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    腐乳丁酸及產(chǎn)丁酸菌發(fā)酵特性分析

    2021-06-04 02:17:18馬艷莉梁靜靜李素萍丁玉峰
    食品科學(xué) 2021年10期
    關(guān)鍵詞:腐乳丁酸梭菌

    馬艷莉,段 哲,梁靜靜,李素萍,丁玉峰

    (1.南陽(yáng)理工學(xué)院 河南省工業(yè)微生物資源與發(fā)酵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 南陽(yáng) 473004;2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,河北 保定 071000)

    腸道微生態(tài)健康是近年來(lái)備受關(guān)注的健康問(wèn)題,發(fā)酵食品對(duì)微生態(tài)的影響引起世界關(guān)注,國(guó)際上對(duì)發(fā)酵食品研究已深入到腸道微生態(tài)領(lǐng)域[1-3]。腐乳是大豆經(jīng)磨漿、成坯、前酵、腌制、后酵等過(guò)程制作的傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品,歷史悠久、風(fēng)味獨(dú)特、營(yíng)養(yǎng)豐富,其中最具特色的為青方腐乳[4]。青方腐乳又被稱為“臭豆腐”,外觀呈青色,更多呈豆青色,是眾多腐乳種類中最具特色的一類。通常認(rèn)為,青方腐乳在發(fā)酵過(guò)程中因部分蛋白質(zhì)降解,游離出硫氫基和氨基,產(chǎn)生具有硫臭和氨臭等特殊強(qiáng)烈刺激性氣味,因此又被稱為臭腐乳。

    短鏈脂肪酸是指碳原子數(shù)小于6的有機(jī)脂肪酸,近年來(lái),由于發(fā)現(xiàn)其在微生態(tài)健康方面的重要作用而被廣泛關(guān)注[5-7]。丁酸是最重要的短鏈脂肪酸,在調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、維持腸道微生態(tài)健康方面發(fā)揮積極作用[8],丁酸還是組蛋白去乙?;傅囊种苿兄诿庖呒?xì)胞育成,具有抗細(xì)胞增生、促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡的能力[9]。目前已有多個(gè)丁酸的前體藥物被合成和研究[10-11]。因此,在食品范圍內(nèi)尋找含有丁酸的產(chǎn)品具有重要意義。但是,由于高濃度丁酸具有刺激性臭味,往往被作為破壞食品風(fēng)味品質(zhì)的組分,前期研究發(fā)現(xiàn),丁酸是青方腐乳關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味成分,風(fēng)味閾值較低,對(duì)青方腐乳特征性臭味貢獻(xiàn)較大,在青方腐乳中含量為2.44 μg/g[12]。青方腐乳“聞著臭,吃著香”的獨(dú)特風(fēng)味為部分人所喜愛(ài),甚至是嗜愛(ài),有一定的消費(fèi)基礎(chǔ),因此,青方腐乳中高丁酸含量不會(huì)引起風(fēng)味品質(zhì)下降,青方腐乳有可能成為丁酸的載體,促進(jìn)丁酸消費(fèi),有助于其功能性發(fā)揮。

    研究表明,多種微生物可以產(chǎn)丁酸,丁酸梭菌(Clostridium butyricum)是最受關(guān)注、研究最多的產(chǎn)丁酸微生物[13-14]。1933年,丁酸梭菌最早在日本被發(fā)現(xiàn)并報(bào)道,目前將其活菌制劑作為整腸劑用于調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡已有60多年。作為益生菌,丁酸梭菌在維持腸道菌群平衡、增強(qiáng)免疫力、預(yù)防腫瘤發(fā)生等方面有很好的功效[15]。

    本研究在前期確定丁酸是青方腐乳特征性風(fēng)味物質(zhì)[12],并從青方腐乳中分離鑒定出丁酸梭菌BP01[16]的基礎(chǔ)上,使用高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)法比較不同類型腐乳丁酸及其他短鏈脂肪酸含量,并研究青方腐乳生產(chǎn)過(guò)程中丁酸變化規(guī)律,對(duì)亨蓋特厭氧滾管法結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)從青方腐乳中分離鑒定的丁酸產(chǎn)生菌部分發(fā)酵特性進(jìn)行分析,研究結(jié)果將有利于發(fā)現(xiàn)富含丁酸的食品資源,并為丁酸梭菌進(jìn)一步應(yīng)用提供一定的參考依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    青方、紅方、白方、低鹽紅腐乳及不同品牌青方腐乳為市售商品,購(gòu)自北京某大型超市。所用菌種大腸桿菌(Escherichia coliO78)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus26003)來(lái)自中國(guó)科學(xué)院微生物研究所,蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)為實(shí)驗(yàn)室保藏。

    短鏈脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品(色譜純)、酪蛋白 美國(guó)Sigma公司;酵母粉、蛋白胨、瓊脂粉 英國(guó)Oxoid公司;乙腈(色譜純) 美國(guó)Dima公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    LC-10A HPLC儀、UV mini 1240紫外-分光光度計(jì)日本Shimadz公司;HPS-250生化培養(yǎng)箱 哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠;A05077厭氧培養(yǎng)罐 重慶江雪科技有限公司;YXQ-SG46-280A蒸汽滅菌器 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;HZQ-F160振蕩培養(yǎng)箱 哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司;TDL-40B臺(tái)式離心機(jī)、TGL-16B冷凍離心機(jī) 上海安亭有限責(zé)任公司;KQ-100E超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;WSZ-100A渦旋振蕩器 上海一恒科技有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 丁酸及其他短鏈脂肪酸含量測(cè)定

    采用HPLC法測(cè)定樣品中丁酸及其他短鏈脂肪酸的含量,參考Zhang Jianhua等[17]的方法,略有改動(dòng)。

    樣品提取液制備:稱取樣品凍干粉0.50 g于50 mL離心管中,加入40 mL蒸餾水,超聲振蕩30 min,8 000 r/min離心20 min,取上清液,過(guò)0.45 μm濾膜制得樣品提取液。

    HPLC檢測(cè)條件:色譜柱:Shimadzu SCR-101(H)(7.9 mm×300 mm,10 μm);流動(dòng)相:5 mmol/L硫酸溶液;柱溫:40 ℃;流速:1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):210 nm。

    1.3.2 丁酸產(chǎn)生菌發(fā)酵特性測(cè)定

    1.3.2.1 生長(zhǎng)曲線和pH值曲線測(cè)定

    將丁酸產(chǎn)生菌活化后稀釋到104CFU/mL,取0.1 mL接種到9.9 mL梭菌增殖培養(yǎng)基中,37 ℃厭氧培養(yǎng),間隔適當(dāng)時(shí)間分別取厭氧管混勻后測(cè)其OD600nm和pH值,繪制生長(zhǎng)曲線和pH值曲線。

    1.3.2.2 不同碳源培養(yǎng)基配制及丁酸產(chǎn)生菌的培養(yǎng)

    以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基按照梭菌增殖培養(yǎng)基(RCM培養(yǎng)基)配制:胰蛋白胨10.0 g、酵母浸膏3.0 g、牛肉浸膏10.0 g、葡萄糖5.0 g、三水合乙酸鈉3.0 g、氯化鈉5.0 g、半胱氨酸鹽0.5 g、0.5%美藍(lán)0.2 mL、瓊脂15.0 g(固體培養(yǎng)基添加)、蒸餾水1 000 mL,調(diào)節(jié)pH值為7.0,滅菌20 min備用。

    以乳酸為碳源的培養(yǎng)基配制:將梭菌增殖培養(yǎng)基中葡萄糖替換為同樣含量的乳酸;以葡萄糖和乳酸為碳源的培養(yǎng)基配制:將梭菌增殖培養(yǎng)基中葡萄糖減半,使用乳酸替換。將0.1 mL活化后稀釋到104CFU/mL的丁酸產(chǎn)生菌接種到9.9 mL以上3 種培養(yǎng)基中,37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h后,按照1.3.1節(jié)方法測(cè)定其發(fā)酵液中丁酸含量。

    1.3.2.3 抑菌能力實(shí)驗(yàn)

    采用瓊脂擴(kuò)散法對(duì)丁酸產(chǎn)生菌抑菌能力進(jìn)行測(cè)定。以大腸桿菌O78、金黃色葡萄球菌26003和蠟樣芽孢桿菌作為指示菌研究其抑菌能力,每個(gè)菌株活化2 次,并將菌懸液濃度調(diào)整為107CFU/mL。吸取稀釋后的指示菌菌懸液0.1 mL,涂布在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上并靜置5 min,使用直徑為6 mm的無(wú)菌打孔器打孔,吸取50 μL離心后的丁酸產(chǎn)生菌發(fā)酵液,分別加入不同孔中,在厭氧條件下培養(yǎng)24 h,觀察是否出現(xiàn)抑菌圈,并記錄包括孔直徑在內(nèi)的抑菌圈直徑,同時(shí)用未接種BP01菌株的RCM培養(yǎng)液作為空白對(duì)照。

    1.3.2.4 食鹽耐受性實(shí)驗(yàn)

    在梭菌增殖培養(yǎng)基中分別添加0、5、8、11 g/100 mL的食鹽,將0.1 mL活化后稀釋到104CFU/mL的丁酸產(chǎn)生菌接種到9.9 mL以上4 種培養(yǎng)基中,37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h后,測(cè)其OD600nm值,研究其食鹽耐受性。

    1.3.2.5 溫度適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)

    將0.1 mL活化后稀釋到104CFU/mL的丁酸產(chǎn)生菌接種到9.9 mL梭菌增殖培養(yǎng)基中,分別在20、28、37 ℃和45 ℃厭氧培養(yǎng)24 h后,測(cè)其OD600nm值,研究其溫度適應(yīng)性。

    1.4 數(shù)據(jù)處理及分析

    使用SPSS 23.0軟件進(jìn)行方差分析,Duncan多重檢驗(yàn)確定數(shù)據(jù)間的差異,P<0.05,差異顯著。每個(gè)樣品測(cè)定3 次,測(cè)定其平均值。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 青方腐乳丁酸及其他短鏈脂肪酸分析

    短鏈脂肪酸是指碳鏈中碳原子數(shù)小于6的有機(jī)脂肪酸,近年研究發(fā)現(xiàn),短鏈脂肪酸在調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、改善腸道功能、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤和調(diào)控基因表達(dá)等方面發(fā)揮積極作用[18]。作為短鏈脂肪酸中最主要的代表,丁酸是結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞的主要能量來(lái)源,在調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡方面發(fā)揮重要作用,受到廣泛關(guān)注[19]。在前期對(duì)青方腐乳關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)研究中發(fā)現(xiàn),丁酸是青方腐乳關(guān)鍵性風(fēng)味成分之一,對(duì)其特征性風(fēng)味形成起重要作用,在此基礎(chǔ)上,使用HPLC法測(cè)定了同一品牌青方、紅方、白方和低鹽紅腐乳的丁酸含量,結(jié)果如圖1所示,青方腐乳丁酸含量明顯高于其他3 種類型腐乳,其含量達(dá)到25.4 mg/g(干質(zhì)量,下同),而紅方、白方和低鹽紅腐乳丁酸含量較低,且三者之間沒(méi)有顯著性差異。不同類型腐乳發(fā)酵方式最大的區(qū)別在于后酵湯料中添加的輔料不同,紅方腐乳誘人的紅色是由于后酵過(guò)程中添加了紅曲米,紅方腐乳后酵湯料中還添加面曲、白酒、食鹽、糖、香料等輔料;白方腐乳在生產(chǎn)過(guò)程中不添加紅曲米,保持本色,但是添加白酒;低鹽腐乳生產(chǎn)過(guò)程中降低了食鹽使用量,添加白酒;青方腐乳與紅方、白方、低鹽腐乳相比后酵湯料不添加白酒,湯料中只含有食鹽、黃漿水和少量花椒,沒(méi)有白酒、外源蛋白酶、紅曲和面曲等物質(zhì)引入,使青方腐乳后酵過(guò)程微生物分布與其他3 種腐乳存在較大差異,已有研究表明,丁酸梭菌生長(zhǎng)會(huì)受到乙醇的抑制,而青方腐乳后酵過(guò)程不添加乙醇,這可能帶來(lái)青方腐乳后酵過(guò)程丁酸梭菌快速增殖,丁酸梭菌代謝產(chǎn)生丁酸,使青方腐乳丁酸含量顯著高于其他類型腐乳。

    圖1 不同類型腐乳丁酸含量比較Fig.1 Comparison of butyric acid contents among different types of sufu

    進(jìn)一步對(duì)其他3 種品牌青方腐乳丁酸含量進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)所測(cè)定的3 種品牌腐乳丁酸含量也較高,均超過(guò)15 mg/g,此外,還測(cè)定了20多種豆豉和豆醬樣品的丁酸含量,發(fā)現(xiàn)它們不含或僅含少量丁酸(數(shù)據(jù)未給出)。這些結(jié)果表明,青方腐乳富含丁酸。丁酸由于在促進(jìn)腸道微生態(tài)平衡、防治結(jié)腸炎和大腸癌等疾病方面有積極的作用而備受關(guān)注,一些以丁酸為前體的藥物被研究和開(kāi)發(fā)。自然存在的丁酸一般由微生物發(fā)酵產(chǎn)生,一些發(fā)酵食品,如清國(guó)醬[20]、納豆[21]、干酪[22]等含有丁酸,其中,文獻(xiàn)報(bào)道干酪丁酸含量為0.13~7.3 mg/g,與之相比,青方腐乳丁酸含量具有優(yōu)勢(shì)。但是,丁酸在高濃度時(shí)有不愉快氣味,限制了其在食品中功能性的發(fā)揮,而丁酸是青方腐乳特征性風(fēng)味之一,對(duì)青方腐乳“聞著臭,吃著香”的獨(dú)特風(fēng)味起貢獻(xiàn)作用,青方腐乳中高濃度丁酸不會(huì)對(duì)其風(fēng)味造成不良影響,可能為丁酸功能性發(fā)揮提供一個(gè)很好的載體。

    圖2 不同類型腐乳其他短鏈脂肪酸含量比較Fig.2 Comparison of contents of other short-chain fatty acids among different types of sufu

    對(duì)同一品牌的4 種腐乳樣品其他短鏈脂肪酸含量進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果如圖2所示。青方腐乳乙酸和琥珀酸(丁二酸)含量最高,與其他3 種腐乳有顯著差異,但是青方腐乳乳酸含量最低,有文獻(xiàn)報(bào)道,乳酸在丁酸菌的作用下可轉(zhuǎn)化為丁酸[23],Bourriaud等[24]也發(fā)現(xiàn)乳酸在腸道內(nèi)主要轉(zhuǎn)化為丁酸,所以青方腐乳的高丁酸含量可能和丁酸菌有關(guān)。白方腐乳乳酸和富馬酸(反丁烯二酸)含量最高,其乳酸含量達(dá)12.95 mg/g,約是青方腐乳的68.16 倍。Han Beizhong等[25]研究發(fā)現(xiàn),白方腐乳中乳酸菌落數(shù)量較其他類型腐乳高,這可能和白方腐乳的高乳酸含量相關(guān)。從短鏈脂肪酸總量看,青方腐乳含量最高,白方腐乳次之,紅方腐乳和低鹽紅腐乳含量較低,這可能與不同類型腐乳生產(chǎn)工藝差異導(dǎo)致其微生物組成不同有關(guān)。

    2.2 青方腐乳生產(chǎn)過(guò)程中丁酸及其他短鏈脂肪酸含量變化

    圖3 青方腐乳生產(chǎn)過(guò)程中丁酸含量變化Fig.3 Changes in butyrate contents during production process of grey sufu

    如圖3所示,白坯丁酸含量較低,僅為0.45 mg/g,接種雅致放射毛霉發(fā)酵48 h后,毛坯中丁酸含量明顯增加,約為白坯的5.21 倍,這與文獻(xiàn)報(bào)道丁酸一般由微生物發(fā)酵產(chǎn)生一致[26]。鹽腌過(guò)程導(dǎo)致丁酸含量減少,這可能與食鹽進(jìn)入坯體引起鹽坯固形物含量增加以及鹽坯水分流失相關(guān)。青方腐乳后發(fā)酵前期,特別是在后酵前30 d,丁酸含量上升迅速,隨后基本穩(wěn)定,在后酵第45天達(dá)到最大值,約為22.47 mg/g,繼續(xù)后發(fā)酵過(guò)程中,丁酸含量輕微降低。這表明,青方腐乳丁酸主要在后發(fā)酵前期產(chǎn)生,前期研究發(fā)現(xiàn)其他類型腐乳丁酸含量甚微,結(jié)合這一結(jié)論推測(cè),不同類型腐乳丁酸含量差異由后發(fā)酵中微生物差異引起。

    圖4 青方腐乳生產(chǎn)過(guò)程中其他短鏈脂肪酸含量變化Fig.4 Changes in contents of other short-chain fatty acids during production process of grey sufu

    如圖4所示,在前酵和鹽腌過(guò)程中,毛坯短鏈脂肪酸含量最高,鹽坯次之,白坯最低,這與毛坯中微生物數(shù)量較多相關(guān),因?yàn)橥ǔUJ(rèn)為短鏈脂肪酸由微生物代謝產(chǎn)生[27]。從單個(gè)短鏈脂肪酸含量看,毛坯中乙酸和乳酸含量最高,與白坯和鹽坯有顯著性差異,毛坯和鹽坯中琥珀酸含量較高,與白坯有顯著性差異,但是毛坯、鹽坯和白坯中富馬酸含量都較低。青方腐乳后發(fā)酵過(guò)程中,乙酸和琥珀酸含量雖然在發(fā)酵中期有輕微波動(dòng),但基本呈上升趨勢(shì),在后酵結(jié)束時(shí),含量分別達(dá)18.56 mg/g和6.21 mg/g。乳酸含量在青方腐乳后酵過(guò)程中呈下降趨勢(shì),特別是后酵前30 d下降明顯,導(dǎo)致青方腐乳后酵結(jié)束時(shí),乳酸含量甚微,這可能與青方腐乳中乳酸在微生物作用下轉(zhuǎn)化為丁酸相關(guān)。

    2.3 丁酸梭菌BP01的部分發(fā)酵特性分析

    發(fā)酵食品中的丁酸大多由細(xì)菌產(chǎn)生,能產(chǎn)丁酸的微生物主要包括梭菌屬(Clostriduim)、丁酸弧菌屬(Butyrivibrio)、丁酸桿菌屬(Butyribacterium)等。前期研究發(fā)現(xiàn)青方腐乳丁酸含量顯著高于其他類型腐乳,所以對(duì)青方腐乳中丁酸產(chǎn)生菌進(jìn)行分離,得到1 株高產(chǎn)丁酸菌株,48 h培養(yǎng)液中丁酸濃度為6.48 mmol/L,對(duì)菌株命名為BP01,分子生物學(xué)鑒定結(jié)果為丁酸梭菌[16]。進(jìn)一步對(duì)丁酸梭菌BP01的部分發(fā)酵特性進(jìn)行研究,以期在青方腐乳發(fā)酵過(guò)程中應(yīng)用丁酸梭菌BP01,從而為提高青方腐乳丁酸含量提供參考。

    圖5 BP01菌株生長(zhǎng)曲線和pH值曲線Fig.5 Growth curve of strain BP01 and pH variation in its fermentation broth

    如圖5所示,菌株在RCM培養(yǎng)基中4 h左右進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,菌落數(shù)指數(shù)上升,代謝產(chǎn)生酸性物質(zhì)使培養(yǎng)基pH值快速下降。從培養(yǎng)液菌落數(shù)看,BP01在18 h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)穩(wěn)定期,pH值穩(wěn)定在5.8左右,而后在約24 h由于形成芽孢,pH值略有上升。

    圖6 碳源對(duì)BP01菌株產(chǎn)丁酸的影響Fig.6 Effect of carbon source on butyric acid-producing capacity of strain BP01

    分別使用葡萄糖、乳酸、葡萄糖+乳酸作為碳源對(duì)BP01菌株進(jìn)行厭氧培養(yǎng),菌株均生長(zhǎng)良好,對(duì)其代謝終產(chǎn)物中的丁酸含量測(cè)定,圖6結(jié)果表明,BP01菌株可以利用葡萄糖和乳酸作為碳源生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生丁酸,雖然二者轉(zhuǎn)化丁酸的效率不同,但是可能因?yàn)锽P01菌株對(duì)兩種碳源利用率有差異,所以葡萄糖和乳酸作為單一碳源的代謝終產(chǎn)物中丁酸累積量沒(méi)有顯著差異。葡萄糖和乳酸同時(shí)作為碳源時(shí),BP01菌株代謝終產(chǎn)物中丁酸含量明顯增加,是葡萄糖和乳酸單獨(dú)作為碳源時(shí)的3 倍多,可能是由于丁酸梭菌BP01在葡萄糖作為碳源存在的情況下代謝乳酸產(chǎn)生丁酸的效率提高,而在乳酸存在條件下,丁酸梭菌對(duì)葡萄糖的利用率也可以得到提升,二者產(chǎn)生了協(xié)同效應(yīng),從而提高了BP01菌株代謝終產(chǎn)物中丁酸含量,這與胡小紅等[28]研究有類似之處,胡小紅等[28]從窖泥中分離鑒定丁酸梭菌BEY8,研究發(fā)現(xiàn)其能代謝乳酸產(chǎn)生丁酸,乳酸的轉(zhuǎn)化效率可進(jìn)行調(diào)控。這與本研究有類似之處。這為下一步實(shí)驗(yàn)提供思路,可以嘗試BP01菌株和乳酸菌共培養(yǎng),利用乳酸菌代謝產(chǎn)生的乳酸提高BP01菌株代謝終產(chǎn)物的丁酸含量,同時(shí)添加這兩種腸道微生態(tài)健康的益生菌到腐乳中,制作低鹽腐乳,增強(qiáng)其促進(jìn)腸道健康的功能性。

    圖7 BP01菌株的抑菌性Fig.7 Antibacterial activity of strain BP01

    傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品中有時(shí)會(huì)檢測(cè)到某些致病微生物,對(duì)產(chǎn)品安全性造成一定隱患,因此,選擇能夠抑制致病菌的有益菌應(yīng)用于發(fā)酵過(guò)程中,對(duì)保證發(fā)酵豆制品的安全性有很大現(xiàn)實(shí)意義。BP01菌株對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌以及蠟樣芽孢桿菌的抑制能力通過(guò)測(cè)定抑菌圈直徑表示,對(duì)照組是未接種BP01菌株的RCM培養(yǎng)液,其抑菌圈直徑為0 mm,說(shuō)明對(duì)照組RCM培養(yǎng)液對(duì)3 種致病菌無(wú)抑制作用,而由圖7可知,BP01菌株對(duì)3 種致病菌具有抑制作用,但抑菌能力有所差異,抑制大腸桿菌能力最強(qiáng),與其他兩種菌有顯著差異,抑菌圈直徑達(dá)12.5 mm。BP01菌株對(duì)蠟樣芽孢桿菌抑制能力略強(qiáng)于金黃色葡萄球菌,但二者無(wú)顯著差異。文獻(xiàn)報(bào)道,丁酸梭菌具有抑制致病菌的能力[29],與本研究一致。因此,作為一種益生菌,丁酸梭菌具有應(yīng)用于發(fā)酵食品,提高發(fā)酵食品微生物安全性的潛力。

    圖8 BP01菌株對(duì)食鹽的耐受性Fig.8 Salt tolerance of strain BP01

    傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品生產(chǎn)過(guò)程中一般會(huì)添加一定量食鹽,用于形成特定風(fēng)味、控制發(fā)酵過(guò)程、抑制腐敗微生物生長(zhǎng)等,因此,考察菌株對(duì)食鹽的耐受性對(duì)其在發(fā)酵豆制品中的潛在應(yīng)用十分必要。根據(jù)腐乳食鹽含量的現(xiàn)狀,設(shè)置5、8 g/100 mL和11 g/100 mL 3 個(gè)食鹽添加量,考察BP01菌株對(duì)食鹽的耐受性,使用OD600nm作為衡量標(biāo)準(zhǔn)。如圖8所示,添加5 g/100 mL和8 g/100 mL食鹽時(shí),BP01菌株生長(zhǎng)幾乎不受影響,其OD600nm對(duì)照(不添加食鹽)無(wú)顯著差異,當(dāng)食鹽添加量達(dá)11 g/100 mL時(shí),BP01菌株的生長(zhǎng)受到輕微抑制,其OD600nm相對(duì)于對(duì)照下降12.34%,但仍可以較好生長(zhǎng),這顯示BP01菌株可以耐受一定量的食鹽,具有應(yīng)用于含鹽食品的潛力。

    發(fā)酵溫度會(huì)對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品品質(zhì)及功能性產(chǎn)生影響[30-31],在生產(chǎn)實(shí)踐中,一般會(huì)依據(jù)主要發(fā)酵菌種生長(zhǎng)特性形成固定的發(fā)酵溫度,因此,應(yīng)對(duì)菌株的溫度適應(yīng)性進(jìn)行研究,以考察其應(yīng)用于特定發(fā)酵豆制品的潛力。根據(jù)腐乳發(fā)酵溫度的現(xiàn)狀,設(shè)置20、28、37 ℃和45 ℃研究BP01菌株的溫度適應(yīng)性。如圖9所示,在28 ℃和37 ℃條件下培養(yǎng),BP01菌株生長(zhǎng)良好,OD600nm無(wú)顯著性差異,20 ℃和45 ℃條件下,BP01菌株生長(zhǎng)略顯緩慢,其OD600nm與37 ℃培養(yǎng)相比,分別降低19.08%和10.53%,但整體上,BP01菌株仍能較好生長(zhǎng),顯示其具有一定的溫度適應(yīng)性。

    圖9 BP01菌株對(duì)溫度的適應(yīng)性Fig.9 Temperature adaptability of strain BP01

    3 結(jié) 論

    本研究在前期確定丁酸是青方腐乳關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)的基礎(chǔ)上,分析青方腐乳丁酸及變化規(guī)律,進(jìn)一步研究從青方腐乳中分離鑒定的產(chǎn)丁酸菌的部分發(fā)酵特性,得出如下結(jié)論:1)青方腐乳富含丁酸,其含量遠(yuǎn)高于紅方、白方和低鹽紅腐乳,可作為丁酸潛在的消費(fèi)載體。2)丁酸主要在青方腐乳后酵前30 d產(chǎn)生,與青方腐乳后酵過(guò)程中丁酸梭菌密切相關(guān);青方腐乳乳酸含量較低,并且在后酵過(guò)程中呈下降趨勢(shì),可能在特定微生物作用下轉(zhuǎn)化為丁酸。3)在前期實(shí)驗(yàn)從青方腐乳中分離鑒定丁酸產(chǎn)生菌的基礎(chǔ)上,研究了高產(chǎn)丁酸的丁酸梭菌BP01部分發(fā)酵特性,結(jié)果表明其培養(yǎng)過(guò)程中較快進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,在培養(yǎng)18 h后進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期,終產(chǎn)物pH值在5.8左右,能利用乳酸作為碳源;BP01菌株抑制大腸桿菌能力最強(qiáng),對(duì)金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌也有抑制作用,能夠耐受一定濃度的食鹽,并表現(xiàn)出一定的溫度適應(yīng)性,有應(yīng)用于腐乳發(fā)酵潛力。

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