葡萄酒泥高價值產物開發(fā)及生物煉制研究概況

郭志君 張王飛 江 璐 房玉林

(1.茅臺學院，貴州 仁懷 564500；2.西北農林科技大學，陜西 咸陽 712100)

葡萄酒釀造過程中會產生大量的廢棄物，如葡萄梗、葡萄皮渣、酒泥等，占葡萄酒產量的20%～30%。葡萄酒廢棄物富含高附加值化合物，經加工可作為食品添加劑或營養(yǎng)劑。

葡萄酒泥(簡稱“酒泥”)是葡萄酒發(fā)酵結束后、貯藏期間以及過濾或者離心后得到的沉淀物和殘渣，占葡萄酒產量的2%～6%[1]。據國際葡萄與葡萄酒組織(OIV)[2]統(tǒng)計，2019年中國葡萄酒產量83萬t，產生廢棄酒泥約1.7～2.6萬t。酒泥以酵母菌殘體為主，富含酒石酸鹽、蛋白質、多糖、多酚等物質，化學需氧量(COD)非常高且具有很高的生物降解性，直接排放污染環(huán)境[3]，也浪費生物資源。目前對果梗、皮渣、果籽等廢棄物的開發(fā)利用研究較多[4-6]，中國關于酒泥開發(fā)利用研究重點關注酒泥陳釀、傳統(tǒng)農畜業(yè)及活性物質提取方面[7-8]。酒泥陳釀可提高酒體圓潤度、豐富香氣[9]，但管理不當可能給酒帶來異味和生物胺含量較高等負面影響，因此酒泥陳釀的應用并不普遍且酒泥消耗量有限；酒泥富含有機質可作為飼料有機肥源[10-11]，但酒泥中鉀離子、多酚含量高，限制其在農畜業(yè)生產中的直接應用，改良措施可一定程度上解決酒泥在飼料中的抗營養(yǎng)問題[12-14]，但由于酒泥儲運成本高而肥料或飼料價格低，商業(yè)應用前景有限；從酒泥中提取酒石酸的研究較充分[15-17]，且在意大利等主要葡萄酒產國已實現工業(yè)化。文章擬對當前酒泥潛在高價值產物開發(fā)和生物煉制的研究情況進行概述，以期為充分開發(fā)酒泥經濟價值、促進葡萄酒產業(yè)清潔生產提供參考。

1 酒泥高價值產物開發(fā)

1.1 制備發(fā)酵營養(yǎng)劑

酒泥作為動物營養(yǎng)品并不十分理想，但其含有豐富的可溶性糖、維生素、礦物質、氨基態(tài)氮、揮發(fā)酸及纖維素，可作為微生物代謝的養(yǎng)分來源或是營養(yǎng)補充劑，且加工處理方法簡單、成本低于商業(yè)酵母提取物[18]，具有較高的開發(fā)利用價值。Dimou等[19]將酒泥中的酒精、酒石酸、多酚提取后，將剩余富含酵母細胞的固體部分用粗酶水解制備發(fā)酵營養(yǎng)劑，在pH 5.5、溫度40 ℃、蛋白水解活性24 U/mL、酒泥質量濃度100 g/L的條件下，酒泥中游離氨基氮(FAN)轉化率最高，用FAN質量濃度為700 mg/L的酒泥水解物為營養(yǎng)源，甘油為碳源，并添加微量元素，培養(yǎng)鉤蟲貪銅菌(CupriavidusnecatorDSM 7237)代謝產生高附加值的聚3-羥基丁酸酯(PHB)達30.1 g/L，充分證實了酒泥發(fā)酵營養(yǎng)劑開發(fā)的價值。

酒泥制備的發(fā)酵營養(yǎng)劑還可用于培養(yǎng)戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus)代謝生產乳酸[20]、培養(yǎng)黑曲霉生產檸檬酸[21]，產率與其他合成介質的結果相當。但全酒泥作為發(fā)酵培養(yǎng)基的應用效果卻較差[22]，可能因營養(yǎng)素過量、多酚等物質抑制了生物轉化過程。所以用酒泥制備發(fā)酵營養(yǎng)劑應與乙醇、酒石酸或者多酚的提取相結合，制得高效營養(yǎng)劑同時也得到其他副產物，充分利用酒泥價值。

1.2 提取酚類物質

酚類物質是具有抗氧化活性并可起到輔助殺菌作用含有多個酚基團的一類活性物質[23]。酒泥中酚類物質含量豐富[24]，根據葡萄酒類型及釀造工藝的不同，含量為1.9～16.3 g/kg，其中小分子的酚類化合物(黃酮醇和吡喃花青素)生物活性強[25]，且價值較高。酒泥中的酚類物質一部分存在于液體餾分(殘余葡萄酒)，另一部分存在于酒泥固體部分，主要是酵母細胞壁吸附的酚類物質，這一部分因吸附作用力較弱，很容易從固體中回收。

酚類物質提取技術包括浸漬、微波輔助、超聲輔助、高壓、脈沖電場提取等[26-28]，其中超聲輔助技術因萃取效率高、操作方便、成本低、對環(huán)境污染小等優(yōu)點受到較大關注。Tao等[29]利用超聲輔助提取酒泥中抗氧化活性物質，最佳提取條件為超聲頻率40 kHz、聲能密度48 W/L、提取時間25 min、溫度60 ℃、料液比(m酒泥∶V乙醇)1∶60 (g/mL)、乙醇體積分數43.9%，此條件下每克干酒泥提取總酚58.8 mg(以沒食子酸計)，高于常規(guī)浸漬對照組，而且表現出良好的儲存穩(wěn)定性。為獲得純度更高、價值也更高的小分子多酚，Meija等[30]利用微波輔助結合膜分離技術從紅葡萄酒泥中提取酚類物質，采用總酚截留率最小(8%)的Etna 01PP膜進行純化，最終得到高質量濃度(782.2 mg/L)小分子多酚活性物質。該技術從酒泥中提取高價值的食品級酚類物質，環(huán)境友好且適合工業(yè)生產，是酒泥提取酚類物質的有效方法之一。

1.3 提取酵母多糖

從酒泥中提取多酚后，剩余的廢棄酵母除用于制備發(fā)酵營養(yǎng)劑，還可用于提取高價值的酵母多糖。酵母多糖是存在于酵母細胞壁中的一種高分子多糖物質，主要由β-葡聚糖和甘露聚糖組成，占細胞壁干重的90%以上[31]。酒泥中因含有大量酵母殘體，可作為提取酵母多糖的廉價原料。

1.3.1β-葡聚糖β-葡聚糖(β-Glucans，β-G)占酵母細胞壁的35%～55%[32]，是第一種被發(fā)現具有免疫活性的葡聚糖，被廣泛應用于食品、醫(yī)藥和農業(yè)生產[33]。從酵母細胞中提取β-G的傳統(tǒng)方法是化學提取法，即用熱堿或酸溶解蛋白質和一些雜多糖，不溶性殘留物即為酵母葡聚糖。楊婷等[34]采用質量分數2% NaCl溶液，在pH 4.5、47.5 ℃ 下誘導酵母自溶，并用質量分數3% KOH溶液去除甘露聚糖，再在質量分數3% NaOH溶液、料液比(m酵母細胞壁∶VNaOH溶液)1∶40 (g/mL)、80 ℃的條件下提取1.5 h，β-G平均得率19.4%。Varelas等[35]采用相似提取方法，提高了自溶過程NaCl溶液濃度、pH、處理溫度和自溶時間，紅葡萄酒泥中β-G提取率29%、白葡萄酒泥中β-G提取率高達43%，說明化學提取工藝條件的改變對提取率有重要影響，且因紅葡萄酒泥中酚類物質抑制多糖提取率，白葡萄酒泥更適合作為提取多糖原料。

酸或堿會導致β-G結構的強烈降解，化學提取法重現性較差、提取純度低，為克服化學提取方法的局限性，Freimund等[36]提出了物理酶提取法，該方法先用熱水破壞細胞壁基質的穩(wěn)定性，再用有機溶劑提取細胞脂質成分、酶溶解剩余的蛋白質，最終得到不溶性成分即β-G。程超等[37]采用高壓均質法和凍融法協同破碎酵母細胞壁，輔以復合蛋白酶和脂肪酶酶解技術，設定均質壓力70 MPa，酵母質量分數13%，均質時間34 min，凍融加水量25%，酒泥中β-G提取率13.2%，純度91.69%。該方法提取純度高、不使用酸堿化學試劑、設備簡單、運轉成本較低，具有一定的工業(yè)化應用價值。

1.3.2 甘露聚糖 酵母細胞壁另一種重要多糖是甘露聚糖(Mannoproteins，MPs)，MPs由甘露糖和少量的蛋白質以共價鍵形式連接，是免疫功能最強的天然多糖之一[38]，被廣泛應用于食品加工[39]、葡萄酒生產[40]等領域。提取方法與β-G相似，主要有化學提取、酶解提取和物理提取。

化學提取有酸法和堿法兩種提取方法，酸法浸提可能導致多糖水解且產物中含有β-G等多糖雜質；堿法浸提產物純度相對較高，楊學山等[41]以酒泥為原料，按酵母細胞誘導自溶、KOH提取、脫蛋白精制、乙醇醇析、丙酮、乙醚洗滌、透析、干燥的流程，在料液比(m酵母自溶后的細胞壁∶VKOH溶液)1.0∶17.5 (g/mL)、KOH質量分數3%、浸提時間1.5 h、浸提溫度100 ℃的工藝條件，甘露聚糖提取率18.4%。堿法過程中用到大量堿液，對環(huán)境有一定的污染[42]。酶解提取是利用葡聚糖酶將β-G水解，從而使MPs釋放到液相中，提高提取純度，綠色環(huán)保且成本低，適合制備用于葡萄酒蛋白穩(wěn)定的MPs。但目前只有用酶解法從釀酒酵母或啤酒廢酵母中提取MPs的研究報道，用酶解法從葡萄酒泥中提取MPs的研究還有待探索。物理法則是用熱水浸提清除葡聚糖和部分水溶性蛋白質，離心后上清液用乙醇沉淀得甘露聚糖。李潁等[43]將酒泥中的酵母細胞壁誘導自溶，用高溫熱水提取法，在料液比(m酵母自溶后的細胞壁∶V水)1∶23 (g/mL)、溫度124 ℃、浸提5 h、浸提3次的最優(yōu)條件下，MPs提取率14.3%。物理方法提取MPs純度低于酶處理法[44]，不適合作為葡萄酒添加劑，但可用于其他食品添加，安全環(huán)保且適合工業(yè)化生產。

另外，采用β-G和MPs同時提取的方法可獲得多糖混物。石豪磊等[45]用超聲輔助—堿—酶復合方法，提取酒泥廢酵母細胞壁總多糖，Iseppi等[46]用透析法代替乙醇溶解，利用酶解法從酒泥中取提制備乳化劑的MPs，產物中含有具有增稠作用的可溶性β-G，提高了乳化劑穩(wěn)定性。因此結合酵母多糖產物目標用途選擇提取方法，更具實踐意義。

1.4 其他

除酵母多糖外，還有酒泥中提取海藻糖[47]、谷胱甘肽[48]、SOD[49]、白藜蘆醇[50]、角鯊烯[51]等活性物質的研究報道，因提取率低、提取工藝復雜或提取試劑環(huán)境不友好等原因較難推廣應用，但為酒泥開發(fā)利用提供了豐富的參考。

國外學者還進行了一些酒泥創(chuàng)新應用的研究，例如燒制輕磚時加入質量分數5%細酒泥，不降低輕磚的機械強度和物理性能且隔熱性能增加[52]，適合保溫輕磚的生產；冰激凌制作均質階段加入20 g/kg的優(yōu)質酒泥，其抗氧化性能顯著提高，其風味、質地、口感和整體可接受性較高[53]，這些創(chuàng)新研究為提高酒泥經濟價值提供了新思路。

2 生物煉制

以上研究表明酒泥具有較好的開發(fā)潛力，但各種利用方法都是獨立的，未形成系統(tǒng)開發(fā)應用，只收回其中的一種或兩種物質，不足以減少最終剩余廢棄物對環(huán)境的污染，酒泥也未得到充分利用。為更充分地從酒泥中提取有價值化合物，國外學者開展了酒泥系統(tǒng)利用的研究，即生物煉制。生物煉制(Biorefinery)是指利用農業(yè)廢棄物、植物基淀粉、木質纖維素等生物質原料，生產各種化學品、燃料和生物基材料的過程[54]，全方位、充分地利用食品供應鏈廢棄物，是環(huán)境可持續(xù)發(fā)展的化學和能源經濟轉變的重要手段[55]。生物煉制為酒泥綜合利用和葡萄酒產業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供了新的思路。

2.1 生物煉制方法

酒泥的生物煉制過程如圖1所示，即首先將酒泥離心成固體和液體兩部分，液體部分蒸餾得到乙醇；固體部分依次提取多酚抗氧化劑和酒石酸；剩余富含酵母細胞的固體再酶解制得發(fā)酵營養(yǎng)劑；提取過程還可充分利用自身副產物，如第一步分離得到的乙醇和殘液可用于后續(xù)提取流程。

圖1 葡萄酒泥生物煉制過程示意圖Figure 1 Process flow diagram of the wine lees refining concept

Dimou等[56]在實驗室模擬生物煉制，以美樂葡萄酒泥為研究對象，10 ℃下將酒泥離心15 min(12 000 g)，蒸餾上清液，產生乙醇和無醇液體；沉淀物以體積分數80%丙酮和體積分數60%甲醇順序萃取、離心，上清液中制得多酚化合物；殘余固體加水溶解，再用HCl(37%)處理10 min，離心得到溶解酒石酸；殘余固體酶解制備發(fā)酵營養(yǎng)劑。最終得到質量分數5.7%乙醇、0.8% 多酚粗提物、6.5%酒石酸鹽、8.4%酵母細胞，水和雜質分別占62.9%和15.8%，酵母細胞水解后制備發(fā)酵營養(yǎng)劑。Kopsahelis等[57]在以上研究的基礎上，細化了酒泥生物煉制過程中酚類物質提取研究，研究表明酒泥第一次分離得到的液相和固相部分提取的酚類物質成分不同，建議用酒泥煉制產生的乙醇進行酚類物質的萃取，減少化學試劑的使用，并創(chuàng)新地在酒泥酶解物中添加蛋白濃縮物(來自奶酪生產副產物乳清)培養(yǎng)彎曲隱球菌(Cryptococcuscurvatus)和拉曼被孢霉菌(Mortierellaramanniana)制備生物油脂，為酒泥廢棄物的生物煉制打開了新的思路。

2.2 生物煉制價值評估

生物煉制為酒泥綜合利用提供了新思路，實際應用還須考慮處理成本和整體效益，即價值評估。評估方法主要是通過建立酒泥生物煉制廠模型，以產物、物質消耗和能源消耗為評價指標(如圖2所示)，利用現代統(tǒng)計分析方法進行評估。

圖2 葡萄酒泥生物煉制過程能源及物料消耗Figure 2 Energy and material consumption of the wine lees biorefifinery

Dimou等[56]利用UniSim軟件建模，考量能源、物料、廢棄物處理、固定資產投入、貨幣價值等因素，認為酒泥生物煉制經濟價值與酒泥處理量相關。酒泥提取最高價值產物(抗氧化物質)的最低售價與酒泥處理量呈反比，500 kg/h處理量的酒泥煉制廠，抗氧化物售價122美元才能維持投入產出平衡，如果處理量為5 000 kg/h，則最低售價只需11.1美元。因此僅從投入產出角度考量，只有像意大利、法國、西班牙這樣的主要葡萄酒產國，酒泥生物煉制才具有經濟性。蒸汽是酒泥處理的主要能耗，每處理1 t酒泥耗蒸汽5 104 kg，如用葡萄酒生產中的廢棄葡萄枝條、果梗作為制備蒸汽的燃料，酒泥生物煉制的經濟性將大幅度提升[58]。綜合考慮酒泥生物煉制過程有效減少酒泥污染物排放帶來的環(huán)境效益和煉制廠創(chuàng)造就業(yè)機會帶來的社會效益[59]，普遍認為酒泥生物煉制具可觀前景。

3 中國葡萄酒泥開發(fā)存在的問題及應對措施

2000年以來中國葡萄酒產量呈上升態(tài)勢，葡萄酒工業(yè)生產日益重要，葡萄栽培及釀造工藝已達世界先進水平，但廢棄物處置能力還較為落后，特別是酒泥幾乎全部直接排放。分析中國葡萄酒泥開發(fā)存在的問題有以下三方面。

3.1 酒泥收集保存方法研究不足

中國葡萄酒生產集中在8—11月，酒泥集中在11—12月排放，非釀酒季節(jié)酒泥排放量少，而且中國葡萄酒產區(qū)分布廣，多數大型酒廠相距較遠。導致酒泥收集困難，液態(tài)酒泥易變質低溫保存成本高，導致酒泥加工成本增加，經濟效益差。

因此加強酒泥保存、預處理的研究，是推動中國酒泥資源綜合利用工業(yè)化的首要任務。目前可參考啤酒泥回收的預處理方式，收集的酒泥先通過過濾、離心或陶瓷膜分離設備[60]進行固液分離，液體部分蒸餾酒精，固體部分根據后續(xù)加工目的采用干燥或冷凍工藝處理，得到方便保存運輸的固態(tài)或半固態(tài)酒泥。

3.2 酒泥開發(fā)利用研究不充分

中國學者對酒泥的開發(fā)利用研究較少，且主要為酒泥陳釀方式和效果、飼料添加效果及酒泥中廢棄酵母活性成分提取工藝研究，而對酒泥直接應用的受限機理、產物價值、提取工藝是否環(huán)保等問題研究較少，對酒泥全鏈條開發(fā)研究幾乎空白。

因此加強酒泥抗營養(yǎng)因子機理、高價值多酚提取、環(huán)境友好方法和生物煉制的深入研究是提升酒泥經濟價值、促進中國酒泥資源綜合利用的理論支撐。同時，處理成本與經濟效益是酒泥能否被有效回收利用的重要因素之一，因此還應結合中國國情開展酒泥利用經濟價值評估研究。

3.3 推動酒泥開發(fā)的政策法規(guī)不健全

目前中國還沒有建立酒泥廢棄物處理相關制度，因缺少約束葡萄酒生產企業(yè)缺乏廢棄物處理的自覺性，學者對酒泥應用研究也未提到迫切日程。另一方面，建立酒泥廢棄物加工處理廠前期投入大、盈利難，絕大多數企業(yè)無力獨立運營。

因此健全酒泥廢棄物處理法規(guī)制度并配套扶持政策是中國葡萄酒泥綜合利用的政策保障。借鑒國外經驗，例如西班牙政府收取較高葡萄酒廢棄物處理費，所得稅費用于廢棄物處理及科學研究，且非法排放造成環(huán)境污染的罰款金額逐漸增加，違規(guī)排放要繳納3萬～4萬歐元的罰金甚至受到刑事處罰[18]，因此企業(yè)和科研機構對酒泥廢棄物的處置和利用研究十分重視而且取得較好效果。同時，還需國家層面出臺扶持政策，支持和引導產區(qū)企業(yè)共建酒泥生物煉制廠，形成共擔成本、共享收益、共促葡萄酒產業(yè)持久健康發(fā)展的新格局。

4 結語

葡萄酒泥直接排放污染環(huán)境，也浪費寶貴的生物資源。酒泥加工成微生物發(fā)酵營養(yǎng)劑、提取酵母多糖和多酚物質，可變廢為寶創(chuàng)造較高的經濟價值，酒泥生物煉制研究也充分展示了其整體利用的可行性。目前中國酒泥開發(fā)利用還處于起步階段，面臨產能不集中、研究不充分、政策法規(guī)不健全等問題。為解決葡萄酒生產過程酒泥環(huán)境污染問題、加強酒泥資源開發(fā)利用、促進中國葡萄酒產業(yè)健康發(fā)展，還需進一步加強酒泥開發(fā)利用的理論研究和生產實踐探索。