重組結(jié)核分枝桿菌精氨酰tRNA合成酶活性驗證及晶體生長

王 煒，陳 磊，陳明心，張 岱，蔣 露，任偉宏

結(jié)核分枝桿菌引起的感染性疾病是造成人類死亡的十大病因之一。2018年全球有1 000萬人感染結(jié)核分枝桿菌。由于抗生素在臨床中的長期、大量使用，耐藥結(jié)核菌感染病例逐年增多，使得結(jié)核分枝桿菌的感染防治工作面臨前所未有的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，因此，開發(fā)新型抗結(jié)核藥物迫在眉睫。然而，結(jié)核病的藥物開發(fā)已經(jīng)停滯了數(shù)十年[1]。氨酰tRNA合成酶(aminoacyl-tRNA synthetase，aaRS)是一個大而多樣的家族，對細(xì)胞生存起著重要作用。抑制這個酶家族成員的活性可導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成終止，達(dá)到抗菌和抗寄生蟲的目的[2]，抑制tRNA氨?；且环N有效的抗菌策略[3]。aaRS抑制劑的研究近年來備受關(guān)注,采用不同的方法、策略，一系列aaRS抑制劑被合成出來[4]。針對不同種類的aaRS[5-9]，aaRS抑制劑表現(xiàn)出較好的選擇性[10]，對哺乳動物的低毒性[11-13]，與aaRS親和力高，能夠強(qiáng)烈抑制蛋白質(zhì)合成[14]。近幾年發(fā)現(xiàn)的一種亮氨酰tRNA合成酶抑制劑在動物實(shí)驗中顯示出強(qiáng)于異煙肼的抑制結(jié)核分枝桿菌能力[15]。aaRS作為結(jié)核分枝桿菌抑制劑的作用靶標(biāo)具有顯著的優(yōu)勢。在這里，我們介紹一種大量制備重組結(jié)核分枝桿菌精氨酰tRNA合成酶(MycobacteriumtuberculosisArginyl tRNA synthetase，MtArgRS)的方法。通過構(gòu)建原核表達(dá)載體，在大腸桿菌中獲得了重組MtArgRS蛋白，通過生化試驗驗證了重組MtArgRS的蛋白折疊及其與天然底物的結(jié)合能力。通過篩選優(yōu)化獲得MtArgRS蛋白晶體。

1 材料與方法

1.1材料 pQE60質(zhì)粒、M15大腸桿菌由河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科保存。高保真DNA聚合酶、限制性核酸內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、DNA marker購自Takara公司。質(zhì)粒提取、凝膠回收試劑盒購自Axygen公司。引物及基因合成、測序在生工生物工程(上海)股份有限公司完成。青霉素、鏈霉素、IPTG購自索萊寶公司。Milipure超濾管、PEG3350、氯化鈉、氯化鎂等購自默克公司。HisPur Ni-NTA樹脂、蛋白質(zhì)Marker購自Thermo Scientific。ATP、精氨酸、Sypro Orange購自Merck公司。結(jié)晶篩選試劑盒購自Hampton Research公司。

1.2方 法

1.2.1重組MtArgRS表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)GenBank登錄號NC_000962.3核酸序列，由睿博興科公司合成結(jié)核分枝桿菌ArgRS(MtArgRS)基因。使用PCR在MtArgRS基因兩端引入NcoI、BglII限制性核酸內(nèi)切酶識別序列。瓊脂糖凝膠純化PCR產(chǎn)物，并使用NcoI、BglII限制性核酸內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物及pQE60質(zhì)粒。消化產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠再次純化后，MtArgRS基因與pQE60質(zhì)粒以摩爾比5∶1混合后T4連接酶25 ℃連接2 h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，37 ℃過夜培養(yǎng)。使用菌落PCR鑒定陽性克隆后送公司測序，確認(rèn)插入基因開放讀碼框是否正確。

1.2.2重組MtArgRS的制備 pQE60-MtArgRS重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化M15大腸桿菌，構(gòu)成重組菌pQE60-MtArgRS/M15。挑取單菌落接種到50 mL LB培養(yǎng)基中37 ℃過夜培養(yǎng)。第2 d將培養(yǎng)物接種到2 L LB培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)。在菌液濃度達(dá)到OD600=0.8時加入1 mmol/L IPTG，18 ℃過夜誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)后的菌液離心收集菌泥，菌泥重懸于含有500 mmol/L NaCl、50 mmol/L Tris pH8.0、1 mmol/L PMSF的裂解緩沖液中。超聲裂解后菌液經(jīng)15 000 g離心45 min去除未破碎的細(xì)菌及不溶性顆粒，可溶性部分用Ni-NTA樹脂結(jié)合。首先用60 mL含有100 mmol/L NaCl、50 mmol/L Tris pH8.0、1 mmol/L PMSF緩沖液洗滌樹脂，然后用20 mL含20 mmol/L咪唑的相同緩沖液洗滌。隨后使用20 mL含300 mmol/L咪唑的緩沖液將結(jié)合樹脂的蛋白洗脫。使用截留分子量為30 kDa的Milipure超濾管把洗脫液濃縮到1.5 mL。濃縮液注入kta層析儀中，使用100 mmol/L NaCl、50 mmol/L Tris pH8.0、1 mmol/L DTT緩沖液進(jìn)行色譜分離。使用SDS-PAGE蛋白電泳分析純化蛋白純度和蛋白分子量。使用截留分子量為30 kDa的Milipure超濾管濃縮重組MtArgRS。Nanodrop測量蛋白質(zhì)濃度并調(diào)整蛋白濃度為10 mg/mL。50 μL分裝后液氮速凍，-80 ℃保存。

1.2.3重組蛋白圓二色譜分析 使用截留分子量為30 kDa的Milipure超濾管置換重組MtArgRS的緩沖液為pH8.0 PBS。在200 μL 10 mg/mL蛋白中加入15 mL pH8.0 PBS，混勻后超速離心濃縮蛋白到1 mL，再加入15 mL PBS，混勻后繼續(xù)離心濃縮，如此反復(fù)4次。重新使用nanodrop調(diào)整重組蛋白濃度為10 μmol/L。交替使用無水乙醇和去離子水清洗圓二色譜石英杯后加入重組蛋白。圓二色譜光譜數(shù)據(jù)在25 ℃下使用1 nm帶寬，197 nm至270 nm的1 nm步進(jìn)分辨率獲得。

1.2.4MtArgRS與配體的結(jié)合分析 使用100 mmol/L NaCl、50 mmol/L Tris pH8.0緩沖液稀釋Sypro Orange到10×。將重組MtArgRS蛋白稀釋到20 nmol/L濃度，與含5 mmol/L ATP、精氨酸的混合液按照1∶1體積比混合，在冰上孵育15 min，然后與10× Sypro Orange按照1∶1體積比混合后冰上孵育15 min。Bio-Rad CFX實(shí)時定量PCR儀加熱程序設(shè)置如下：加熱溫度范圍20～80 ℃。從20 ℃起始，溫度每升高0.5 ℃，維持1 min后進(jìn)行熒光信號檢測。使用Cal Gold540通道檢測Sypro Orange熒光信號。

1.2.5無配體MtArgRS結(jié)晶條件篩選 采用坐滴氣相擴(kuò)散法對純化的MtArgRS進(jìn)行晶體篩選，在20 ℃恒溫條件下培養(yǎng)。選擇Hampton Research公司的PEG/Ion、PEG/Ion2、Crystal Screen1、Crystal Screen2試劑盒，篩選初始結(jié)晶條件。調(diào)整重組MtArgRS蛋白濃度為10 mg/mL。在結(jié)晶孔腔內(nèi)加50 μL結(jié)晶試劑，將蛋白質(zhì)樣品與結(jié)晶試劑按1∶1比例混合于左側(cè)小孔，并將孔腔密封，置于恒溫柜中撫育晶體生長，顯微鏡下定期觀察晶體生長狀況。獲得初篩晶體后，對原始結(jié)晶條件進(jìn)行微調(diào)，使用懸滴氣相擴(kuò)散法進(jìn)行更細(xì)致的結(jié)晶優(yōu)化，提高晶體質(zhì)量，以獲得可以用于X射線衍射的晶體。

2 結(jié) 果

2.1重組基因載體的構(gòu)建 按照pQE60載體的多克隆位點(diǎn)設(shè)計MtArgRS基因引物擴(kuò)增MtArgRS基因。擴(kuò)增結(jié)果如圖1，在1 500～2 000 bp DNA marker旁有一條亮帶，與MtArgRS基因大小近似。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化、限制性核酸內(nèi)切酶消化后連接入pQE60載體中。重組質(zhì)粒經(jīng)測序驗證讀碼框完全正確。

M：GeneRuler 1 kb DNA Marker；1：ArgRS基因擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2MtArgRS重組蛋白的制備 誘導(dǎo)后的pQE60-MtArgRS/M15，經(jīng)超聲破碎、Ni-NTA樹脂結(jié)合、洗脫、濃縮后，使用kta層析儀進(jìn)一步純化。重組MtArgRS純化結(jié)果如圖2。MtArgRS的洗脫峰值是16.70 mL，洗脫峰呈對稱圖形，提示重組蛋白的結(jié)構(gòu)均一，如圖2A所示。重組蛋白洗脫液經(jīng)SDS-PAGE電泳驗證重組蛋白的純度達(dá)到分析純度，如圖2B。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的分子量及洗脫體積計算獲得的方程式為Y=7.900 35-0.186 09X。根據(jù)方程式計算重組MtArgRS的分子量為62 kDa，與MtArgRS的理論分子量60.83 kDa近似。使用Nanodrop的測定值除以重組蛋白的消光系數(shù)0.856，調(diào)整蛋白質(zhì)的濃度為10 mg/mL，50 μL液氮凍存后-80 ℃保存。

A:重組MtArgRS和標(biāo)準(zhǔn)品的gel filtration chromatography洗脫峰，及重組MtArgRS與標(biāo)準(zhǔn)品分子量、洗脫體積的直線擬合；B:洗脫峰對應(yīng)收集孔樣本的SDS-PAGE分析

2.3圓二色譜評價重組蛋白 根據(jù)已解析的大腸桿菌ArgRS晶體結(jié)構(gòu)可知，ArgRS分子主要由α螺旋組成，含有少量的β層疊。為了評價大腸桿菌制備的重組MtArgRS折疊質(zhì)量，使用圓二色譜對重組蛋白進(jìn)行了評估，結(jié)果如圖3。在圓二色譜圖中可以看到在210～220 nm處有兩個最低吸收峰，符合α螺旋的吸收峰特性。這一結(jié)果提示重組MtArgRS分子中的主要組成結(jié)構(gòu)α螺旋正確折疊。

圖3 MtArgRS的圓二色譜分析

2.4重組MtArgRS與底物及類似物結(jié)合的分析 為了驗證重組MtArgRS的生物活性，我們使用thermal shift assay(TSA)分析重組蛋白與天然底物的結(jié)合能力，結(jié)果如圖4。MtArgRS與天然底物ATP、Arg混合后，只有在底物ATP和Arg同時存在時可以使MtArgRS的熔融曲線發(fā)生右移，MtArgRS熱穩(wěn)定溫度升高2 ℃，底物單獨(dú)存在時不能引起MtArgRS熱穩(wěn)定性變化，結(jié)果如圖4A。對重組MtArgRS熱變性熔融曲線進(jìn)行求導(dǎo)得到的熔融溫度峰值如圖4B，與同為aaRS家族的結(jié)核分枝桿菌甲硫氨酰tRNA合成酶相比MtArgRS有兩個峰值溫度分別是41 ℃和47.5 ℃。

A:MtArgRS與天然底物結(jié)合的TSA分析；B:MtArgRS與MtMetRS的熔融溫度峰值圖比較

2.5無配體MtArgRS結(jié)晶的獲得 利用蒸發(fā)擴(kuò)散坐滴法進(jìn)行晶體篩選，重組蛋白質(zhì)濃度為10 mg/mL。通過坐滴法篩選了196種結(jié)晶條件，最終找到3種生長結(jié)晶條件，如圖5所示。結(jié)晶條件：圖5A晶體為0.02 mol/L 二水氯化鈣、20%w/v PEG 3350；圖5B晶體為0.01 mol/L六水氯化鎂、0.1 mol/L HEPES pH7.0、15% w/v PEG 3350；圖5C晶體為0.2 mol/L 氯化鈉、0.1 mol/L 醋酸鈉 pH4.6、30% v/v(+/-)-2-Methyl-2,4-pentanediol。對晶體生長條件進(jìn)行優(yōu)化后，最終在0.01 mol/L 六水氯化鎂、0.1 mol/L HEPES pH7.6、10% w/v PEG 條件下獲得菱角分明的多面體晶體，如圖6所示，晶體外形較好，體積中等大小，完整度較高。

圖5 MtArgRS不同條件下的晶體形狀

圖6 優(yōu)化條件下的MtArgRS晶體形狀

3 討 論

抗感染藥研究和使用在臨床實(shí)踐中具有巨大的吸引力，是人類健康的一個重要領(lǐng)域。目前已經(jīng)從天然物質(zhì)中或通過篩選合成的方法鑒定到了許多特異性的aaRS抑制劑[16-18]。精氨酰tRNA合成酶是aaRS家族中的一員，屬于Ia亞型。目前對aaRS基因沉默的研究顯示，相對于其他aaRS家族成員，ArgRS基因的沉默可以使布氏錐蟲細(xì)胞快速死亡[19]。這顯示ArgRS對維持基本生命活動的重要性，因此也是非常重要的藥物靶標(biāo)。結(jié)核分枝桿菌ArgRS與人胞質(zhì)及線粒體中的ArgRS在氨基酸序列上的一致性僅有28.54%,存在著較大的差異，這也是針對結(jié)核分枝桿菌ArgRS設(shè)計高選擇性抑制劑的基礎(chǔ)。

到目前為止，對ArgRS結(jié)構(gòu)與功能的研究主要局限在大腸桿菌ArgRS，其余病原體的ArgRS研究還未報道。本研究通過使用重組質(zhì)粒在大腸桿菌中成功表達(dá)MtArgRS，并通過分子篩和生化試驗鑒定了重組MtArgRS的完整性和生物活性。重組MtArgRS的TSA試驗結(jié)果提示Arg或ATP單獨(dú)與MtArgRS結(jié)合的親和力低。這一點(diǎn)提示依據(jù)Arg或ATP結(jié)構(gòu)設(shè)計的類似物可能達(dá)不到抑制其活性的能力。由于ArgRS蛋白可以催化Arg與ATP合成Arg-AMP及焦磷酸(PPi)。由此推斷同時加入ATP和Arg后引起ArgRS熱穩(wěn)定性增高的因素是Arg-AMP和PPi。Arg-AMP和PPi可以增強(qiáng)MtArgRS熱穩(wěn)定性這一現(xiàn)象提示，與Arg-AMP及PPi結(jié)構(gòu)相似的化合物是MtArgRS抑制劑篩選的參考對象。此外，TSA實(shí)驗顯示ArgRS與MetRS具有不同的熔融溫度峰值，MtArgRS表現(xiàn)出兩個不同熔融溫度，相差6.5 ℃，這一特性推測可能和ArgRS是多結(jié)構(gòu)域蛋白有關(guān)。而MtArgRS晶體的獲得為MtArgRS結(jié)構(gòu)分析及抑制劑篩選提供了基礎(chǔ)。

本次研究中建立的重組MtArgRS的制備方法，為研究和篩選結(jié)核分枝桿菌抑制劑提供了基礎(chǔ)。

利益沖突：無