藥物輔助性犯罪中獸藥麻醉劑舒泰的UPLC-MRM-IDA-EPI-MS鑒定

吳小軍，董林沛，張?jiān)品?，趙 鵬，劉冰潔

(1.公安部物證鑒定中心，北京 100038；2.愛(ài)博才思亞太應(yīng)用支持中心，北京 100015)

舒泰是一種寵物臨床常見(jiàn)的麻醉劑，它是由唑拉西泮和替來(lái)他明1∶1混合而成[1-3]。唑拉西泮是苯二氮卓類鎮(zhèn)靜劑，具有良好的肌肉松弛和抗驚厥作用；替來(lái)他明則是一種分離麻醉劑，止痛作用持久。這兩種藥物在藥物動(dòng)力學(xué)上具有互補(bǔ)作用，常用于小動(dòng)物的臨床麻醉。兩個(gè)藥物的代謝能力有一定差異，唑拉西泮在生物體內(nèi)的穩(wěn)定性要強(qiáng)于替來(lái)他明，實(shí)際檢驗(yàn)過(guò)程中常常能檢測(cè)到唑拉西泮，而替來(lái)他明的濃度卻較低[4]。此藥物在動(dòng)物身上應(yīng)用廣泛，但近年來(lái)發(fā)現(xiàn)此類藥物在刑事犯罪領(lǐng)域的濫用現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，常見(jiàn)于藥物輔助性犯罪如迷奸、麻搶等[5-7]。目前對(duì)于唑拉西泮和替來(lái)他明的檢驗(yàn)主要采用GC-MS法[1, 4]，何思陽(yáng)等[6]采用GC-QTOF鑒定藥物輔助性犯罪案件樣品中替來(lái)他明和唑拉西泮及其代謝物組分，取得良好的定性效果。氣質(zhì)聯(lián)用法前處理較為繁瑣且靈敏度往往達(dá)不到要求。LC-MS法具有前處理簡(jiǎn)單，靈敏度高等優(yōu)勢(shì)，采用LC-MS法檢驗(yàn)唑拉西泮和替來(lái)他明尚未見(jiàn)報(bào)道。由于基質(zhì)的復(fù)雜性,有時(shí)候即使使用液質(zhì)串聯(lián)四級(jí)桿MRM模式也難以避免假陽(yáng)或假陰誤判。本研究在優(yōu)化前處理的方式的基礎(chǔ)上建立了UPLC-MRM-IDA-EPI-MS同時(shí)定性、定量檢測(cè)唑拉西泮、替來(lái)他明的檢驗(yàn)方法。該方法借助于信息依賴性獲取技術(shù)(IDA)能將多反應(yīng)檢測(cè)(MRM)和增強(qiáng)子離子掃描模式(EPI)相結(jié)合[8-12]。不僅能保證在MRM基礎(chǔ)上獲得高靈敏度的定量結(jié)果，同時(shí)能借助于線性離子阱的增強(qiáng)子離子掃描技術(shù)，獲得二級(jí)質(zhì)譜進(jìn)行定性確證。值得指出的是EPI技術(shù)具有離子富集、信號(hào)增強(qiáng)的作用，即使在極低含量下也能獲得質(zhì)量較高的二級(jí)全譜，為低濃度臨界值的定性提供參考。使用本方法對(duì)血液中唑拉西泮和替來(lái)他明進(jìn)行定性和定量分析，簡(jiǎn)便快速，并將定性和定量方法有機(jī)結(jié)合在一起，可以滿足復(fù)雜基質(zhì)中目標(biāo)物的準(zhǔn)確定性和定量分析要求。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑、材料 超高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜(島津LC-30AC- Scix5500-QTrap)；高速離心機(jī)(Thermo-Fisher 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī))；超純水機(jī)(Milli-Q Academic)；高速振蕩器(CUTEMIXER CM-1000)

鹽酸唑拉西泮(cas：33754-49-3)、鹽酸替來(lái)他明(cas：14176-50-2)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均購(gòu)于天津阿爾塔科技有限公司；乙腈(色譜純Merck)；甲醇(色譜純Merck)；Prime HLB固相萃取小柱(Waters Oasis)

空白血液(購(gòu)于北京市復(fù)興醫(yī)院醫(yī)院血庫(kù))；待測(cè)樣品：心血、尿液，來(lái)自某地公安機(jī)關(guān)送檢樣本。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置 取唑拉西泮和替來(lái)他明標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各10 mg，精密稱定，用甲醇定容至10 mL，配置成1 mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液于4 ℃冰箱保存，再用甲醇稀釋至10 μg/mL作為混合標(biāo)準(zhǔn)品使用液。

1.3 樣品前處理 取血液(尿液)樣品0.5 mL于15 mL離心管中，加入2 mL乙腈，高速震蕩10 min，8000 r/min離心10 min，取上層清液過(guò)PRIME-HLB固相萃取小柱，收集洗脫液，過(guò)0.22 μm有機(jī)相濾膜，待測(cè)。若檢材中藥物濃度過(guò)高，可用乙腈稀釋至線性曲線范圍內(nèi)測(cè)定。

1.4 超高效液相色譜條件 色譜柱phenomenex Kinetex F5(100×3.0 mm，2.6 μm)；柱溫：40 ℃；流動(dòng)相A相：乙腈，B相：含0.01%甲酸1 mM甲酸銨水。進(jìn)樣體積3 μL。流速：0.45 mL/min。梯度洗脫程序：0～1 min，5%A相；1～1.1 min，20%A相；1.1～6 min，20%～95%A相；6～8 min，95%A相；8～8.1 min，5%A相；8.1～11 min，5%A相。

1.5 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI+)；離子源溫度：500 ℃；噴霧電壓5500 V；氣簾氣壓力35 psi；噴霧器壓力50 psi；輔助加熱器壓力50 psi；掃描模式(MRM-IDA-EPI)，MRM相關(guān)參數(shù)見(jiàn)表1。IDA采用動(dòng)態(tài)背景扣除；掃描閾值100 cps；EPI源參數(shù)與MRM模式一致；碰撞能量CE(35±15eV);掃描范圍50～300 Da。

表1 唑拉西泮和替來(lái)他明的MRM質(zhì)譜參數(shù)Tab 1 MRM parameters of zolazepam and tiletamine

2 結(jié)果與分析

2.1 離子對(duì)的獲取 采用針泵進(jìn)樣方式，將100 ng/mL的唑拉西泮和替來(lái)他明標(biāo)準(zhǔn)品分別注入質(zhì)譜中，分別采用正、負(fù)掃描模式對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行掃描，結(jié)果表明在正離子模式下，唑拉西泮和替來(lái)他明均有較好的響應(yīng)。在步進(jìn)電壓為5的碰撞能量下分別對(duì)兩個(gè)化合物的子離子進(jìn)行掃描，確定各個(gè)目標(biāo)物的特征子離子，并進(jìn)行去簇電壓和碰撞電壓的優(yōu)化，得到一系列離子對(duì)，如表2所示。

表2 唑拉西泮和替來(lái)他明優(yōu)化后的備選離子對(duì)Tab 2 Alternative ion pairs optimized for zolazepam and tietamine

2.2 離子對(duì)的選擇及條件優(yōu)化 離子對(duì)的選擇原則應(yīng)該遵循無(wú)干擾、信噪比高等原則。采用液相色譜進(jìn)樣，進(jìn)樣濃度為100 ng/mL，使用MRM模式掃描監(jiān)控各個(gè)離子對(duì)。如圖1中所示唑拉西泮和替來(lái)他明的備選離子對(duì)均不存在干擾，故選擇信噪比最高的離子對(duì)作為定量離子，信噪比次之的選作定性離子。篩選后的結(jié)果如表1所示。

圖1 100 ng/mL 唑拉西泮和替來(lái)他明各個(gè)離子對(duì)的抗干擾及信噪比考察Fig 1 Investigation of anti-interference and signal-to-noise ratio of each ion pair of zolazepam and tiletamine at 100 ng/mL

2.3 基質(zhì)工作曲線、靈敏度與精密度 采用外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。由于不同檢材的藥物含量差異較大，難以采用一致的內(nèi)標(biāo)濃度，需要根據(jù)不同的樣品設(shè)置內(nèi)標(biāo)，可操作性差；其次內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的選擇相對(duì)困難，氘代內(nèi)標(biāo)較為昂貴，故采用外標(biāo)法定量分析。分別配置1、5、10、20、50、100 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)基質(zhì)添加溶液，以定量離子對(duì)的峰面積(y)對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的質(zhì)量溶度(x)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明兩目標(biāo)物物線性關(guān)系良好(R2>0.995)；以定量離子對(duì)的10倍信噪比作為方法的定量限(LOQ)，以定性離子對(duì)3倍信噪比作為方法的檢出限(LOD)。將系列標(biāo)準(zhǔn)溶液中濃度為20 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，以峰面積的RSD值計(jì)算曲線點(diǎn)的精密度。結(jié)果如表3所示。兩種藥物的線性曲線相關(guān)性好，線性范圍完全能夠滿足日常辦案要求，對(duì)于高濃度藥物在檢驗(yàn)過(guò)程中可以采用溶劑稀釋的方式，將藥物濃度稀釋至線性范圍內(nèi)檢驗(yàn)，不僅能滿足線性要求，對(duì)降低基質(zhì)效應(yīng)也有一定作用。

表3 方法的基質(zhì)工作曲線、靈敏度與精密度Tab 3 calibration curves， sensitivity and precision of the method

2.4 方法的回收率與精密度 選擇同一批次的空白血，添加適量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成3個(gè)濃度水平(5、20、50 ng/mL)的待測(cè)樣品，每個(gè)水平3個(gè)平行樣，使用上述前處理方法處理后，使用基質(zhì)外標(biāo)曲線定量。結(jié)果如表4所示。各個(gè)水平的加標(biāo)回收率均大于85%，方法穩(wěn)定性符合要求。

表4 血液中唑拉西泮和替來(lái)他明的回收率和精密度Tab 4 Recovery rates and precision of zolazepam and tiletamine in the blood

2.5 EPI數(shù)據(jù)采集分析 運(yùn)用MRM-IDA-EPI技術(shù)，分別采集了唑拉西泮、替來(lái)他明50 ng/mL基質(zhì)添加的二級(jí)質(zhì)譜圖，并將采集到的二級(jí)質(zhì)譜圖導(dǎo)入數(shù)據(jù)庫(kù)中，用于定性檢索。如圖2所示，唑拉西泮的兩個(gè)子離子碎片138、243都是由母離子287碎裂產(chǎn)生，而替來(lái)他明的151、179則由母離子224碎裂產(chǎn)生，借助peakview軟件可以給兩物質(zhì)的特征離子做碎片歸屬，進(jìn)一步提高定性的準(zhǔn)確性。

圖2 A-唑拉西泮和B-替來(lái)他明二級(jí)質(zhì)譜圖Fig 2 Full spectrum of A-zolazepam and B-tiletamine

2.6 實(shí)際樣品檢測(cè) 2019年黑龍江某地發(fā)生一起命案，具嫌疑人供述，其將從獸藥店買來(lái)的麻醉劑注射進(jìn)被害人體內(nèi)，導(dǎo)致被害人死亡。當(dāng)?shù)毓矙C(jī)關(guān)立案?jìng)刹楹?，將檢材送至中心要求檢驗(yàn)被害人血液和尿液中唑拉西泮和替來(lái)他明的含量。

運(yùn)用上述建立的方法不僅能獲得高靈敏度的定量結(jié)果，還能借助EPI技術(shù)對(duì)樣本的目標(biāo)物二級(jí)全譜與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的二級(jí)全譜進(jìn)行比對(duì)，獲得更加準(zhǔn)確的定性結(jié)果。檢驗(yàn)結(jié)果如圖3～圖5、表5所示。

圖3 樣品總離子流色譜圖Fjg 3 Chromatogram of total ion flow of the sample

圖4 檢材血和檢材尿中唑拉西泮的EPI全譜與譜庫(kù)比對(duì)結(jié)果Fig 4 Comparison results of EPI full spectrum and spectrum library of zolazepam in blood and urine samples

圖5 檢材血和檢材尿中替來(lái)他明的EPI全譜與譜庫(kù)比對(duì)結(jié)果Fig 5 Comparison results of EPI full spectrum and library of tiletamine in blood and urine samples

表5 樣品定量結(jié)果(μg/mL)Tab 5 Quantitative results of samples

3 討論與結(jié)論

3.1 色譜條件的選擇 本研究考察了phenomenex Kinetex F5(100×3.0 mm，2.6 μm)；ACQUITY-UPLC-BEH C18(100×2.1 mm，1.7 μm)和ACQUITY-UPLC-HSS-T3(100×2.1 mm，1.8 μm)3種色譜柱，F(xiàn)5色譜柱為五氟苯基色譜柱，該柱對(duì)含鹵素含苯基及共軛基團(tuán)的物質(zhì)有較好的分離能力，而C18和T3色譜柱均為C18的鍵合相，區(qū)別在于T3色譜柱對(duì)極性化合物有更好的保留。研究結(jié)果表明phenomenex Kinetex F5(100×3.0 mm，2.6 μm)能夠?qū)⑦蚶縻吞鎭?lái)他明完全分離且信噪比高，另外兩種色譜柱均不能有效分離。根據(jù)藥物的結(jié)構(gòu)，選擇酸性流動(dòng)相有利于藥物電離，但過(guò)高的濃度的酸會(huì)使得基線噪音升高，研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)適當(dāng)增加揮發(fā)性鹽可以改善峰形，經(jīng)實(shí)驗(yàn)后選擇0.01%的甲酸1 mM甲酸銨水-乙腈作為液相流動(dòng)相。這兩種藥物出峰時(shí)間比較接近，采用梯度洗脫的方式使得兩物質(zhì)更好分離。

3.2 基質(zhì)效應(yīng)考察 質(zhì)譜分析過(guò)程中，樣品基質(zhì)中的干擾組分會(huì)對(duì)目標(biāo)待測(cè)物產(chǎn)生影響，從而產(chǎn)生基質(zhì)增強(qiáng)或基質(zhì)抑制效應(yīng)。本研究中評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)的方法是:基質(zhì)效應(yīng)=空白基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)響應(yīng)值/溶劑配制標(biāo)準(zhǔn)響應(yīng)值×100%。當(dāng)基質(zhì)效應(yīng)在80%～120%之間時(shí)，可用標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。當(dāng)基質(zhì)效應(yīng)<80%，為基質(zhì)抑制效應(yīng)，當(dāng)基質(zhì)效應(yīng)>120%時(shí)，為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，此時(shí)可考慮用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。在檢驗(yàn)實(shí)踐中常通過(guò)三個(gè)途徑來(lái)減小基質(zhì)效應(yīng)的影響，一是對(duì)待測(cè)樣品的再凈化處理，常采用液液萃取或固相萃取的方式，去除樣品中的多肽、磷脂、無(wú)機(jī)鹽等干擾因素；二是改變液相分離條件，如改變洗脫強(qiáng)度、液相梯度或pH值等以提高分離度，避免待測(cè)組分與基質(zhì)的共洗脫，使得在分離過(guò)程中能夠有效避開基質(zhì)效應(yīng)區(qū)間；三是減少進(jìn)樣量或稀釋后進(jìn)樣，基質(zhì)效應(yīng)一般伴隨著進(jìn)樣載量增加而增加，只要靈敏度在許可的范圍內(nèi)均可通過(guò)此途徑來(lái)減少基質(zhì)效應(yīng)的影響。綜合上述因素，本研究采用固相萃取的方式來(lái)減少基質(zhì)效應(yīng)對(duì)分析的影響。本研究考察了1、10、50 ng/mL三個(gè)濃度梯度的基質(zhì)效應(yīng)，固相萃取柱子選擇了Waters-PRIME- HLB，該萃取柱吸附劑可以吸附樣品中非極性干擾物而不影響目標(biāo)物的回收率，特別是對(duì)于造成基質(zhì)干擾的脂肪和磷脂，去除效率高達(dá)95%以上。研究發(fā)現(xiàn)唑拉西泮和替來(lái)他明的基質(zhì)效應(yīng)均介于90%～105%之間。在實(shí)際工作過(guò)程中為簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)步驟可忽略基質(zhì)效應(yīng)的影響，采用溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線即可對(duì)二者準(zhǔn)確定量，但本研究中為提高研究結(jié)果可靠性，故采用基質(zhì)加標(biāo)方式考察線性關(guān)系。

3.3 EPI定性方法的選擇 法醫(yī)毒物分析的檢材都是被害人的血、尿、胃內(nèi)容物，基質(zhì)比較復(fù)雜。使用MRM定性模式，當(dāng)藥物濃度過(guò)低時(shí)，由于基質(zhì)的干擾，經(jīng)常會(huì)遇到離子對(duì)保留時(shí)間漂移、離子強(qiáng)度比例偏差大等問(wèn)題，MRM定性準(zhǔn)確性難以保證。本研究利用Q-TRAP線性離子阱技術(shù)，借助于數(shù)據(jù)依賴性獲取技術(shù)(IDA)能將多反應(yīng)檢測(cè)(MRM)和子離子增強(qiáng)掃描模式(EPI)相結(jié)合，在采集MRM離子對(duì)時(shí)，根據(jù)設(shè)定好的采集條件能夠在相同的時(shí)間窗采集到關(guān)聯(lián)的增強(qiáng)子離子碎片全譜信息，為物質(zhì)的準(zhǔn)確定性增加了一個(gè)維度。線性離子阱技術(shù)具有離子富集的作用，借助于此技術(shù)即使在低濃度下，也能打出高質(zhì)量的二級(jí)全譜信息。

法醫(yī)毒物關(guān)注的目標(biāo)物絕大多數(shù)是臨床治療藥物、毒品及新精神活性物質(zhì)，獸用麻醉劑在藥物輔助犯罪中并不多見(jiàn)，由于毒物種類非常多，獸用藥物很少進(jìn)入法醫(yī)毒物分析工作者的視野，當(dāng)遇到此類藥物時(shí)往往沒(méi)有現(xiàn)行有效的檢驗(yàn)方法。在本案例所遇到的唑拉西泮和替來(lái)他明為獸用麻醉劑舒泰的主要成分，此類藥物用于人類麻醉在國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)鮮有報(bào)道。在動(dòng)物麻醉實(shí)驗(yàn)中為監(jiān)測(cè)其血藥濃度，多采用氣相色譜-質(zhì)譜法，該方法定性、定量能力強(qiáng)，但操作繁瑣，靈敏度差。在偵辦迷奸、麻醉?yè)尳俚劝讣邪l(fā)現(xiàn)被害人往往后知后覺(jué)，侵害行為發(fā)生三五天后才報(bào)警，此時(shí)被害人體內(nèi)的藥物濃度極低，氣相色譜-質(zhì)譜法的靈敏度已遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到檢驗(yàn)要求。

寵物用麻醉劑舒泰的主要成分為唑拉西泮和替來(lái)他明，二者通常為1∶1混合。從案例中可以看出替來(lái)他明的代謝速度比唑拉西泮快，故血中替來(lái)他明的濃度低于唑拉西泮，兩者都可經(jīng)尿液排出，替來(lái)他明經(jīng)尿液排泄的速率高于唑拉西泮。因這兩種藥物的代謝速率較快，在一些藥物輔助性犯罪案件的鑒定過(guò)程中常因被害人報(bào)警不及時(shí)，錯(cuò)過(guò)最佳的檢驗(yàn)時(shí)間窗口導(dǎo)致原藥在體內(nèi)檢不出，后續(xù)研究可關(guān)注其代謝物。

本研究所建立的UPLC-MRM-IDA-EPI-MS法兼具定性和定量的功能。EPI增強(qiáng)子離子掃描技術(shù)，能夠增加定性維度，有效避免假陽(yáng)性的發(fā)生；MRM選擇離子監(jiān)控則使方法具備出色的靈敏度，此方法能夠滿足辦案的需求。