植物葉綠素代謝途徑及其分子調(diào)控

李 根，張 成，王 強(qiáng)，王 科，劉思汐，楊 勛，吳繼開(kāi)，卿秋靜

(成都市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣總站，四川 成都 610041)

1 葉綠素代謝途徑的研究進(jìn)展

葉綠素(chlorophyll)是一類與植物光合作用有關(guān)的最重要的色素。高等植物葉綠素主要為葉綠素a和葉綠素b，兩者的差異在于吡咯環(huán)Ⅱ的附加基團(tuán)上，葉綠素a為甲基(-CH3)，葉綠素b為甲醛基(-CHO)。結(jié)構(gòu)的差異導(dǎo)致兩者的顏色存在明顯的差異，葉綠素a呈藍(lán)綠色，葉綠素b呈黃緑色。葉綠素吸收大部分的紅光和紫光但反射綠光，所以葉綠素呈現(xiàn)綠色，它在光合作用的光吸收中起核心作用。葉綠素分子核心部分為卟啉環(huán)(Porphyrin ring)，具有光能吸收的功能；而側(cè)鏈部分為較長(zhǎng)的脂肪烴(葉綠醇，Phytol)，是葉綠素插入到類囊體膜上的支點(diǎn)。

葉綠素的生物合成及降解途徑較為復(fù)雜(如圖1所示)，合成途徑包括15步酶促反應(yīng)，其中涉及的酶由27個(gè)相關(guān)基因編碼；降解途徑分為兩步，第一步在葉綠體中進(jìn)行，有4種酶參與，葉綠素被降解為無(wú)色的、藍(lán)色熒光中間產(chǎn)物pFCC，第二步是經(jīng)過(guò)修飾的pFCC在液泡中發(fā)生非酶學(xué)異構(gòu)最終形成非熒光葉綠素代謝產(chǎn)物NCCs。

降解途徑的研究進(jìn)程重要的轉(zhuǎn)折點(diǎn)是1991年Kr?utler等發(fā)現(xiàn)了大麥中非熒光葉綠素代謝物(Hv-NCC-1)。NCCs被解析之后，研究人員以脫鎂葉綠酸a為底物，進(jìn)行體外轉(zhuǎn)化，相繼鑒定了紅色葉綠素代謝物(RCC)及其還原產(chǎn)物即初級(jí)熒光葉綠素代謝物(pFCC)。葉綠素降解過(guò)程早期發(fā)生在葉綠體中，但其代謝“終”產(chǎn)物非熒光葉綠素代謝產(chǎn)物(NCC)存儲(chǔ)在液泡中。葉綠素b能在葉綠素b還原酶作用下還原生成葉綠素a。據(jù)截止目前的報(bào)道，Chl a在去鎂離子去植基生成脫鎂葉綠酸a(Pheide a)的過(guò)程中存在2條不同途徑：一條途徑是Chl a在葉綠素酶(CLH)和脫鎂螯合酶(MCS)作用下脫去植基與鎂離子，最后生成Pheide a；另一種途徑則是以脫鎂葉綠素為中間產(chǎn)物，在脫植基之前在MCS作用下先除去鎂離子，生成的Phein a則在脫鎂葉綠素酶(PPH)作用下除去植基，最后也生成Pheide a。然而，第一條降解途徑早已受到質(zhì)疑。有研究表明，擬南芥編碼Chlase基因突變體仍能在衰老過(guò)程中降解葉綠素，表明了葉綠素酶并不是葉綠素早期代謝過(guò)程中必需的酶。PPH已被證實(shí)對(duì)Phein a有專一性，是真正負(fù)責(zé)葉綠素脫植基的水解酶。因此，認(rèn)為葉綠素早期代謝過(guò)程以第2條代謝途徑存在較為合理(如圖1所示)。葉綠素脫植基脫鎂離了后生成的Pheide a在脫鎂葉綠酸a加氧酶(PA0)和紅色葉綠素代謝產(chǎn)物還原酶(RCCR)作用下，最后生成初生熒光葉綠素代謝產(chǎn)物(pFCC)，其中間產(chǎn)物為紅色葉綠素代謝產(chǎn)物(RCC)。

圖1 高等植物葉綠素代謝途徑

2 葉綠素合成及降解途徑關(guān)鍵酶

在葉綠素代謝途經(jīng)中，近年來(lái)隨著物質(zhì)代謝分析手段、生物信息學(xué)等的發(fā)展進(jìn)步，新的觀點(diǎn)不斷涌現(xiàn)，從單純的代謝途徑，逐步深入到調(diào)控機(jī)制。其中報(bào)道較多的關(guān)鍵酶包括7種。

2.1 葉綠素合成途徑關(guān)鍵酶及其調(diào)控

2.1.1 原脫植基葉綠素還原酶(POR) 原脫植基葉綠素在光照和NADPH存在下，由NADPH原脫植基葉綠素還原酶(POR)催化形成脫植基葉綠素a是葉綠素生物合成途徑和葉綠體發(fā)育過(guò)程最關(guān)鍵的需光過(guò)程。在生物體中，催化原脫植基葉綠素還原形成脫植基葉綠素a的酶可分為2種：不依賴光的NADPH原脫植基葉綠素還原酶(DPOR)和依賴光的NADPH原脫植基葉綠素還原酶(POR)。無(wú)氧光合細(xì)菌只有DPOR酶，光合細(xì)菌、藍(lán)細(xì)菌、藻類和裸子植物具有兩種POR酶，而被子植物只有POR酶。因此，無(wú)論黑暗或光照條件，光合細(xì)菌、藍(lán)細(xì)菌、藻類和裸子植物都能合成chl；而被子植物幼苗在黑暗條件下則會(huì)發(fā)育形成黃化苗。

目前，已經(jīng)從大麥、擬南芥等植物中分離到3種POR基因：PROA、PORB、PORC。PORA和PORB普遍存在，在黃化幼苗中形成。同時(shí)CAOPORACAO作為植物黃化幼苗質(zhì)體中的主要蛋白酶，是光誘導(dǎo)葉綠體發(fā)育起始時(shí)期唯一具有活性的POR。與PORA不同的是，PORBCAOmRNA則是隨著光照時(shí)間的延長(zhǎng)，其含量也逐漸升高。PORC是最后一個(gè)被鑒定出的POR基因，它主要在植物迅速積累chl時(shí)期到質(zhì)體發(fā)育成熟的過(guò)程中起著重要作用。在黃化幼苗中，其mRNA水平很難檢測(cè)到，但是在光照之后卻有顯著的增加。

2.1.2 脫植基葉綠素a加氧酶(CAO) 脫植基葉綠素a加氧酶(CAO)作為一種Rieske型單加氧酶，能專一識(shí)別脫植基葉綠素a，通過(guò)兩步氧化反應(yīng)將其C7側(cè)鏈上的甲基(-CH3)氧化成甲?；?-CHO)，形成脫植基葉綠素b。然后脫植基葉綠素b由葉綠素合酶(CS)催化在D環(huán)加上一個(gè)植醇尾巴，形成葉綠素b。因此，CAO在葉綠素b的生物合成過(guò)程具有極其重要的作用。CAO基因編碼脫植基葉綠素a加氧酶，最早從萊茵衣藻中分離出來(lái)。隨后在藻類、擬南芥和水稻中也相繼得到了分離和鑒定。此外，高等植物CAO的氨基酸序列一般含有4個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，從N末端開(kāi)始依次為導(dǎo)膚序列、A domain、B domain和C domain，而原核生物并沒(méi)有A domain和B domain。C domain包含一個(gè)Rieske簇和一個(gè)鐵結(jié)合基元，該結(jié)構(gòu)域具有催化活性，能催化脫植基葉綠素a轉(zhuǎn)化為脫植基葉綠素b。將缺失A domain的CAO基因轉(zhuǎn)入擬南芥后，轉(zhuǎn)基因植株中的CAO蛋白含量顯著下降，同時(shí)葉片中葉綠素a/b的比值也減小；相似地，使僅含有C domain的藻類CAO基因在擬南芥中過(guò)表達(dá)后，葉綠素a/b的比值也顯著減小。由此說(shuō)明，A domain參與調(diào)節(jié)CAO蛋白的表達(dá)。然而這種調(diào)節(jié)機(jī)制并不存在于葉綠素b合成缺陷突變體中，其CAO蛋白的表達(dá)水平受葉綠素b含量的調(diào)節(jié)。目前關(guān)于domain B的生物學(xué)功能仍是不太清楚，僅從B domain中鑒定出了一個(gè)基元結(jié)構(gòu)-PEST motif，從結(jié)構(gòu)上看其屬于親水性氨基酸序列。它的功能主要是充當(dāng)A domain和C domain的鏈接者，起到穩(wěn)定CAO蛋白的作用，并不能參與調(diào)節(jié)CAO蛋白的表達(dá)。

2.1.3 鎂離子螯合酶(CHL) 鎂原卟啉IX合成始于原卟啉IX，隨后經(jīng)多步酶促反應(yīng)最終形成葉綠素。催化該途徑的酶是鎂離子螯合酶(CHL)。鎂離子螯合酶是一個(gè)ATP依賴的異源聚合酶，由I、D和H3個(gè)亞基組成。研究者們利用鎂離子螯合酶3個(gè)亞基的重組蛋白進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，鎂離子螯合酶激活步驟需要I亞基、D亞基、ATP以及鎂離子的共同參與；而在鎂離子螯合步驟中，H亞基被認(rèn)為是鎂離子螯合酶的催化亞基，能結(jié)合底物原卟啉IX，結(jié)合了底物原卟啉IX的H亞基與ATP-I-D-Mg2+復(fù)合物結(jié)合后，D亞基發(fā)生變構(gòu)，I亞基的ATP酶活性被激活從而水解ATP為鎂離子螯合提供能量；此時(shí)，形成的鎂離子螯合酶全酶將鎂離子螯合到原卟啉IX中形成鎂原卟啉IX，完成整個(gè)催化過(guò)程。目前研究表明，參與調(diào)控鎂離子螯合酶活性的因素包括光照和晝夜節(jié)律、葉綠體氧化還原狀態(tài)及鎂離子螯合酶各亞基之間的相互作用等(圖2)[1]。

圖2 植物鎂離子鰲合酶活性調(diào)控及參與的信號(hào)通路[1]

光照和晝夜節(jié)律能調(diào)控鎂離子螯合酶各亞基CHLI、CHLD和CHLH基因表達(dá)。在去白化過(guò)程中，高等植物鎂離子螯合酶各亞基受光照誘導(dǎo)后表達(dá)量明顯上調(diào)。此外，晝夜節(jié)律對(duì)植物鎂離子螯合酶各亞基的表達(dá)具有調(diào)控作用，且呈現(xiàn)不同的調(diào)控模式。在去白化過(guò)程中，光照是鎂離子螯合酶基因表達(dá)的重要調(diào)控因素；而晝夜節(jié)律同樣是鎂離子螯合酶基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)因素。這暗示著鎂離子螯合酶基因轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控是鎂離子螯合酶活性調(diào)控的關(guān)鍵點(diǎn)。在黑暗下，葉綠體中處于氧化狀態(tài)，TRX-F和TRX-M等葉綠體氧化還原調(diào)控蛋白氧化鎂離子螯合酶，鎂離子螯合酶失去催化活性。在光照下，葉綠體中處于還原狀態(tài)，I亞基半胱氨酸巰基被葉綠體氧化還原調(diào)控蛋白還原，鎂離子螯合酶恢復(fù)活性，催化葉綠素合成。

2.2 葉綠素降解途徑關(guān)鍵酶及其調(diào)控

2.2.1 葉綠素酶(CLH) 葉綠素酶(CLH)是葉綠素分解代謝第一條途徑的起始酶，Harpaz-Saad等[2]對(duì)柑橘(Citrussinensis)CLH的異源表達(dá)研究表明，CLH是一個(gè)葉綠素分解代謝的限速酶。細(xì)胞通過(guò)剪切多肽 N端與Glu脫羧酶結(jié)合的調(diào)控結(jié)構(gòu)域，或者負(fù)責(zé)膜結(jié)合的結(jié)構(gòu)域而進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。目前，通過(guò)體外研究已經(jīng)對(duì)葉綠素酶的催化特性，如動(dòng)力學(xué)參數(shù)、pH值與溫度的影響等有了比較詳細(xì)地了解。葉綠素酶的測(cè)活體系與一般的酶有所不同。在有機(jī)溶劑或去垢劑存在時(shí)，葉綠素酶在室溫時(shí)即可表現(xiàn)活性，而在以水為微環(huán)境的反應(yīng)體系中，其表現(xiàn)活性的溫度較高(65～75℃ )。葉綠素酶在微堿性(pH值7.5～8.0)環(huán)境中催化活性高，橄欖的葉綠素酶的最適pH值是8.5，而柑橘葉片葉綠素酶的最適pH 為7.8。盡管有學(xué)者指出CLH在葉綠素降解過(guò)程中無(wú)足輕重[3]，但是仍有不少研究證明CLH在葉綠素降解過(guò)程中起到了毋庸置疑的作用。與葉綠素酶生理研究相比，在分子水平上研究葉綠素酶還比較少，在葉綠素酶基因克隆或轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)的研究不多，在葉綠素酶的研究中還存在著許多棘手問(wèn)題。

2.2.2 脫鎂鰲合酶(MCS) 脫鎂鰲合酶(MCS)催化葉綠素a脫去鰲合的鎂原子形成脫鎂基葉綠素a。迄今為止，該酶是唯一發(fā)現(xiàn)具有催化葉綠素a轉(zhuǎn)化為脫鎂基葉綠素a功能的酶。通過(guò)比較衰老與未衰老葉綠體中的活性，發(fā)現(xiàn)此酶與葉綠素酶一樣，也屬于組成性表達(dá)的酶，但與葉綠素酶不同的是，在衰老葉片中保持MCS的活性需要不斷地有新的蛋白質(zhì)合成。脫鎂鰲合酶(MCS)具有熱穩(wěn)定性，且在不同植物中分子量較低且不一致。Shioi等[4]從藜葉片中發(fā)現(xiàn)了一種耐熱的、具有MCS活性的小分子物質(zhì)。Matile等[5]認(rèn)為，此種小分子物質(zhì)可能就是MCS的輔基。值得一提的是，催化反應(yīng)的產(chǎn)物脫鎂基葉綠酸a是一種可見(jiàn)光的敏感物質(zhì)，此物質(zhì)可以在無(wú)氧條件下對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行光裂解。

2.2.3 脫鎂葉綠素酶(PPH) 脫鎂葉綠素酶(PPH)是葉綠素降解代謝的關(guān)鍵酶，在葉綠素降解過(guò)程中PPH是卟啉—植醇水解過(guò)程參與的候選酶，對(duì)脫鎂葉綠素很活躍，但對(duì)葉綠素卻沒(méi)有作用。PPH酶的作用是將脫鎂葉綠素a轉(zhuǎn)換為脫鎂葉綠酸a。在葉片衰老過(guò)程中PPH基因的表達(dá)加強(qiáng)，加快脫鎂葉綠素a轉(zhuǎn)換為脫鎂葉綠酸a，加速葉片衰老。PPH酶的缺失能夠造成植物滯綠表現(xiàn)型，是一種非功能的滯綠，葉綠素代謝在一定程度上受損，葉綠素緩慢降解，葉片保綠時(shí)問(wèn)較長(zhǎng)，衰老被延遲。

2.2.4 脫鎂葉綠酸a加氧酶(PAO)SID基因是編碼PAO(脫鎂葉綠酸a加氧酶)的基因，負(fù)責(zé)控制葉綠素大卟啉環(huán)的降解，而該基因具有加速細(xì)胞死亡的功能。PAO能將脫鎂基葉綠酸a(Pheide a)降解為不穩(wěn)定的紅色葉綠素代謝產(chǎn)物(RCC)后最終形成無(wú)色的初生熒光葉綠素代謝產(chǎn)物(pFCC)，是葉綠素降解途徑中脫綠代謝的關(guān)鍵步驟。PAO酶作用于葉綠素降解的方式較靈活，如持綠蛋白SGR可通過(guò)影響PAO酶的活性使植物表現(xiàn)為滯綠或黃化。PAO編碼基因缺失會(huì)產(chǎn)生滯綠突變體，而PAO基因的表達(dá)與衰老密切相關(guān)。在植株衰老和傷害時(shí)PAO基因表達(dá)水平上調(diào)，在葉片衰老后期，PAO活性達(dá)到最高；在衰老的葉片中，抑制PAO的活性，將導(dǎo)致脫鎂葉綠酸a的積累和葉綠素降解的抑制；在滯綠突變體的葉片衰老過(guò)程中PAO活性非常低。因此通常認(rèn)為編碼該酶的基因突變是滯綠突變體保持綠色的原因之一。

SGR/SGRL基因的鑒別是近年來(lái)葉綠素降解調(diào)控研究中的一個(gè)里程碑。高等植物的滯綠基因SGR家族主要存在2種進(jìn)化分支，包括SGR亞家族和SGRL亞家族。2個(gè)亞家族的成員在單子葉及雙子葉植物中均存在，但在雙子葉植物和單子葉植物類群中，SGR/SGRL亞家族所包括的同源基因數(shù)目不同。雙子葉植物擬南芥中已發(fā)現(xiàn)3個(gè)SGR同源基因， 分別為SGR1(At4g22920)、SGR2(At4g11910)和SGRL(At1g44000)。滯綠基因SGR的功能與葉綠素降解調(diào)控有關(guān)，它可能通過(guò)激發(fā)NYC、PPH 、PAO、RCCR等多個(gè)葉綠素降解酶與捕光復(fù)合物II(LHCII)相互作用，形成SGR-CCE-LH-CII復(fù)合體，促使葉綠素分子從LHCII上解離，并構(gòu)成一個(gè)有助于葉綠素快速降解的“代謝通道”。SGR1和SGR2還可以形成同源或異源二聚體，SGRL也可以與SGR1、SGR2形成同源或異源二聚體，這種二聚體結(jié)構(gòu)可能在一定程度上能夠調(diào)節(jié)SGRL基因的活性。SGR2基因在葉綠素降解過(guò)程中與SGR1起拮抗作用，可能是SGR1和SGR2形成異源二聚體時(shí)， 削弱了SGR1與CCEs互作的能力。SGR基因在擬南芥葉片衰老中的功能如圖3所示。

圖3 SGR基因在擬南芥葉片衰老中的功能

除了持綠蛋白SGR，一些激活因子(如ATAF1)同樣可以上調(diào)PAO的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)葉綠素的降解。Ghandchi等[6]通過(guò)對(duì)幾組擬南芥基因組和生物信息學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行重新分析發(fā)現(xiàn)植物ATAF1等轉(zhuǎn)錄因子在溫暖條件、葉片衰老、干旱等條件脅迫下會(huì)因觸發(fā)植物應(yīng)對(duì)這些逆境的響應(yīng)進(jìn)而通過(guò)上調(diào)PAO表達(dá)調(diào)控葉綠素降解。這些轉(zhuǎn)錄因子形成一個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，共同行使其調(diào)控功能，影響植物葉綠素的降解(如圖4所示)。

圖4 葉綠素降解調(diào)控關(guān)系

3 葉綠素代謝途徑關(guān)鍵基因

葉綠素代謝途徑關(guān)鍵酶及其編碼基因詳見(jiàn)表1。

表1 葉綠素代謝關(guān)鍵酶及其編碼基因

4 展望

目前，葉綠素生物合成及降解途徑已較為清晰，其中關(guān)鍵酶及編碼基因已有許多報(bào)道，但仍然存在許多問(wèn)題仍未解決，比如有研究首次發(fā)現(xiàn)在成熟香蕉皮中檢測(cè)到被高度修飾的熒光葉綠素代謝物( hFCCs)[7]，緊接著在香蕉葉和白鶴芋葉中也發(fā)現(xiàn)了hFCCs[8]，這就意味著在pFCC之后可能存在其他中間產(chǎn)物，或者在pFCC之后葉綠素降解途徑可能開(kāi)始有了新的分支，那么，就植物體在不同條件下的葉綠素代謝而言，是否伴隨有其他途徑，有待進(jìn)一步證實(shí)；其次，涉及基因的功能和作用機(jī)理也尚未完全清晰，近年來(lái)涉及葉綠素代謝關(guān)鍵基因的研究主要集中在一些突變體中，對(duì)于功能驗(yàn)證方面報(bào)道較少；最后，對(duì)于葉綠素降解調(diào)控的研究，多集中于SGR和LHCP II-葉綠素復(fù)合體，有關(guān)調(diào)控的分子信號(hào)，降解產(chǎn)物與關(guān)鍵酶之間的相互作用等尚不清楚，值得深入探究。