卵裂期胚胎可溶性人類白細胞抗原G與妊娠結局的關系

耿蒙慧 邢阿英 王大琳 胡艷秋

輔助生殖技術(assisted reproductive technology，ART)的出現(xiàn)和發(fā)展為不孕不育癥患者帶來了孕育新生命的希望。然而，在過去近40年里，盡管試管嬰兒技術取得了長足地發(fā)展，其成功率卻達到了一個瓶頸，徘徊在40%～50%左右。如何判斷胚胎的植入能力一直是胚胎學家們努力攻克的難題，近年來，評估、挑選胚胎的方法不斷發(fā)展，用無創(chuàng)性方法評估胚胎備受關注。胚胎的無創(chuàng)評估是指不影響胚胎的正常發(fā)育環(huán)境，不會對胚胎產(chǎn)生負面影響，不直接損傷胚胎的評估方法[1]。蛋白質(zhì)組學作為其中一種，能降低形態(tài)學評估來自不同人的主觀差異而前景可期。其研究發(fā)育中的胚胎產(chǎn)生和分泌的蛋白質(zhì)，以反映胚胎發(fā)育狀態(tài)，揭示蛋白質(zhì)功能與細胞生命活動的規(guī)律。目前可通過質(zhì)譜法，酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)及其他電離方法等，精確、快速、簡便地測定微量樣品產(chǎn)生和分泌的蛋白質(zhì)含量。近年來，對于人類白細胞抗原G (human leukocyte antigen G，HLA-G)的研究較多，HLA-G作為一種免疫抑制因子而調(diào)節(jié)母胎界面和母體的免疫反應，從而防止母胎免疫排斥的發(fā)生[2]。研究表明，HLA-G是評估胚胎質(zhì)量的重要標志物[3]。胚胎培養(yǎng)液中可溶性HLA-G(soluble human leukocyte antigen G，sHLA-G)的存在有利于較高的胚胎植入率和妊娠率[4]。本文回顧性分析了胚胎培養(yǎng)液中sHLA-G與胚胎植入和妊娠的相關性，為胚胎質(zhì)量的評判提供依據(jù)。

對象與方法

一、研究對象

選擇2017年5月—2018年5月在江蘇省蘇北人民醫(yī)院生殖醫(yī)學中心接受體外受精或卵胞漿內(nèi)單精子注射胚胎移植(in vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection-embryo transfer，IVF/ICSI)的86例不孕患者，共計100個周期為研究對象。納入標準：女性年齡20～44歲、不孕年限≥1年、獲卵數(shù)≥1個。排除標準：子宮異常(肌瘤、子宮腺肌癥、子宮縱膈、其它先天或后天子宮畸形)、子宮內(nèi)膜異位癥III或Ⅳ期、患者或其丈夫染色體異常及有內(nèi)科合并癥如甲狀腺功能異常、高泌乳素血癥和糖尿病等內(nèi)分泌疾病、供卵/凍卵周期、補救ICSI、移植兩個胚胎后獲得單胚胎植入的。獲取胚胎受精后第3日行胚胎冷凍的單個胚胎培養(yǎng)液共計146份。按妊娠結局分為妊娠組和未妊娠組；另按移植胚胎中sHLA-G陽性情況分為2組：sHLA-G陽性組和sHLA-G陰性組，比較組間差異。本研究遵循的程序符合江蘇省蘇北人民醫(yī)院倫理委員會制定的倫理學標準，得到該委員會批準。

二、方法

1.胚胎及培養(yǎng)液的選擇：卵子取出后培養(yǎng)3～6 h加入處理后的精液，授精后20～21 h觀察受精情況，并將每個受精卵分別移入30 ulG1(Vitrolife，瑞典)培養(yǎng)液滴中蓋油，在37 ℃、6%CO2條件下孵育至移植前。胚胎分級標準：根據(jù)第三天胚胎形態(tài)和碎片多少，將胚胎分為4級：Ⅰ級：卵裂球大小均勻，胞質(zhì)無異常，碎片<5%；Ⅱ級：卵裂球大小均勻或不均勻，碎片<20%；Ⅲ級：碎片 20%～50%；Ⅳ級：碎片>50%；可移植胚胎包括Ⅰ級、Ⅱ級和Ⅲ級胚胎。

2.胚胎培養(yǎng)液的收集和保存：將每個胚胎對應的培養(yǎng)液25 ul吸入0.5 mL Eppendrof管中，存放入-80 ℃冰箱以備檢測。

3.sHLA-G的檢測：采用雙抗體夾心法ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)試劑盒，定量檢測單個胚胎培養(yǎng)液sHLA-G濃度。sHLA-G試劑盒由捷克BioVendor Laboratory Medicine公司提供，試劑盒最低檢測限為1 ng/ml。一抗為鼠抗sHLA-G單克隆抗體，二抗為酶標的鼠源抗人微球蛋白單克隆抗體。按說明書操作。實驗所需設備有：Bio Tek Instruments(HIGHLAND PARK,BOX 998.WINOOSKI,VT 05404-0998,USA)光譜儀、微量振蕩器、水浴箱等。

4.胚胎的凍融移植：胚胎解凍后觀察，至少有6個細胞且細胞內(nèi)碎片少于20%的胚胎被認為是可移植的，培養(yǎng)2 h后移植至宮腔內(nèi)，最多移植2個胚胎。移植后常規(guī)給予黃體酮40～80 mg肌內(nèi)注射，或陰道放置黃體酮陰道緩釋凝膠90 mg/d予以黃體支持。

5.確認妊娠：胚胎移植后14天，若患者血清β-人絨毛膜促性腺激素(β-HCG)陽性，定義為生化妊娠；移植4～5周后，超聲檢查見孕囊或臨床證實為異位妊娠及宮內(nèi)外同時妊娠，則定義為臨床妊娠。

結 果

一、研究對象的一般資料

妊娠組與未妊娠組患者的年齡、不孕年限、不孕類型、BMI、授精方式、Gn天數(shù)、Gn總量、基礎性激素水平、HCG日子宮內(nèi)膜厚度比較差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)；妊娠組的竇卵泡數(shù)、獲卵數(shù)及成熟卵數(shù)均較未妊娠組高(均P<0.05)，見表1。

表1 妊娠組與未妊娠組基本信息比較Table 1 Comparison of general characteristics of the pregnant group and non-pregnant

二、檢測標準判讀

根據(jù)sHLA-G標準品稀釋倍數(shù)做標準曲線，求得sHLA-G濃度與吸光度(optical density，OD，450 nm)之間的線性回歸方程，由OD值推算各培養(yǎng)液中sHLA-G的含量，依據(jù)其妊娠結局做ROC曲線，曲線下面積(area under the curve，AUC)為0.746(95% CI：0.661-0.831)(見圖1)。計算截斷值a=1.253(靈敏度為69.2%，特異性為84.0%)，≥a則為 sHLA-G陽性，

圖1 培養(yǎng)液中sHLA-G預測胚胎植入的ROC曲線Figure 1 ROC curve for estimating the predictive value of sHLA-G in embryo culture medium of embryo implantation

三、第三日單胚胎培養(yǎng)液sHLA-G表達情況

行FET的86例患者, 共100個周期，146個胚胎成功移植。其中獲得臨床妊娠的有38個周期，65個胚胎成功植入，81個胚胎未植入。臨床妊娠率為38.0%(38/100)，妊娠組與未妊娠組之間sHLA-G含量平均值的差異(1.8 U/mLvs 0.8 U/mL)有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2；sHLA-G陽性組植入率(77.6%，45/58)高于sHLA-G陰性組(22.7%，20/88)，組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); sHLA-G陽性組平均sHLA-G濃度(2.4 U/mL)明顯高于sHLA-G陰性組(0.3 U/mL)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 見表3；二元Logistic回歸分析結果顯示，胚胎培養(yǎng)液中sHLA-G含量為影響胚胎植入的獨立危險因素(P<0.05)，見表4。以植入與未植入胚胎的sHLA-G含量做散點圖，組間sHLA-G含量差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2。

表2 妊娠組與未妊娠組sHLA-G含量和植入率對比Table 2 Comparison of the mean value of sHLA-G and implantation rate between Pregnant Group and Non-pregnant Group

表3 sHLA-G陽性組與sHLA-G陰性組含量及植入率對比Table 3 Comparison of thesHLA-G levels and implantation rate between sHLA-G positive group and sHLA-G negative group

表4 二元Logistic回歸分析變量對胚胎植入的影響Table 4 Binary logistic regression analysis of factors on the implantation of embryos

圖2 植入組與未植入組sHLA-G含量分布圖Figure 2 The scattergram of sHLA-G levels in implantation group and non-implantation group

討 論

自1978年第一例試管嬰兒誕生以來，通過技術的革新，問題的突破及不斷的研究探索，輔助生殖技術在胚胎學家們的努力下持續(xù)發(fā)展，為人類造福。但仍存在一些亟需解決的問題，最主要是“一低一高”問題，即活產(chǎn)率低和多胎妊娠率高，為解決這個問題，更準確的評估胚胎發(fā)育潛能，挑選單個最優(yōu)胚胎進行移植很重要。為了尋求無創(chuàng)，簡便，準確的評估方法，本研究通過分析植入與未植入胚胎的胚胎培養(yǎng)液中的sHLA-G含量，探討其是否可作為妊娠預測指標。首先從理論上來說：1996年Jurisicova等第一次研究證明了sHLA-G陽性胚胎的卵裂率更高，且sHLA-G的表達與胚胎植入存在正相關[4]，從此以后，許多研究者發(fā)表了關于胚胎培養(yǎng)液中sHLA-G的表達與胚胎妊娠結局關系的研究。Sher等的一項前瞻性隊列研究表明，胚胎在ICSI后46小時能產(chǎn)生sHLA-G預示著較好的妊娠結局[5]。德國的一項多中心研究表明，隨著胚胎發(fā)育階段的推進，sHLA-G陽性胚胎的比例隨之升高，且sHLA-G陽性胚胎發(fā)育至囊胚的可能性更大，sHLA-G水平可能是繼胚胎的形態(tài)學評分系統(tǒng)之后的第二個重要評判參考[6]。2017年發(fā)表的一篇薈萃分析表明胚胎培養(yǎng)液中sHLA-G的存在有利于較高的胚胎植入率和妊娠率[7]。其次從標本的檢測方面來講：一方面，胚胎生長發(fā)育的直接環(huán)境是胚胎培養(yǎng)液，胚胎從中汲取養(yǎng)分并分泌代謝產(chǎn)物。在基因——蛋白——代謝終產(chǎn)物這樣一個生物信息傳遞鏈中，蛋白質(zhì)及代謝物是細胞生命活動的體現(xiàn)者，能反映胚胎的活力。另一方面，在一般情況下，第三天胚胎行移植或培養(yǎng)囊胚或冷凍保存后，卵裂期胚胎培養(yǎng)液均被遺棄，對其的收集及檢測既節(jié)約資源又對胚胎無任何損傷。

研究表明，HLA-G是人類主要組織相容性復合體，特異性表達于絨毛膜外細胞滋養(yǎng)層的母-胎界面，它除了能抑制NK細胞的自然殺傷和T淋巴細胞及抗原提呈細胞的免疫應答作用，使絨毛細胞滋養(yǎng)層細胞逃避殺傷，也可通過MEK1/2信號傳導通路促進HCG的表達，促進血管重塑及早期胚胎的著床和發(fā)育[8-9]。sHLA-G主要存在于早期胚胎的胚胎培養(yǎng)液中，羊水、母體血清、血漿和卵泡液中也可檢測到，已有多數(shù)研究結果提示，胚胎培養(yǎng)液中sHLA-G的存在與較高的胚胎植入率和妊娠率有關[7]。有研究稱妊娠早期胚胎培養(yǎng)液中sHLA-G與不明原因復發(fā)性流產(chǎn)及子癇前期相關[10-11]，但它們之間的關系尚無定論，由此可見，探究sHLA-G與胚胎植入及妊娠并發(fā)癥之間的關系對于挑選優(yōu)質(zhì)胚胎，改善妊娠結局很有意義。

sHLA-G在胚胎培養(yǎng)液中的表達多為定量研究，以往的多數(shù)研究中，由于測定sHLA-G的方法不盡相同，使用的試劑盒及操作步驟有所區(qū)別，所以使用不同的判定方法來界定sHLA-G陽性截斷值[6,12,13]。部分研究將可檢測到sHLA-G定為陽性，還有研究中直接給出陽性的濃度范圍，但并未解釋范圍的來源，故這些方法降低了不同研究之間可比性。還有一部分研究用Stoller的非參數(shù)判別分析確定陽性截斷值，即待測胚胎培養(yǎng)液中sHLA-G的平均熒光強度(mean fluorescent intensity,MFI)高于陰性對照MFI的10%即為sHLA-G陽性。由于實驗環(huán)境及試劑的不同，操作方法的差異使得不同研究之間的sHLA-G陽性/陰性的標準不同，這大大降低了不同研究之間可比性，偏倚較大。本研究依據(jù)標準曲線和培養(yǎng)液的sHLA-G的實際測定值來確定陰陽，由ROC曲線來確定截斷值，相比其他研究方法，其敏感性及特異性均較高，更加客觀地判定了sHLA-G陽性的界限。截斷值是錯誤最少的最好閾值，其假陽性和假陰性的總數(shù)最少。研究中ROC曲線下面積AUC為0.746，表明用胚胎培養(yǎng)液中sHLA-G含量評估胚胎的植入結局有中等度準確性。由于本研究樣本量不高，且為回顧性研究，偏倚不可避免，故而需加大樣本量進一步實驗。

本研究中妊娠組sHLA-G含量均值高于非妊娠組；sHLA-G陽性組的sHLA-G含量均值高于sHLA-G陰性組，表明用ELISA法檢測胚胎培養(yǎng)液中的sHLA-G是可行的。這與Noci等[12]的研究結果不同，他們認為移植胚胎中至少要有一個是sHLA-G陽性時才獲得妊娠，但多數(shù)實驗結果中妊娠組與非妊娠組胚胎均檢測到sHLA-G陽性的表達[7]。究其原因，一方面是研究方法之間的差異，另一方面，有研究表明不同發(fā)育時間的胚胎產(chǎn)生sHLA-G的量不同，培養(yǎng)24h(52%)、培養(yǎng)48 h(87%)、培養(yǎng)72 h(90%)的胚胎有sHLA-G的表達[14]。雖然多數(shù)研究均檢測的是第三天的胚胎培養(yǎng)液，但胚胎發(fā)育速度的不同必將導致sHLA-G含量的差異。

二元Logistic回歸分析去除混雜因素后的結果表明，胚胎培養(yǎng)液中sHLA-G含量為影響胚胎植入的獨立危險因素，證明了胚胎培養(yǎng)液中的sHLA-G與妊娠結局相關，它可能是預測胚胎質(zhì)量的一個標志物，此結果與多數(shù)已發(fā)表的研究結果類似[7，15]。卵泡的發(fā)育將直接影響胚胎的質(zhì)量及妊娠結局[16]，本研究中，單因素分析中妊娠組的竇卵泡數(shù)、獲卵數(shù)及成熟卵數(shù)均高于未妊娠組，差異有統(tǒng)計學意義，但二元Logistic回歸分析表明竇卵泡數(shù)、獲卵數(shù)及成熟卵數(shù)與妊娠結局的關系不大，進而證明sHLA-G含量為影響胚胎植入的獨立危險因素。研究中收集并測定的是第三天的胚胎培養(yǎng)液中的sHLA-G含量，這些胚胎在第三天被冷凍，等待解凍后移植。這為評估胚胎質(zhì)量提供了一種新思路，為復蘇周期胚胎移植的質(zhì)量評估提供了新方法，爭取了時間。形態(tài)學評估法仍是臨床應用最廣的胚胎質(zhì)量評估方法，因此，結合第三天胚胎的形態(tài)學評級及培養(yǎng)液中的sHLA-G含量挑選優(yōu)質(zhì)胚胎解凍移植，以提高胚胎植入率，是我們接下來的研究方向。

綜上所述，本研究結果表明可將胚胎培養(yǎng)液中的sHLA-G 水平檢測作為胚胎移植前無創(chuàng)性檢測項目，促進臨床中選擇性單胚胎移植的進行。在形態(tài)學評估的基礎上，將sHLA-G作為輔助生育中無創(chuàng)檢測項目，幫助選擇優(yōu)質(zhì)胚胎進行單胚胎移植，可以在提高胚胎著床率的同時降低多胎率。但本研究的局限是納入研究的樣本較少，需要更大規(guī)模的前瞻性研究來證明sHLA-G對于評估胚胎質(zhì)量的可靠性。