超臨界CO2萃取桃金娘果及其揮發(fā)性成分研究

銀慧慧，冀曉雯，孟 菲，趙 武，姜源明，覃振華，劉 偉

(1. 廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所，南寧 530001；2. 廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室，南寧 530001； 3. 廣西壯族自治區(qū)藥用植物園，南寧 530023)

桃金娘(Rhodomyrtustomentosa)，隸屬于桃金娘科(Mytraceae)，是一種優(yōu)良的野生藥用植物資源，廣泛分布于東南亞國家和地區(qū)，尤其是中國南部、日本、泰國和越南等地[1-2]，具有清熱解毒、收斂止瀉、活血止血的功效，臨床用于治療痢疾、腸炎、肝炎等癥。桃金娘全株可入藥，其不同部位的藥用價值已得到越來越多的關(guān)注，近年來，也作為飼料添加劑在畜禽養(yǎng)殖中得到了應(yīng)用。桃金娘果實中富含黃酮、多酚以及多糖等多種活性成分，目前對于桃金娘果的研究主要是在飲料、釀酒和保健品等方面[3-5]。由于中藥中揮發(fā)油一般具有很好的抗菌活性[6-7]，而有關(guān)桃金娘果的提取及其揮發(fā)性物質(zhì)等的相關(guān)研究報道甚少。超臨界CO2流體萃取技術(shù)是利用超臨界CO2的特殊溶解能力來進(jìn)行萃取的一種新型綠色提取技術(shù)[8]，由于超臨界CO2萃取在萃取過程中無試劑殘留，并且CO2在生產(chǎn)過程中能夠被循環(huán)使用，具有無污染、能耗少、操作簡單以及萃取效率高等優(yōu)點，使其在食品、生物、化工、中草藥等研究方面都得到了廣泛的應(yīng)用[9-11]。本研究以桃金娘果為研究對象，應(yīng)用超臨界CO2對桃金娘果進(jìn)行萃取，同時通過單因素和正交試驗優(yōu)化萃取的最佳工藝，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)對萃取物中揮發(fā)性成分進(jìn)行主成分分析，旨在為進(jìn)一步開發(fā)和利用桃金娘奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1材料與試劑 桃金娘果(產(chǎn)地：廣西桂平，經(jīng)廣西獸醫(yī)研究所孫建華研究員鑒定為桃金娘果實)；甲醇、95%乙醇、無水乙醇(分析純，成都科隆化學(xué)品有限公司)；甲醇(色譜級，美國Tedia公司)。

1.2 儀器 Thar-SFE-5000 超臨界CO2萃取系統(tǒng)(Waters公司)；Milli-Q超純水儀(Millipore公司)；F160型粉碎機(jī)(北京中興偉業(yè))；SQP型(精度0.01 mg)電子天平(德國Sartorious公司)；CAP225D型(精度0.1 mg)電子天平(德國Sartorious公司)； Varian 300-MS氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國)；氣體CO2(99.99%，購于南寧國信氣體有限責(zé)任公司)。

2 方 法

2.1 樣品預(yù)處理 挑選顆粒飽滿、無損壞、成熟度一致的桃金娘果，清洗干凈，65 ℃下烘干，粉碎后過40目篩，得到桃金娘果粉末，置于-4 ℃密封避光保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 桃金娘果萃取得率 準(zhǔn)確稱取50.0 g桃金娘果粉末，用10 mL相應(yīng)的夾帶劑進(jìn)行浸潤后置于萃取釜中進(jìn)行萃取，萃取完畢，收集萃取粗提液，進(jìn)行減壓干燥后得到樣品物質(zhì)稱重，并計算提取得率。

2.3 單因素實驗設(shè)計 影響超臨界CO2萃取的因素主要有不同夾帶劑、萃取溫度、萃取壓力、萃取時間、CO2流量等。本研究分別對夾帶劑、萃取溫度、萃取壓力、萃取時間、CO2流量5個因素進(jìn)行單因素實驗，考察這些因素對桃金娘果萃取物的影響。

實驗夾帶劑分別選擇95%乙醇、80%乙醇、60%乙醇、100%甲醇、60%甲醇；萃取溫度分別選擇25、30、35、40、45 ℃；CO2流量選擇分別為10.5、14、17.5、21 mL/min；萃取壓力分別為8、10、12、15 Mpa；萃取時間分別為30、60、90、120、150、180 min。

2.4 正交實驗設(shè)計 正交實驗設(shè)計根據(jù)單因素實驗的結(jié)果，以萃取得率為實驗的考察指標(biāo)。從中選擇合適的萃取溫度、CO2流量、萃取壓力、萃取時間進(jìn)行四因素三水平的正交實驗，因素水平表見表1。

表1 正交實驗因素水平表Tab 1 Factors and levels of orthogonal test

2.5 GC-MS分析條件 氣相色譜條件：色譜柱：VF-5 ms石英毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，柱溫：40 ℃保持4 min，然后以10 ℃/min的速率升溫至160 ℃，維持5 min，再以10 ℃/min的速率升溫至200 ℃，維持10 min，再以10 ℃/min的速率升溫至280 ℃，維持15 min，。載氣：He。載氣流速：1 ml/min。進(jìn)樣溫度：250 ℃。進(jìn)樣量：1 μL。分流比：40。質(zhì)譜條件：EI(電子轟擊):70 eV，倍增器電壓1250 V，掃描質(zhì)量范圍45～500 u。

2.6 化合物鑒定 采用計算機(jī)檢索各峰相應(yīng)的質(zhì)譜圖，與NIST08.L、RTLPEST3.L標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫匹配，篩選匹配度大于80%化合物，結(jié)合人工解析和相關(guān)文獻(xiàn)報道鑒定化合物，成分定量分析采用峰面積歸一化法。

2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 采用Excel和SPSS 17.0對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素實驗

3.1.1 夾帶劑的選擇 固定萃取溫度40 ℃、萃取壓力10 Mpa、萃取時間30 min、CO2流量為14 g/min，選擇不同的夾帶劑對桃金娘果進(jìn)行萃取，結(jié)果如圖1所示，當(dāng)夾帶劑為95%乙醇時萃取得率最大，因此,選擇95%乙醇作為正交試驗萃取的夾帶劑。

(萃取條件：萃取溫度為40 ℃；CO2流量14 g/min；萃取壓力10 Mpa；萃取時間為30 min)(Extraction conditions: extraction temperature 40 ℃; CO2 flow rate 14 g/min; extraction pressure 10 MPa; extraction time 30 min)圖1 夾帶劑的影響Fig 1 Effects of cosolvent

3.1.2 萃取溫度的選擇 固定萃取的夾帶劑為95%乙醇、萃取壓力10 Mpa、提取時間30 min、CO2流量14 g/min，考察不同溫度對萃取得量的影響。由結(jié)果看到(圖2)，溫度越高萃取得量越低，當(dāng)溫度在35 ℃時，萃取得率最高，這是由于過高的溫度使得CO2的密度降低，導(dǎo)致了其溶解能力下降，此外，過高的溫度也使得萃取物不穩(wěn)定，溶解量減少，因此，根據(jù)此單因素實驗，選擇正交實驗的萃取溫度為30、35、40 ℃。

(萃取條件：CO2 流量14 g/min；萃取壓力10 Mpa；萃取時間為30 min)(Extraction conditions: CO2flow rate 14 g/min; extraction pressure 10 MPa; extraction time 30 min)圖2 萃取溫度的影響Fig 2 Effects of extraction temperature

3.1.3 CO2流量的選擇 固定夾帶劑為95%乙醇，采用萃取壓力10 Mpa，萃取溫度35 ℃，提取時間30 min，分別設(shè)置CO2流量在10.5、14、17.5、21 g/min時進(jìn)行實驗，考察CO2流量對萃取量的影響，結(jié)果如圖3。隨著CO2流量的增加，萃取得率增加，當(dāng)流量超過17.5 g/min后，萃取得率開始減少，這是由于CO2流量增加使得萃取物不能及時分離，部分揮發(fā)油可能隨CO2流失使提取率降低。因此，根據(jù)此單因素實驗，選擇14、17.5、21 g/min的CO2流量進(jìn)行正交實驗分析。

(萃取條件：萃取溫度為35 ℃；萃取壓力10 Mpa；萃取時間為30 min)(Extraction conditions: extraction temperature 35 ℃; extraction pressure 10 MPa; extraction time 30 min)圖3 CO2流量的影響Fig 3 Effects of CO2flow rate

3.1.4 萃取壓力的選擇 萃取壓力是影響超臨界CO2萃取過程中桃金娘果揮發(fā)性物質(zhì)溶解度的一個重要參數(shù)。采用95%乙醇作為夾帶劑，在萃取實驗溫度為35 ℃、CO2流量為17.5 g/min、萃取時間為30 min的條件下，分別測定不同萃取壓力下對萃取得率的影響(圖4)。由圖4顯示，萃取得率隨著萃取壓力的增高而升高，當(dāng)壓力超過10 Mpa時，萃取得率變化不大，甚至有下降的趨勢。當(dāng)增大萃取壓力時，使得萃取過程中超臨界CO2的密度增加，溶質(zhì)和溶劑之間的傳質(zhì)效率得到了提高，從而增大了目標(biāo)萃取物的溶解度，提高了萃取得率。當(dāng)萃取壓力升高到一定程度時，超臨界流體的可壓縮性小，目標(biāo)萃取物的萃取率并無明顯變化，并且高壓力萃取也存在諸多不安全因素。因此，本實驗選取萃取壓力為8、10、12 Mpa進(jìn)行正交實驗。

(萃取條件：萃取溫度為35 ℃；CO2 流量17.5 g/min；萃取時間為30 min)(Extraction conditions: extraction temperature 35 ℃; CO2 flow rate17.5 g/min; extraction time 30 min)圖4 萃取壓力的影響Fig 4 Effects of extraction pressure

3.1.5 萃取時間的選擇 由圖5的結(jié)果看到，隨著萃取時間的增加，萃取得率不斷增高，當(dāng)萃取時間為150 min后，萃取得率增加緩慢。由于萃取時間越長，CO2流體能夠更充分的接觸桃金娘果，萃取也就越完全。但當(dāng)萃取達(dá)到一定時間后，萃取得率并無明顯變化，此外，萃取時間過長也可能導(dǎo)致部分萃取物不穩(wěn)定，從而影響提取率，過長時間的萃取還會帶來過高的萃取成本。因此，在本實驗研究中，根據(jù)此單因素實驗，選擇120、150、180 min萃取時間進(jìn)行正交實驗分析。

(萃取條件：萃取溫度為35 ℃；CO2 流量17.5 g/min；萃取壓力為10 Mpa)(Extraction conditions: extraction temperature 35 ℃; CO2 flow rate17.5 g/min; extraction pressure 10 MPa)圖5 萃取時間的影響Fig 5 Effects of extraction time

3.2 正交實驗結(jié)果與分析 根據(jù)3.1項的單因素試驗結(jié)果，選定萃取溫度、CO2流量、萃取壓力、萃取時間進(jìn)行四因素三水平的正交試驗，結(jié)果見表2。

表2 正交實驗設(shè)計結(jié)果Tba 2 Result and analysis of orthogonal test

由表2可知，影響桃金娘果中揮發(fā)性成分萃取得率最顯著的因素是萃取時間，其次為萃取壓力、萃取溫度、CO2流量，各因素不同水平影響次序為A2>A1>A3，B2>B1>B3，C3>C2>Cl，D2>D3>Dl，A2B2C3D2為極差分析得到的最優(yōu)萃取條件組合，即萃取溫度35 ℃、萃取壓力12 Mpa、CO2流量17.5 g/min、萃取150 min，方差分析結(jié)果見表3。在本研究優(yōu)化的工藝條件下對桃金娘果進(jìn)行3次萃取平行試驗，得到萃取物平均萃取得率為10.52%。

表3 方差結(jié)果分析Tab 3 The analysis of variance

3.3 桃金娘果萃取物揮發(fā)性化合物組成及含量分析 超臨界CO2萃取的桃金娘果萃取物經(jīng)GC-MS分析，揮發(fā)性成分離子流圖見圖6，通過計算機(jī)檢索，扣除不加樣品時出現(xiàn)的雜質(zhì)峰，共鑒定出20 種可能化合物，定性定量結(jié)果見表4，鑒定出的成分占總量的74.56%。其中含量最高的為順-11,14-二十碳二烯酸甲酯，占總含量的27.73%。

圖6 GC-MS 全掃描總離子流圖Fig 6 GC-MS full scan total ion current diagram

由表4可見，桃金娘果中揮發(fā)性成分包含有5類物質(zhì)，主要有烴類7種、酸類4種、酯類4種、醛類4種以及醇類1種。其中相對含量最高的為酯類，占總揮發(fā)性成分的34.43%，酸類占22.73%、烴類占9.12%、醇類5.84%、醛類2.44%。酯類棕櫚酸乙酯、正己酸乙酯、順-11,14-二十碳二烯酸甲酯是分離得到的主要酯類物質(zhì)，其中順-11,14-二十碳二烯酸甲酯含量為27.73%，是總揮發(fā)性物質(zhì)中相對含量最高的物質(zhì)，這些低酯類物質(zhì)都存在一定的香氣[12]，是桃金娘果萃取物氣味的主要來源[13]。桃金娘果中分離到的酸類物質(zhì)主要為己酸、棕櫚酸和亞油酸，其相對含量較高，分別為7.62%、7.76%、6.85%，其中，亞油酸是人和動物必需的一種脂肪酸[14]，具有降血脂、軟化血管、降低血壓等作用[15]。烴類物質(zhì)又可分為烷類、萜烯等，從桃金娘果種分離得到的主要萜烯類化合物為(1R)-(+)-α-蒎烯(2.39%)、石竹烯(4.11%)，其中石竹烯是一種食品香料[16]。醇類主要分離到的為β-谷甾醇，相對含量為5.84%，β-谷甾醇廣泛存在于植物油、堅果等植物種子中，有降膽固醇、止咳、祛痰及抑制腫瘤和修復(fù)組織作用[17]，被較多地應(yīng)用到醫(yī)藥行業(yè)中。醛類物質(zhì)主要為己醛二乙縮醛，相對含量為1.38%，可用于花香、風(fēng)信子以及梨香精的調(diào)配[18]。超臨界CO2萃取桃金娘果得到的主要揮發(fā)性成分與梁潔怡等[19]采用乙醚提取桃金娘果揮發(fā)油成分相近。

表4 桃金娘果中揮發(fā)性物質(zhì)組成及相對含量Tab 4 Composition of volatile compounds in Rhodomyrtus tomentosa fruit and their relative contents

4 結(jié) 論

本研究通過單因素實驗對桃金娘果萃取得率進(jìn)行研究，選擇95%乙醇為夾帶劑，并確定了萃取溫度、萃取壓力、萃取時間以及CO2四個主要影響因素，通過四因素三水平的正交實驗，優(yōu)化桃金娘果超臨界CO2流體萃取的最佳提取工藝，建立了一種超臨界CO2流體萃取桃金娘果的方法。傳統(tǒng)的提取方法主要有超聲提取、水浴提取、加熱回流提取等，但這些方法提取溫度較高，很容易讓提取物中的揮發(fā)性物質(zhì)流失得不到保留，并且使用乙醚等有機(jī)溶劑提取污染較高，而超臨界CO2流體萃取能夠在低溫下萃取桃金娘果，并使得揮發(fā)性物質(zhì)能夠最大限度地保留，在整個過程中使用的有機(jī)溶劑僅為95%乙醇，在萃取結(jié)束后能夠進(jìn)行回收，有機(jī)試劑殘留少、污染低。

本研究建立的桃金娘果超臨界CO2流體萃取法工藝條件穩(wěn)定，具有較好重現(xiàn)性。得到超臨界CO2萃取桃金娘果中揮發(fā)性成分的優(yōu)化工藝條件為萃取壓力12 Mpa、萃取溫度35 ℃、CO2流量17.5 g/min、萃取時間150 min；此條件下桃金娘果的提取率為10.52%。GC-MS對超臨界CO2流體萃取桃金娘果中揮發(fā)性成分分離效果較好，共鑒定出20種主要化合物，分別為酯類、酸類、烴類、醇類和醛類，其中酯類順-11,14-二十碳二烯酸甲酯含量最高(27.73%)，烴類含量最高為石竹烯(4.11%)，酸類擁有最高含量的物質(zhì)是棕櫚酸(7.76%)。本次研究分析鑒定出只有20種主要化合物，這可能與此次實驗的桃金娘采摘時期和產(chǎn)地有關(guān)。這些研究結(jié)果為進(jìn)一步探討野生藥用植物資源桃金娘的有效成分及其藥理作用提供了理論依據(jù)。