香氣；苯甲醛具有令人愉快的堅(jiān)果香、水果香和杏仁香[52-53]，是重要的食品用香料；萘有溫和芳香氣味，甲酸辛酯和辛酸乙酯均可以用作香料，分別用于調(diào)制水果香精和調(diào)味料，而亞油酸乙酯為濃香型白酒的重要香氣成分[54]。本研究除棕櫚酸外并沒(méi)有檢測(cè)出其他酸類物質(zhì)，而劉娜等[50]研究結(jié)果顯示，堿的加入會(huì)導(dǎo)致酸面團(tuán)饅頭酸類物質(zhì)含量下降，對(duì)醛酮類、芳雜環(huán)類、內(nèi)酯類和烷烴類化合物幾乎沒(méi)有影響。本研究還檢出一定量的烷烯烴類，而由于烯烴類物質(zhì)閾值較大，對(duì)風(fēng)味提升貢獻(xiàn)不大[54]。

圖5 酸面團(tuán)中真菌菌群與揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相關(guān)性分析熱圖Fig.5 Correlation heat map between fungal flora and volatile flavor components in sourdough samples

2.4 酸面團(tuán)優(yōu)勢(shì)菌群與揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)相關(guān)性分析

由圖4可知，鏈球菌屬、芽孢八疊球菌屬、腸球菌屬、埃希氏桿菌屬-志賀氏桿菌、金黃桿菌屬、醋桿菌屬、肉食桿菌屬、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、梭菌屬（Clostridium）、Kluyvera、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）與揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)呈顯著正相關(guān)；乳球菌屬、芽孢桿菌屬和假單胞菌屬與揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)呈顯著負(fù)相關(guān)。揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)與細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)關(guān)系復(fù)雜，某一成分可能受多種微生物協(xié)調(diào)作用。明串珠菌屬對(duì)2-甲基萘、十六烷有顯著正向作用，對(duì)甲氧基苯基肟、順式2-甲基環(huán)己醇和鄰苯二甲酸二異丁酯有顯著負(fù)向作用，而魏斯氏菌屬則恰好相反，對(duì)2-甲基萘、十六烷有顯著負(fù)向作用，而對(duì)甲氧基苯基肟、順式2-甲基環(huán)己醇和鄰苯二甲酸二異丁酯有顯著正向作用。乳桿菌屬為酸面團(tuán)中主要優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，對(duì)苯甲醛、苯乙醛和十六烷有顯著正向作用，而對(duì)順式2-甲基環(huán)己醇則為顯著負(fù)向作用，因此，乳桿菌屬含量最高的HN樣品中檢測(cè)出的醛類物質(zhì)含量也最多。此外，片球菌屬對(duì)1-庚醇的正向作用可能也是SX樣品中醇含量高的原因之一。

由圖5可知，除Cochliobolus與揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)呈顯著負(fù)相關(guān)之外，大部分真菌與揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)呈顯著正相關(guān)，而畢赤酵母屬、Trichosporon、Liliopsida_norank、Agaricales_unclassified和Wallemia則與個(gè)別揮發(fā)性物質(zhì)呈顯著負(fù)相關(guān)，如三甲基硅烷基-2,4-二[(三甲基硅烷基)氧基]苯甲酸酯、2,4,6-辛三烯醛和苯乙醇等。釀酒酵母是面團(tuán)發(fā)酵過(guò)程的主要微生物群體，它可以將面粉中約95%的可發(fā)酵糖轉(zhuǎn)化成乙醇和二氧化碳，剩余糖則參加次級(jí)代謝，生成一些風(fēng)味物質(zhì)[55]。本研究結(jié)果顯示，釀酒酵母對(duì)2-戊基呋喃有顯著正向作用。赤霉屬和曲霉屬對(duì)甲氧基苯基肟、順式2-甲基環(huán)己醇和鄰苯二甲酸二異丁酯有顯著的正向作用，GS樣品中赤霉屬和曲霉屬含量較高可能是其酯類物質(zhì)含量高的原因之一。SX樣品中耐堿酵母屬含量較高，而耐堿酵母對(duì)苯乙醇和1-庚醇的正向作用顯著。

3 結(jié) 論

本研究通過(guò)分析酸面團(tuán)中菌群結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌群為乳桿菌屬、乳球菌屬和魏斯氏菌屬，真菌屬的優(yōu)勢(shì)菌群為酵母屬、畢赤酵母屬、假絲酵母屬，菌群結(jié)構(gòu)的不同顯著影響了風(fēng)味物質(zhì)的種類和含量。采用HS-SPME-GC-MS檢測(cè)酸面團(tuán)酵制饅頭中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，共檢出42 種揮發(fā)性成分，以醇類、醛類、酯類和芳香類為主，風(fēng)味物質(zhì)在種類和含量上也存在較大差異性。結(jié)果表明釀酒酵母對(duì)風(fēng)味物質(zhì)生成有顯著正向作用，乳桿菌屬、明串珠菌屬和魏斯氏菌屬等微生物與大部分揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)呈顯著正相關(guān)，而與部分物質(zhì)呈顯著負(fù)相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)增進(jìn)了酸面團(tuán)樣品中微生物菌群結(jié)構(gòu)和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)相關(guān)性的基礎(chǔ)研究，為進(jìn)一步研究微生物菌群結(jié)構(gòu)對(duì)風(fēng)味物質(zhì)形成的機(jī)理提供參考，為下一步通過(guò)深入挖掘菌群信息、提升饅頭特征風(fēng)味物質(zhì)和品質(zhì)研究提供方向，為開(kāi)發(fā)具有特征性香氣成分、工業(yè)化生產(chǎn)主食發(fā)酵劑提供理論依據(jù)。