基于基因組挖掘技術(shù)的新型谷氨酸脫羧酶基因挖掘及表達(dá)鑒定

李 祥，解玉麗，賈園園，張 閃，王紅艷，劉先吏，羅湘艷，唐存多,2,*

（1.南陽(yáng)師范學(xué)院 昆蟲(chóng)生物反應(yīng)器河南省工程實(shí)驗(yàn)室，河南 南陽(yáng) 473061；2.車用生物燃料技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 南陽(yáng) 473061）

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是廣泛存在于自然界中的一種非蛋白質(zhì)氨基酸，在醫(yī)藥、食品和化工行業(yè)均有較大的應(yīng)用前景[1-2]。在醫(yī)藥行業(yè)，GABA作為一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)[3]，可用于調(diào)節(jié)血壓和治療精神疾病[4-6]。在食品行業(yè)，GABA可作為重要的食品添加劑，用于制備各種具有鎮(zhèn)靜安神、降壓補(bǔ)腦功效的功能性食品[7-8]。在化工行業(yè)，可用作生物可降解塑料——尼龍4的前體物質(zhì)，進(jìn)行可降解塑料的合成[9-10]。目前，GABA的合成方法主要包括化學(xué)合成、植物富集和生物合成法[2,11-12]。傳統(tǒng)的化學(xué)合成法能耗高、污染大，不利于可持續(xù)發(fā)展[13]。植物富集法又受限于原料中GABA含量較低，難以大規(guī)模生產(chǎn)。而生物合成法不受資源、環(huán)境和空間的限制，更綠色、更環(huán)保，它已在GABA合成領(lǐng)域最受青睞[1]。

谷氨酸脫羧酶（glutamate decarboxylase，GAD，EC 4.1.1.15）是磷酸吡哆醛依賴性酶，在L-谷氨酸不可逆脫羧生成GABA的過(guò)程中起關(guān)鍵作用[14]。GAD廣泛存在于各種生物體中，許多微生物均已檢測(cè)到GAD活力[15]。由于乳酸菌用于食品發(fā)酵的歷史悠久，且還具備一定的保健潛力，因此許多有關(guān)GABA和GAD的研究都聚焦于乳酸菌，主要包括短乳桿菌（Lactobacillus brevis）[16]、副干酪乳桿菌（L. paracasei）[17]、鼠李糖乳桿菌（L. rhamnosus）[18]、清酒乳桿菌（L. sakei）[19]、植物乳桿菌（L. plantarum）[20]、酵素乳桿菌（L. zymae）[21]、發(fā)酵乳桿菌（L. fermentum）[15]和乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）[22]。然而，受限于乳酸菌生長(zhǎng)速度緩慢，難以實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵，因此從乳酸菌中提取GAD難以滿足GABA的大規(guī)模生產(chǎn)需求[15]。為了獲得足夠的GAD，以滿足GABA工業(yè)生產(chǎn)的需求，挖掘乳酸菌來(lái)源的GAD并實(shí)現(xiàn)在大腸桿菌（Escherichia coli）中高效異源表達(dá)受到了廣泛關(guān)注[15,23]。迄今為止，盡管已有許多關(guān)于GABA和GAD的研究報(bào)道，但它們產(chǎn)業(yè)化程度仍不高，大多數(shù)都停留在實(shí)驗(yàn)室水平的研究階段。這主要?dú)w因于GAD的催化活性低、穩(wěn)定性和pH值適應(yīng)性差，以及生物催化法制備GABA酶的使用成本太高。如何獲得催化活性高、穩(wěn)定性好的優(yōu)良GAD已成為企業(yè)和科研人員當(dāng)前所面臨的巨大挑戰(zhàn)，也是降低生物催化法制備GABA生產(chǎn)成本所必須突破的瓶頸[24-25]。

自然界中蘊(yùn)藏著豐富的未被人工培養(yǎng)微生物及未被發(fā)掘新型酶資源，發(fā)掘這些未知的酶類并加以適當(dāng)改造以滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需求，吸引了廣大科研工作者的關(guān)注[26]。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，基因組序列數(shù)據(jù)也日益豐富，為新酶的挖掘提供了豐富的基因資源[27-28]。基因組挖掘技術(shù)可以繞過(guò)傳統(tǒng)的微生物分離篩選及蛋白的分離純化等過(guò)程，實(shí)現(xiàn)從基因組數(shù)據(jù)庫(kù)到真實(shí)酶數(shù)據(jù)庫(kù)的跨越，進(jìn)一步豐富了可被利用或改造的酶資源[29-30]。

本研究擬借助基因組挖掘技術(shù)，從公認(rèn)安全的（generally recognized as safe，GRAS）有益細(xì)菌的基因組中挖掘新型的GAD基因，利用E. coli作為宿主，構(gòu)建能夠高效表達(dá)重組GAD基因工程菌，并進(jìn)行全細(xì)胞催化L-谷氨酸合成GABA的研究，旨在為實(shí)現(xiàn)GABA高效、廉價(jià)的綠色生物合成奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試劑

L-谷氨酸、磷酸吡哆醛、硼酸、苯酚、次氯酸鈉、GABA標(biāo)準(zhǔn)品 北京索萊寶科技有限公司；三乙胺、苯異硫氰酸酯（phenylisothiocyanate，PITC） 麥克林化學(xué)試劑有限公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG） 生工生物工程（上海）股份有限公司；甲醇（色譜純） 天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；一站式His標(biāo)記蛋白質(zhì)微量純化套裝 北京天恩澤基因科技有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.1.2 菌株、質(zhì)粒與培養(yǎng)基

攜帶原核表達(dá)質(zhì)粒的E. coliBL21/pET28a菌株由本課題組保藏[9]，主要用作GABA生物合成反應(yīng)的陰性對(duì)照。

LB培養(yǎng)基：10 g/L蛋白胨、10 g/L氯化鈉和5 g/L酵母提取物，制作固體平板時(shí)添加15 g/L瓊脂粉，自然pH值，121 ℃滅菌20 min，用于E. coli的培養(yǎng)。

1.2 儀器與設(shè)備

PowerPac? HC/Mini-PROTEAN?蛋白電泳系統(tǒng)、UNIVERSAL Hood凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司；Hypersil C18柱 美國(guó)Thermo Scientific公司；UV1000紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海天美科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 新型GAD的基因挖掘

以研究比較透徹、催化活性較高的L. brevis來(lái)源GAD（LbGAD）蛋白序列為探針[31-32]，以GRAS有益細(xì)菌（主要包括乳酸菌、腸球菌）的基因組序列為搜索對(duì)象進(jìn)行BLAST分析，從搜索到的序列中找出一系列基因組信息來(lái)源且未經(jīng)表達(dá)鑒定、假定的GAD蛋白。然后，對(duì)這些潛在的GAD蛋白序列利用ClustalX2和MEGA6.0軟件進(jìn)行多序列比對(duì)和進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建?；趯?duì)進(jìn)化樹(shù)的分析，選定幾個(gè)代表性的序列借助Optimizer服務(wù)器以E. coliK12菌株的密碼子使用頻率表為依據(jù)，進(jìn)行密碼子優(yōu)化。經(jīng)過(guò)對(duì)目標(biāo)基因和表達(dá)質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)的酶切位點(diǎn)分析后，在目標(biāo)基因的上下游分別加上合適的酶切位點(diǎn)，最后委托蘇州泓迅生物科技有限公司進(jìn)行全基因的合成。

1.3.2 重組E. coli的誘導(dǎo)表達(dá)

采用低溫、低誘導(dǎo)劑濃度的誘導(dǎo)策略進(jìn)行[33]。分別將E. coliBL21/pET28a和攜帶不同GAD編碼基因的重組E. coli單菌落接種至4 mL含50 μg/mL卡拉霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)14 h，以2%接種量轉(zhuǎn)接至100 mL新鮮LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min再培養(yǎng)約2.5 h，加入1 mol/L IPTG溶液至終濃度為0.1 mmol/L，16 ℃、200 r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)20 h；取10 mL菌液于8 000 r/min、4 ℃離心5 min，收集菌體，將菌體重懸后進(jìn)行超聲破碎，并進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析[33]。重組酶的純化按照一站式His標(biāo)記蛋白質(zhì)微量純化套裝試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.3 酶活力分析

由于PITC衍生化所需的時(shí)間較長(zhǎng)[34]，不利于GABA的快速定量，因此本研究中重組GAD活力的快速測(cè)定參照比色法[35-36]略作修改。酶活力測(cè)定的反應(yīng)體系為1 mL，包含0.01 mmol/L磷酸吡哆醛、20 mmol/LL-谷氨酸、200 mmol/L pH 5.0的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液，37 ℃保溫2 min后加入100 μL稀釋適當(dāng)倍數(shù)的酶液，迅速混勻后反應(yīng)5 min，迅速放入沸水浴終止反應(yīng)。取400 μL反應(yīng)液，依次加入400 μL 0.2 mol/L pH 9.0的硼酸緩沖液、1.0 mL 6%苯酚和1.0 mL次氯酸鈉溶液（有效氯大于7.5%），充分振蕩后，沸水浴中反應(yīng)10 min迅速在冰浴中冷卻顯色20 min，待呈現(xiàn)藍(lán)綠色后加入2.0 mL 60%乙醇溶液，最后在643.5 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以底物溶液中加入等量蒸餾水為對(duì)照組。由此快速測(cè)定反應(yīng)生成GABA的量，以測(cè)定GAD活力。在測(cè)定條件下每分鐘生成1 μmol GABA所需的酶量定義為1 個(gè)酶活力單位（U）。

1.3.4 重組酶的溫度特性分析

參照1.3.3節(jié)方法，分別在30～60 ℃（以5 ℃為間隔）測(cè)定各重組酶的催化活性以獲得最適反應(yīng)溫度；將各重組酶分別在20～60 ℃（以5 ℃為間隔）保溫1 h，然后在各自最適反應(yīng)溫度下測(cè)定各自的殘留酶活力，以冰浴保存1 h后的殘余酶活力為100%，以此考察各重組酶的熱穩(wěn)定性。

1.3.5 重組酶的pH值特性分析

參照1.3.3節(jié)方法，在各自最適反應(yīng)溫度下，分別在pH 2.0～6.0（以0.5為間隔）下測(cè)定各重組酶的催化活性以獲得最適反應(yīng)pH值；將各重組酶分別在pH 2.0～6.0（以0.5為間隔）緩沖液中冰浴1 h，然后在各自最適反應(yīng)溫度和最適反應(yīng)pH值下測(cè)定各自的殘留酶活力，以未經(jīng)處理為100%，以此考察各重組酶的pH值穩(wěn)定性。

1.3.6 重組酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)

將輔酶磷酸吡哆醛的終濃度定為0.01 mmol/L，逐步提高底物的終濃度，測(cè)定各酶在不同底物濃度下的反應(yīng)速率，利用Origin 9.0軟件進(jìn)行非線性擬合，得出各酶對(duì)底物的Km、Kcat和Vmax值。

1.3.7 重組E. coli全細(xì)胞轉(zhuǎn)化L-谷氨酸合成GABA

為了提高GABA生產(chǎn)的時(shí)空得率，本研究采用邊誘導(dǎo)邊轉(zhuǎn)化的“雙邊工藝”方式進(jìn)行。參照1.3.2節(jié)條件分別對(duì)E. coliBL21/pET28a和攜帶不同GAD編碼基因的重組E. coli進(jìn)行前期的種子培養(yǎng)，加入1 mol/L IPTG溶液至終濃度為0.1 mmol/L后，緊接著添加L-谷氨酸至終質(zhì)量濃度為6 g/L，添加磷酸吡哆醛的母液至終濃度為0.5 mmol/L，先在16 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)24 h，然后在30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)24 h，期間每4 h取樣檢測(cè)GABA生成量。

1.3.8 GABA的高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）分析

GABA的精確定量采用柱前PITC衍生HPLC進(jìn)行[34]，稱取GABA標(biāo)準(zhǔn)品溶解于超純水中，取不同體積的標(biāo)準(zhǔn)品溶液加入到10 mL的離心管中，制成不同濃度梯度的GABA標(biāo)準(zhǔn)液，然后分別加入500 μL 0.1 mol/L PITC-乙腈、500 μL 1 mol/L三乙胺-乙腈，充分混勻后室溫放置反應(yīng)1 h，反應(yīng)結(jié)束后加入3 mL 50%乙腈溶液，混合均勻，再加入5 mL正己烷，混合均勻后靜置10 min，取下層溶液，用0.22 μm濾膜過(guò)濾，取20 μL濾液進(jìn)行HPLC分析，獲得各濃度GABA峰面積后，進(jìn)行線性擬合獲得回歸方程及相關(guān)系數(shù)。HPLC色譜柱為Thermo Hypersil C18柱，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，柱溫25 ℃，流動(dòng)相為體積分?jǐn)?shù)10%的甲醇溶液，流速1 mL/min。采用同樣的方法對(duì)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物和L-谷氨酸分別進(jìn)行衍生化和HPLC分析，根據(jù)產(chǎn)物的保留時(shí)間進(jìn)行定性分析，同時(shí)根據(jù)測(cè)得產(chǎn)物峰面積，由獲得的回歸方程進(jìn)行定量分析。

1.3.9 常用網(wǎng)站及軟件

NCBI（http://www.ncbi.nlm. nih.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)和Basic Local Alignment Search Tool（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）：用于蛋白質(zhì)、基因序列及蛋白質(zhì)3-D結(jié)構(gòu)的搜索；Optimizer（http://genomes.urv.cat/OPTIMIZER/）：用于密碼子的優(yōu)化；ClustalX2：用于蛋白質(zhì)的多序列比對(duì)；MEGA6.0：用于進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建；DNAMAN：用于基因序列及限制性酶切位點(diǎn)分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及圖表繪制

圖片均用Adobe Photoshop CS 8.0軟件進(jìn)行色階、對(duì)比度調(diào)節(jié)及標(biāo)注等處理。簡(jiǎn)單的數(shù)據(jù)處理及分析均借助Origin 9.0進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 GAD的基因挖掘

圖1 探針及潛在的GAD進(jìn)化樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree for the probe and putative glutamate decarboxylases

如圖1所示，以在進(jìn)化樹(shù)上的距離為依據(jù)選取了4 個(gè)有代表性的序列，包括L. lactisCICC20209、E. sulfureus、L. senmaizukei和L. brevisATCC 367來(lái)源的4 個(gè)潛在的GAD，并將其分別命名為L(zhǎng)lGAD、EsGAD、LsGAD和LbGAD。其中，LsGAD與已報(bào)道的GAD相似度最高為82.01%（序列號(hào)為BAN05709.1）[31]，而EsGAD與報(bào)道的GAD相似度最高為70.18%（序列號(hào)為KRN72673）[37]，相似度表明這2 個(gè)酶在基因序列上均具有一定的新穎性。對(duì)選定的4 個(gè)基因進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，然后對(duì)目標(biāo)基因和pET28a多克隆位點(diǎn)的酶切位點(diǎn)進(jìn)行分析，在目標(biāo)基因上下游分別加上BamH I和XhoI酶切位點(diǎn)后，委托蘇州泓迅生物科技有限公司進(jìn)行全基因合成，并克隆至pET28a上，構(gòu)建出一系列攜帶潛在GAD編碼基因的重組E. coli，分別命名為E. coliBL21/pET28a-LsGAD、E. coliBL21/pET28a-LlGAD、E. coliBL21/pET28a-EsGAD和E. coliBL21/pET28a-LbGAD。

2.2 重組E. coli的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

分別將E. coliBL21/pET28a、E. coliBL21/pET28a-LsGAD、E. coliBL21/pET28a-LlGAD、E. coliBL21/pET28a-EsGAD和E. coliBL21/pET28a-LbGAD按照1.3.2節(jié)方法進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。將100 mL發(fā)酵液中的菌體離心收集，然后超聲破碎，高速離心20 min后收集裂解上清液，將上清液過(guò)0.45 μm濾膜后用一站式His標(biāo)記蛋白質(zhì)微量純化套裝進(jìn)行純化，并用10 kDa截留分子質(zhì)量的超濾離心管進(jìn)行咪唑去除和產(chǎn)物濃縮，最終分別將各重組蛋白定容至1.5 mL。將裂解上清液和純化后產(chǎn)物分別進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖2所示，E. coliBL21/pET28a-EsGAD、E. coliBL21/pET28a-LbGAD、E. coliBL21/pET28a-LsGAD和E. coliBL21/pET28a-LlGAD的裂解上清液在約53 kDa處有明顯的特異性條帶，與理論分子質(zhì)量一致，表明這4 個(gè)潛在的GAD均成功實(shí)現(xiàn)了在E. coli中的可溶性表達(dá)，其中E. coliBL21/pET28a-EsGAD的蛋白可溶性表達(dá)水平最差。純化產(chǎn)物均在約53 kDa處出現(xiàn)了單一條帶，表明經(jīng)過(guò)親和層析獲得了電泳純的4 個(gè)重組酶，可以用于后續(xù)酶學(xué)特性的分析。

圖2 代表性重組GAD的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of representative recombinant glutamate decarboxylases

酶活力測(cè)定結(jié)果顯示，E. coliBL21/pET28a-EsGAD、E. coliBL21/pET28a-LbGAD、E. coliBL21/pET28a-LsGAD和E. coliBL21/pET28a-LlGAD發(fā)酵液中GAD活力分別為8.38、28.97、34.17 U/mL和38.91 U/mL，LsGAD和LlGAD在E. coli中的表達(dá)水平明顯高于探針LbGAD的表達(dá)水平，這表明在催化L-谷氨酸生成GABA的反應(yīng)中前兩者可能會(huì)有更高的效率。經(jīng)純化后，reEsGAD、reLbGAD、reLsGAD和reLlGAD對(duì)L-谷氨酸的比活力分別為114.35、108.63、139.60 U/mg和46.62 U/mg，其中reLsGAD比活力最高，約為探針（reLbGAD）的1.4 倍。

2.3 重組GAD的溫度特性

由圖3A可知，LsGAD的最適反應(yīng)溫度最低，僅為40 ℃，它更接近于菌體的最適生長(zhǎng)溫度。結(jié)果表明在生理?xiàng)l件下，LsGAD較其他GAD可能會(huì)更具催化潛力。如圖3B所示，4 個(gè)重組GAD的熱穩(wěn)定性均欠佳，游離酶在40 ℃保溫1 h后殘留酶活力均只有50%左右，這會(huì)限制它在GABA生物合成中的應(yīng)用，在今后研究中有必要通過(guò)固定化、定向進(jìn)化或理性設(shè)計(jì)等手段對(duì)其熱穩(wěn)定性進(jìn)行改造，以滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需求[38-39]。在本研究中，將采取全細(xì)胞催化的方法進(jìn)行GABA的生物合成，以提高GAD在反應(yīng)條件下的穩(wěn)定性。

圖3 重組GAD的最適溫度（A）和熱穩(wěn)定性（B）Fig.3 Optimal temperature (A) and temperature stability (B) of recombinant glutamate decarboxylases

2.4 重組GAD的pH值特性

圖4 重組GAD的最適pH值（A）和pH值穩(wěn)定性（B）Fig.4 Optimal pH (A) and pH stability (B) of recombinant glutamate decarboxylases

由圖4A可知，4 個(gè)重組GAD均為嗜酸性酶，它們的最適pH值在4.0～5.5之間，其中LsGAD的pH值適應(yīng)性最廣，在4.5～6.0之間均能保持80%以上的相對(duì)酶活力，具有更大的應(yīng)用潛力。由圖4B可知，4 個(gè)重組GAD對(duì)pH值較為敏感，當(dāng)稍微偏離其最適pH值時(shí)，其穩(wěn)定性明顯下降，因此在使用過(guò)程中一定要嚴(yán)格控制反應(yīng)體系的pH值。

2.5 重組GAD的動(dòng)力學(xué)參數(shù)分析

表1 重組GAD對(duì)L-谷氨酸的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 1 Kinetic parameters for the activity of recombinant glutamate decarboxylases toward L-glutamic acid

表1結(jié)果顯示，與探針及其他2 個(gè)重組GAD相比，LsGAD對(duì)L-谷氨酸的Km值最低，僅為3.37 mmol/L，表明它對(duì)L-谷氨酸具有更高的親和力。而LsGAD的Kcat/Km值為10.27 L/（mmol·s），也明顯高于探針及其他2 個(gè)重組谷氨酸脫氫酶，這表明LsGAD較其他幾個(gè)GAD可能會(huì)具有更高催化效率。

2.6 GABA的生物合成

采用1.3.7節(jié)邊誘導(dǎo)邊轉(zhuǎn)化的“雙邊工藝”對(duì)L-谷氨酸進(jìn)行全細(xì)胞催化的生物轉(zhuǎn)化，將反應(yīng)產(chǎn)物按1.3.8節(jié)方法進(jìn)行HPLC檢測(cè)，在保留時(shí)間為2.94 min和2.23 min處均有明顯的特征峰，表明已有部分L-谷氨酸（2.23 min）轉(zhuǎn)化為GABA（2.94 min）。6 g/L的L-谷氨酸在上述轉(zhuǎn)化工藝下的反應(yīng)進(jìn)程曲線如圖5所示，在前20 h的誘導(dǎo)時(shí)間段，4 個(gè)攜帶GAD基因的工程菌均能產(chǎn)生一定的GABA，其得率約為10%，再經(jīng)過(guò)24 h的誘導(dǎo)后，GABA得率最高可達(dá)58%，最低約為40%，離理論得率仍有一定的差距，在后續(xù)研究中仍需對(duì)轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行系統(tǒng)的優(yōu)化。但相比傳統(tǒng)的先誘導(dǎo)后轉(zhuǎn)化的分步工藝，該雙邊工藝節(jié)約了一定的轉(zhuǎn)化時(shí)間，提高了GABA的時(shí)空生產(chǎn)效率[15]。

圖5 不同E. coli工程菌催化下的GABA反應(yīng)進(jìn)程曲線Fig.5 Time course curves of GABA production catalyzed by engineered E. coli cells

3 討 論

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，基因組數(shù)據(jù)在不斷豐富，迄今為止已有222 395 個(gè)原核生物的基因組序列被先后報(bào)道，且仍在呈遞增趨勢(shì)。海量基因組序列中包含了大量假定酶基因，為新酶的發(fā)掘提供了豐富資源[26]。采用基因組挖掘技術(shù)，可以快速地將假定酶變?yōu)檎鎸?shí)酶，為生物催化提供更多的選擇[27]。

本研究采用基因組挖掘技術(shù)，以LbGAD的蛋白序列為探針，從乳酸菌屬和腸球菌屬的基因組中挖掘到了3 個(gè)假定的GAD（LsGAD、EsGAD和LlGAD），其中LsGAD與已報(bào)道的序列相似度最高為82.01%[31]，而EsGAD與已報(bào)道的序列相似度最高為70.18%[37]，均具有較高的新穎性。借助pET28a質(zhì)粒將4 個(gè)基因?qū)崿F(xiàn)了在E. coliBL21中的可溶性表達(dá)，E. coliBL21/pET28a-EsGAD、E. coliBL21/pET28a-LbGAD、E. coliBL21/pET28a-LsGAD和E. coliBL21/pET28a-LlGAD發(fā)酵液中GAD活力分別為8.38、28.97、34.17 U/mL和38.91 U/mL，LsGAD和LlGAD在E. coli中的表達(dá)水平明顯高于探針LbGAD的表達(dá)水平，表明其全細(xì)胞催化L-谷氨酸合成GABA的應(yīng)用中可能更具優(yōu)勢(shì)。此外，reLsGAD對(duì)L-谷氨酸的酶活力最高，可達(dá)139.60 U/mg，約為探針（reLbGAD）的1.4 倍。而reLlGAD對(duì)L-谷氨酸的酶活力最低，僅為46.62 U/mg，但是其可溶性的蛋白表達(dá)含量很高（圖3），所以體現(xiàn)出的酶活力表達(dá)水平仍然最高。

溫度特性結(jié)果顯示，LsGAD的最適反應(yīng)溫度最低，僅為40 ℃，更接近于菌體的最適生長(zhǎng)溫度，表明在生理?xiàng)l件下，LsGAD較其他GAD可能會(huì)更具催化潛力。pH值特性結(jié)果表明，4 個(gè)重組GAD均為嗜酸性酶，它們的最適pH值在4.0～5.5之間，其中LsGAD的pH值適應(yīng)性最廣，在4.5～6.0之間均能保持80%以上的相對(duì)酶活力，可能會(huì)具有更大的應(yīng)用潛力。此外，動(dòng)力學(xué)參數(shù)結(jié)果顯示，LsGAD的Kcat/Km值為10.27 L/（mmol·s），也明顯高于探針及其他2 個(gè)重組GAD。從這些酶學(xué)特性的參數(shù)比較分析看，均體現(xiàn)出LsGAD的優(yōu)越性，下一步選擇其做進(jìn)一步研究，包括采用共表達(dá)質(zhì)粒提高基因的拷貝數(shù)及在食品級(jí)乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)等。

最后，采用邊誘導(dǎo)邊轉(zhuǎn)化的“雙邊工藝”對(duì)L-谷氨酸進(jìn)行全細(xì)胞催化的生物轉(zhuǎn)化，6 g/L的L-谷氨酸經(jīng)過(guò)24 h轉(zhuǎn)化后，GABA得率最高可達(dá)58%。相比傳統(tǒng)的先誘導(dǎo)后轉(zhuǎn)化分步工藝，該雙邊工藝節(jié)約了一定的轉(zhuǎn)化時(shí)間，提高了GABA的時(shí)空生產(chǎn)效率[15]?？傊?，本研究實(shí)現(xiàn)了GAD從基因組數(shù)據(jù)到真實(shí)酶的跨越，獲得了數(shù)個(gè)性能優(yōu)良的GAD，初步實(shí)現(xiàn)了GABA的生物合成，為實(shí)現(xiàn)GABA低成本、規(guī)?；纳锖铣商峁┮欢ǖ膮⒖?。