不同圖形刺激對(duì)小鼠圖形視覺(jué)誘發(fā)電位的影響

王玨，馬博文，張偉，史學(xué)鋒

視覺(jué)誘發(fā)電位（visual evoked potentials，VEP）是從視皮層腦電活動(dòng)中提取的視覺(jué)刺激誘發(fā)的電生理信號(hào)，反映視覺(jué)通路功能的完整性，是一種客觀、有效的檢查方法，可為視覺(jué)系統(tǒng)疾病的診斷提供重要依據(jù)［1-2］。其刺激模式主要包括圖形刺激和閃光刺激，常用的圖形刺激主要有翻轉(zhuǎn)棋盤方格刺激和光柵刺激。由于閃光視覺(jué)誘發(fā)電位（flash visual evoked potential，F(xiàn)VEP）個(gè)體間變異較大，一般只在屈光介質(zhì)透明度差或注視不佳時(shí)采用［3］。圖形視覺(jué)誘發(fā)電位（pattern visual evoked potential，PVEP）在波形和時(shí)序上的變化較小，因此其在眼科臨床檢查中常作為首選。臨床檢查通常使用翻轉(zhuǎn)棋盤方格刺激來(lái)評(píng)估患者的視覺(jué)功能［4-5］。然而，在動(dòng)物電生理研究方面，國(guó)際臨床視覺(jué)電生理協(xié)會(huì)（International Society for Clinical Electrophysiology of Vision，ISCEV）尚未出臺(tái)相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)［3］，翻轉(zhuǎn)棋盤方格［6-7］、水平［8-9］或垂直［10］光柵圖形都可被用來(lái)評(píng)估動(dòng)物的視覺(jué)功能。小鼠的基因序列與人類具有高度相似性，已成為眼科與視覺(jué)科學(xué)研究中最常用的模式動(dòng)物。然而，相比于體積較大的動(dòng)物，要在小鼠上記錄到穩(wěn)定的PVEP波形較為困難，并且不同的圖形刺激在小鼠PVEP檢測(cè)中是否存在差異，哪種刺激更具有優(yōu)勢(shì)，鮮見(jiàn)詳細(xì)報(bào)道。本研究采用腦表面埋置電極的記錄方法，獲得了高質(zhì)量的小鼠PVEP結(jié)果，分析了水平光柵刺激、垂直光柵刺激和翻轉(zhuǎn)棋盤方格刺激在小鼠PVEP檢測(cè)方面的具體差異，以期為更好地開展眼科與視覺(jué)科學(xué)相關(guān)研究提供基礎(chǔ)性數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 22只6周齡SPF級(jí)C57BL/6J小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，體質(zhì)量16～20 g，均為雄性，屈光間質(zhì)清晰透明無(wú)病變。飼養(yǎng)環(huán)境通風(fēng)良好，溫度18～26℃，12 h/12 h明暗交替環(huán)境下飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件符合醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)要求（倫理審查編號(hào)：IRM-DWLL-2020124）。

1.2 方法

1.2.1 電極埋置 小鼠行5%水合氯醛腹腔注射（10μL/g）麻醉后，將其頭部固定于立體定位儀上，雙眼涂眼膏或硅油保持角膜濕潤(rùn)。手術(shù)過(guò)程中，使用不透明黑布遮蓋雙眼防止顯微鏡燈光照射損傷小鼠視網(wǎng)膜，術(shù)中體溫維持在36.5℃。碘伏消毒后剪去小鼠顱骨表面的皮毛，完全暴露顱骨前囟與后囟，清除顱骨表面的皮下筋膜組織。于記錄眼對(duì)側(cè)初級(jí)視皮層雙眼區(qū)（V1B區(qū)）對(duì)應(yīng)位置（后囟旁3 mm）開一直徑約1.5 mm的顱窗，暴露硬腦膜。在硬腦膜表面放置自制金屬記錄電極。于記錄眼同側(cè)鼻骨處，采用相同的方法開顱窗并埋置參考電極（圖1）。最后用牙科水泥完全覆蓋暴露的顱骨。待小鼠在加熱毯上蘇醒后再將其放回籠中。

Fig.1 The implantation of the recording electrode and the reference electrode圖1 記錄電極與參考電極的埋置

1.2.2 數(shù)據(jù)采集 于電極埋置術(shù)后的第1天，將小鼠麻醉后進(jìn)行PVEP檢查。整個(gè)測(cè)試過(guò)程在小鼠尾部夾捏反應(yīng)消失的情況下進(jìn)行。若在測(cè)試過(guò)程中出現(xiàn)夾捏反應(yīng)，則追加少量麻醉藥并密切觀測(cè)小鼠的呼吸情況。將預(yù)先埋置好的記錄電極和參考電極與信號(hào)放大器的探頭相連接，接地電極（為自制針電極）插入尾根部。刺激屏幕為L(zhǎng)CD液晶顯示屏，小鼠雙眼正對(duì)刺激屏幕，距離屏幕15 cm。實(shí)驗(yàn)中使用的水平光柵刺激圖形、垂直光柵刺激圖形和棋盤方格刺激圖形（圖2）的空間頻率、時(shí)間頻率、疊加次數(shù)等保持一致，空間頻率保持0.02周/度，時(shí)間頻率1 Hz，疊加次數(shù)240次，屏幕亮度為20坎德拉/平方米（cd/m2），對(duì)比度為95%。每種刺激無(wú)時(shí)間間隔連續(xù)呈現(xiàn)240次，相鄰的2次刺激間在空間相位上以180°翻轉(zhuǎn)，不同種刺激間間隔10 s，3種刺激按照事先設(shè)定的假隨機(jī)順序依次呈現(xiàn)，每只小鼠按隨機(jī)方法分配不同的假隨機(jī)刺激順序。所有小鼠均在麻醉后相同時(shí)間開始進(jìn)行測(cè)試，并進(jìn)行相同時(shí)長(zhǎng)的測(cè)試。視覺(jué)誘發(fā)電位信號(hào)通過(guò)CED1401數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)（英國(guó)Cambridge Electronic Design公司）和Spike2軟件（英國(guó)Cambridge Electronic Design公司）采集并保存于電腦中。視覺(jué)刺激的顯示及數(shù)據(jù)的采集通過(guò)自編的Matlab程序進(jìn)行控制。所有數(shù)據(jù)采集均在暗環(huán)境中進(jìn)行，每次記錄的環(huán)境亮度均保持一致。

Fig.2 The 3 different stimulus patterns圖2 3種不同的刺激圖形

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 將采集到的數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入Matlab，用自編的Matlab程序?qū)Λ@得的視覺(jué)誘發(fā)電位信號(hào)進(jìn)行平均疊加處理后，分析不同視覺(jué)刺激條件下得到的PVEP P100波振幅與峰時(shí)值。用變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）評(píng)估3種不同圖形刺激誘發(fā)的PVEP振幅與峰時(shí)值測(cè)量的穩(wěn)定性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 8.2.1統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件（美國(guó)GraphPad Software公司）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。多組配對(duì)數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Tukey檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠PVEP波形 小鼠PVEP波形以正向波為主，未見(jiàn)到明顯的負(fù)向波，所獲得PVEP波振幅較大，均超過(guò)90μV，多數(shù)在150μV以上，見(jiàn)圖3。

Fig.3 PVEP waveforms of a mouse圖3 小鼠PVEP波形圖

2.2 3種不同圖形刺激誘發(fā)的PVEP P100波振幅的比較 翻轉(zhuǎn)棋盤方格刺激后P100波振幅低于水平光柵刺激和垂直光柵刺激，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；水平光柵刺激P100波振幅低于垂直光柵刺激，差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)表1。

Tab.1 Comparison of amplitudes and peak times of PVEP P100 waveforms evoked by three different patterns表1 3種不同圖形刺激PVEP P100波振幅與峰時(shí)值的比較（n=22，±s）

Tab.1 Comparison of amplitudes and peak times of PVEP P100 waveforms evoked by three different patterns表1 3種不同圖形刺激PVEP P100波振幅與峰時(shí)值的比較（n=22，±s）

＊＊P＜0.01；a與水平光柵刺激比較，b與垂直光柵刺激比較，P＜0.05

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2.3 3種不同圖形刺激誘發(fā)的PVEP P100波峰時(shí)值的比較 翻轉(zhuǎn)棋盤方格刺激P100波峰時(shí)值長(zhǎng)于水平光柵刺激和垂直光柵刺激，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），水平光柵刺激后峰時(shí)值長(zhǎng)于垂直光柵刺激，差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)表1。

2.4 3種不同圖形刺激誘發(fā)的PVEP P100波振幅和峰時(shí)值穩(wěn)定性的比較 水平光柵刺激、垂直光柵刺激和翻轉(zhuǎn)棋盤方格刺激PVEP振幅的變異系數(shù)分別為19.06%、16.82%和22.87%；峰時(shí)值變異系數(shù)分別為14.16%、12.07%和18.19%。垂直光柵圖形刺激誘發(fā)的PVEP振幅和峰時(shí)值的測(cè)量結(jié)果更為穩(wěn)定。

3 討論

VEP在眼科檢查中普遍應(yīng)用，對(duì)視覺(jué)神經(jīng)通路疾病的診斷十分重要。其信號(hào)來(lái)自視皮層，是從視覺(jué)刺激誘發(fā)的腦電信號(hào)中通過(guò)信號(hào)平均技術(shù)提取出來(lái)的［11］，反映的是從視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞到視皮層的視覺(jué)功能［12］，是視路功能的客觀檢查方法。PVEP相對(duì)于FVEP結(jié)果更為可靠，其波形在個(gè)體之間更加穩(wěn)定與一致［11］，因此臨床上對(duì)于能夠?qū)崿F(xiàn)PVEP記錄的受檢者均首選PVEP檢查。為了規(guī)范VEP的檢查和診斷，促進(jìn)VEP檢查在眼科和神經(jīng)科疾病診斷、鑒別診斷和預(yù)后評(píng)估中的規(guī)范應(yīng)用，近20年來(lái)ISCEV先后發(fā)布了關(guān)于人VEP檢查的標(biāo)準(zhǔn)及更新版本［3］。中華醫(yī)學(xué)會(huì)眼科學(xué)分會(huì)視覺(jué)電生理學(xué)組也于2020年組織翻譯和發(fā)表了ISCEV最新版本的臨床VEP標(biāo)準(zhǔn)［1-2］。但是，動(dòng)物的PVEP尚無(wú)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)［13-14］，各實(shí)驗(yàn)室在動(dòng)物PVEP的檢測(cè)中所采用的電極放置、刺激圖形等記錄方法也不盡相同，同時(shí)由于其記錄難度較高，限制了PVEP這一客觀視功能評(píng)估手段在眼科與視覺(jué)科學(xué)研究中的應(yīng)用。本研究通過(guò)將電極埋置于視皮層硬腦膜表面而不侵入視皮層內(nèi)的方法記錄得到了穩(wěn)定且高幅值的PVEP反應(yīng)信號(hào)，并比較了不同刺激圖形PVEP結(jié)果的差異，可為將來(lái)小型嚙齒類動(dòng)物PVEP指南的制定提供參考。

小鼠與人類的基因序列具有高度的相似性［15］，且飼養(yǎng)簡(jiǎn)單、成本較低，廣泛適用于生物學(xué)研究及眼科與視覺(jué)科學(xué)研究，特別是C57BL/6J品系及以此為背景的轉(zhuǎn)基因小鼠。由于實(shí)驗(yàn)用嚙齒類動(dòng)物一般體型較小，視覺(jué)誘發(fā)反應(yīng)信號(hào)微弱，參考人的PVEP記錄方法直接用于嚙齒類動(dòng)物通常信噪比很低，難以得到高質(zhì)量的數(shù)據(jù)，嚴(yán)重影響了相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。本課題組曾采用埋置顱釘?shù)姆椒?，?duì)Wistar大鼠進(jìn)行PVEP記錄，得到了較好的記錄結(jié)果［16］。然而，C57小鼠體質(zhì)量?jī)H為Wistar大鼠的1/10，其視覺(jué)誘發(fā)反應(yīng)信號(hào)相應(yīng)地更為微弱。筆者嘗試采用埋置顱釘?shù)姆椒▽?duì)小鼠進(jìn)行PVEP記錄，雖然可以記錄到PVEP波形，但信噪比較大鼠明顯降低，且個(gè)體間變異性較大，部分動(dòng)物個(gè)體甚至無(wú)法記錄到較高質(zhì)量的波形。本研究采用改進(jìn)的電極埋置方法，使記錄電極更加貼近腦表面以獲取視覺(jué)誘發(fā)反應(yīng)的腦電信號(hào)。由于記錄方法的改進(jìn)，本實(shí)驗(yàn)測(cè)得的PVEP振幅均超過(guò)90μV，信噪比好，高于目前國(guó)際上其他方式記錄得到的PVEP振幅［17-18］，且該記錄方法不侵入視皮層組織內(nèi)，更具優(yōu)越性。此外，在本研究中，3種圖形刺激的PVEP波形均以正向波為主，未見(jiàn)明顯的負(fù)向波，可能與本實(shí)驗(yàn)中電極埋置的位置有關(guān)。以往研究證實(shí)小鼠VEP波形與記錄電極的深度有關(guān)，在小鼠視皮層淺層記錄到的誘發(fā)反應(yīng)主要為正向波，在視皮層深層記錄到的誘發(fā)反應(yīng)主要為負(fù)向波，而在中間層則記錄到雙向波形［17］。

視覺(jué)系統(tǒng)自視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞開始至視皮層，各個(gè)部位的神經(jīng)細(xì)胞對(duì)視覺(jué)刺激具有特征選擇性［19］。很多視覺(jué)細(xì)胞對(duì)不同方位（orientation）或運(yùn)動(dòng)方向（direction）的視覺(jué)刺激具有選擇性［19-20］。研究發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜的輸出神經(jīng)元—視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，對(duì)特定方向的運(yùn)動(dòng)圖像具有優(yōu)先反應(yīng)的特性［20］。總體而言，與垂直方向運(yùn)動(dòng)的圖像相比，視網(wǎng)膜細(xì)胞更偏向于水平方向運(yùn)動(dòng)的圖像［21］。值得注意的是，水平方向運(yùn)動(dòng)的刺激實(shí)際相當(dāng)于垂直光柵的運(yùn)動(dòng)。外側(cè)膝狀體核對(duì)不同運(yùn)動(dòng)方向的視覺(jué)刺激也具有選擇性，雪貂外側(cè)膝狀體核內(nèi)的二連放電神經(jīng)元細(xì)胞對(duì)水平方向運(yùn)動(dòng)的刺激最為敏感［22］。Salinas等［23］在特定空間頻率下記錄到視皮層細(xì)胞更加偏向于水平方向運(yùn)動(dòng)的垂直光柵。此外，Yap等［24］也通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)論對(duì)視力正常兒童還是患有散光的兒童來(lái)說(shuō)，垂直或斜向光柵刺激比水平光柵刺激更易誘發(fā)圖形給撤光視覺(jué)誘發(fā)電位。本研究采用于視皮層表面埋置電極的方法，獲得了高質(zhì)量的PVEP記錄數(shù)據(jù)，并系統(tǒng)地比較了水平光柵刺激、垂直光柵刺激和翻轉(zhuǎn)棋盤方格刺激誘發(fā)的PVEP振幅和峰時(shí)值的差異，進(jìn)一步明確了采用垂直光柵刺激相對(duì)更易誘發(fā)出小鼠PVEP波形，表現(xiàn)為更高的振幅和更短的峰時(shí)值。這與既往細(xì)胞電生理實(shí)驗(yàn)研究和臨床研究結(jié)果是相一致的。同時(shí)，垂直光柵刺激可獲得更為穩(wěn)定的小鼠PVEP波形，其更低的變異度也意味著可顯著減少實(shí)驗(yàn)所需的樣本量。