結(jié)合基于濾紙的DNA提取技術(shù)和RPA-LFD檢測(cè)技術(shù)對(duì)有毒植物鉤吻進(jìn)行快速鑒別

鄭夏生，安文麗，姚暉，徐江，陳士林

許多植物和動(dòng)物可供食用和藥用，但有些是有毒性的。由于形態(tài)上的相似，一些有毒物種常被誤認(rèn)為無毒物種。因無意攝入有毒植物或動(dòng)物而導(dǎo)致中毒甚至死亡的意外事件時(shí)有發(fā)生，尤其在野外。在這種情況下，快速而準(zhǔn)確地鑒定有毒物種對(duì)于為中毒者提供最佳且緊急的治療是至關(guān)重要的，可以挽救生命或至少可以將健康損害降到最低。遺憾的是，目前大多數(shù)物種鑒定方法，包括DNA條形碼、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）和色譜技術(shù)等，都依賴于專業(yè)的設(shè)備和專門的實(shí)驗(yàn)室，無法在現(xiàn)場(chǎng)實(shí)時(shí)應(yīng)用。因此，開發(fā)一種快速、準(zhǔn)確、無需任何設(shè)備的有毒物種鑒定方法是非常有必要的。

重組聚合酶擴(kuò)增（RPA）是Pipenburg等[1]開發(fā)的一種獨(dú)特的等溫DNA擴(kuò)增技術(shù)。該方法可在35～40 ℃的恒溫條件下（接近人體體表溫度），在相對(duì)較短的時(shí)間內(nèi)（15～25 min）快速擴(kuò)增目標(biāo)基因片段，不論是否借助熱循環(huán)儀。由此產(chǎn)生的RPA反應(yīng)產(chǎn)物可以通過多種方式進(jìn)行可視化，如瓊脂糖凝膠電泳、基于探針的熒光監(jiān)測(cè)和側(cè)向流檢測(cè)試紙（LFD）。其中，LFD是一種便攜式的免儀器診斷性分析裝置，其結(jié)果可通過直接觀察試紙條上的顯色反應(yīng)來判讀。將RPA-LFD組合用于現(xiàn)場(chǎng)快速核酸檢測(cè)的前提是要先實(shí)現(xiàn)無需任何設(shè)備即可進(jìn)行DNA提取。2017年，Zou等[2]報(bào)道了一種基于濾紙快速捕獲核酸的可靠方案，該方案無需使用儀器設(shè)備。在本研究中，我們利用這種快速簡(jiǎn)單的DNA提取方法，并將其與RPA-LFD相結(jié)合，建立了一種快速鑒定劇毒植物鉤吻（Gelsemium elegans）的方法。

鉤吻也稱為斷腸草，是一種劇毒的開花植物，廣泛分布在我國(guó)南方和東南亞。鉤吻含有多種吲哚類生物堿，包括蛇根精類、鉤吻子素類、胡蔓藤乙素類、鉤吻素甲類和甲基鉤吻乙素類生物堿[3]。這些生物堿不僅具有較強(qiáng)的藥理作用，還具有劇烈的毒性?？诜^吻或其水提物會(huì)導(dǎo)致消化系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)的嚴(yán)重中毒反應(yīng)，甚至?xí)?dǎo)致心臟或呼吸衰竭而死亡。不幸的是，鉤吻很容易被誤認(rèn)為常見的藥用植物金銀花（Lonicera japonica）。因?yàn)檫@兩種植物在野外有時(shí)會(huì)纏繞在一起，并且具有非常相似的芽形。因此，這種混淆會(huì)導(dǎo)致意外中毒甚至死亡。

為建立一種快速、可行的野外鑒別鉤吻的方法，我們采集了鉤吻和金銀花，通過聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增和Sanger測(cè)序獲得其psbA-trnH序列?；谶@些序列，我們?cè)O(shè)計(jì)了針對(duì)鉤吻的特異性引物和探針，用于RPALFD檢測(cè)（見附錄A中的表S1）。經(jīng)過一系列的方法學(xué)研究，我們提出了一種針對(duì)鉤吻的現(xiàn)場(chǎng)快速鑒定方案。該方案如圖1（a）所示，并在附錄A的第1節(jié)中簡(jiǎn)要描述。首先，將測(cè)試樣品的新鮮葉片切成小塊，按Zou等[2]所述方法，使用濾紙進(jìn)行快速DNA提取。接著，將攜帶樣本DNA的濾紙條浸入含有RPA反應(yīng)液、物種特異性引物和探針的反應(yīng)管中，然后加入乙酸鎂。接著將反應(yīng)管置于人的手掌中孵育至少20 min。最后將LFD試紙條的底端浸入少量稀釋的RPA反應(yīng)產(chǎn)物中，再放入含有運(yùn)行緩沖液（running buffer）的PCR管中并靜置。1～2 min后，在LFD試紙條上可觀察到一條或兩條色帶。對(duì)于鉤吻樣品，LFD試紙條上應(yīng)該出現(xiàn)兩個(gè)條帶，而對(duì)于非鉤吻樣品，LFD試紙條上僅觀察到對(duì)照條帶[圖1（b）]。

圖1.快速鑒定的方案流程及其方法學(xué)考察結(jié)果。（a）現(xiàn)場(chǎng)快速鑒定方案流程；（b）利用該方案對(duì)鉤吻和金銀花進(jìn)行物種鑒定；（c）三組引物和探針的特異性和擴(kuò)增效率考察，LFD試紙條頂部的數(shù)字表示組號(hào)；（d）RPA孵育溫度考察；（e）用手孵育時(shí)間考察；（f）基于梯度稀釋鉤吻gDNA的靈敏度考察；（g）基于梯度稀釋鉤吻pEasy-psbA-trnH質(zhì)粒的靈敏度考察。LF：側(cè)流；FAM：熒光素；THF：四氫呋喃。

在方法學(xué)考察中，我們進(jìn)行了幾項(xiàng)相關(guān)的考察（詳見附錄A中的第2節(jié)），包括引物和探針的特異性、擴(kuò)增效率[圖1（c）]、RPA反應(yīng)溫度[圖1（d）]、反應(yīng)時(shí)間[圖1（e）]和反應(yīng)靈敏度的測(cè)試。反應(yīng)溫度試驗(yàn)表明，適合RPA反應(yīng)的合理溫度范圍為30 ～ 42 ℃，且在37 ℃時(shí)觀察到最優(yōu)結(jié)果，這個(gè)溫度非常接近人體表面的溫度。在反應(yīng)靈敏度試驗(yàn)中，最低檢出限分別為0.01 ng·g-1DNA [圖1（f）]和20.5拷貝psbA-trnH片段[圖1（g）]。

綜上所述，我們將基于濾紙的DNA提取和RPALFD檢測(cè)相結(jié)合，提供了一種快速鑒別劇毒植物鉤吻和藥用植物金銀花的方法。該方案至少需要0.01 ng·g-1DNA或20.5拷貝psbA-trnH片段，可在30 min內(nèi)產(chǎn)生可靠的結(jié)果。更重要的是，該方案易于執(zhí)行且不需要專業(yè)設(shè)備，因此適用于鉤吻的現(xiàn)場(chǎng)快速鑒定?；诒痉桨缚梢蚤_發(fā)出商用試劑盒。另外，本研究為其他物種（包括植物和動(dòng)物，無論是否有毒）的快速現(xiàn)場(chǎng)鑒定提供了新的思路。

Appendix A.Supplementary data

Supplementary data to this article can be found online at https://doi.org/10.1016/j.eng.2020.02.012.