miR-128-3p靶向xCT基因在結(jié)直腸癌中的分子機(jī)制及其與腸癌患者臨床病理特征的相關(guān)性

吳 珺,廖旭慧,吳勤麗,余 偉

吳珺,廖旭慧,吳勤麗,余偉,麗水市人民醫(yī)院(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第六醫(yī)院、麗水學(xué)院附屬第一醫(yī)院)病理科 浙江省麗水市 323000

0 引言

結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)是臨床上最為常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤.相關(guān)流行病學(xué)研究顯示[1],在全球范圍內(nèi),結(jié)直腸癌是第三種最常見的惡性腫瘤,約占所有腫瘤患者的10%.2018年,CRC新增病例109萬例,死亡55.1萬人[2].雖然CRC每年造成數(shù)十萬人的死亡,但其發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移的確切分子機(jī)制并未完全清晰.近年來隨著分子生物學(xué)、高通量測序及生物信息學(xué)的不斷發(fā)展進(jìn)步,在高通量大規(guī)模水平上對腫瘤患者全基因組、轉(zhuǎn)錄組及蛋白組水平的分子機(jī)制研究成為了可能[3].

凋亡(Apoptosis)是抑制腫瘤的重要分子機(jī)制,近年來人們又發(fā)現(xiàn)一種新的細(xì)胞死亡形式-鐵死亡(ferroptosis)[4,5].鐵死亡是一種依賴于鐵的程序性細(xì)胞死亡,以脂質(zhì)過氧化物的積累為特征,在遺傳和生物化學(xué)上不同于其他形式的調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡,如凋亡.鐵死亡是由谷胱甘肽依賴性抗氧化功能下降或缺失引起的,導(dǎo)致不受控制的脂質(zhì)過氧化和最終的細(xì)胞死亡[6,7].這種非凋亡形式的細(xì)胞死亡可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞被選擇性清除.xCT基因編碼胱氨酸/谷氨酸反轉(zhuǎn)運(yùn)體X(cystine/glutamate antiporter,xCT),可通過介導(dǎo)胱氨酸攝取和谷氨酸釋放促進(jìn)谷胱甘肽的合成,保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激,維持細(xì)胞的氧化還原平衡,阻止脂質(zhì)過氧化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡[8].已有文獻(xiàn)報道xCT在人多種實體腫瘤包括肺癌、乳腺癌、肝細(xì)胞癌、胃癌及結(jié)直腸癌中高表達(dá)并與患者的預(yù)后有關(guān),但其上游調(diào)控基因及相關(guān)信號通路并不十分清楚[9-11].因此,在本研究中,我們采用生物信息分析結(jié)合細(xì)胞實驗及組織標(biāo)本探討xCT在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其可能的分子調(diào)控機(jī)制.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株及結(jié)直腸癌組織:正常人結(jié)腸上皮細(xì)胞株(NCM460)、人結(jié)直腸癌細(xì)胞株(HT-29,SW480,LoVo及SW62)購自美國ATCC細(xì)胞庫.38例結(jié)直腸癌患者組織標(biāo)本來源于麗水市人民醫(yī)院病理科,對我院手術(shù)治療的結(jié)直腸癌患者組織標(biāo)本進(jìn)行回顧性分析,摘錄患者的臨床病例特征如年齡、性別、腫瘤分期、病理分級等.組織標(biāo)本獲取經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會通過,并患者知情同意.

1.1.2 儀器設(shè)備試劑:細(xì)胞培養(yǎng)箱;恒溫水浴箱;實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)儀7900HT;臺式低速離心機(jī);超低溫冰箱;無菌操作臺Steril CARD Ⅲ Advance;倒置相差顯微鏡(TS100).熒光定量PCR試劑SYBRRPremix Ex TaqTM;反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV Reverse Transcriptase;胎牛血清;小RNA提取試劑盒miRNeasyRMini Kit.

1.2 方法

1.2.1 生物信息分析及xCT上游調(diào)控基因預(yù)測:癌癥基因圖譜(the cancer genome atlas,TCGA) (https://Portal.gdc.cancer.gov/)以及Oncomine (https://www.oncomine.org/resource/login.html)數(shù)據(jù)庫中比較xCT基因在人結(jié)直腸癌及多種實體腫瘤中的表達(dá).腫瘤免疫(tumor immune estimation resource,TIMER)(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)數(shù)據(jù)庫中分析xCT表達(dá)水平與淋巴細(xì)胞浸潤程度關(guān)系.基因表達(dá)綜合(gene expression omnibus,GEO)數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下載結(jié)直腸癌患者癌組織vs癌旁組織差異表達(dá)數(shù)據(jù)集GSE18392,篩序癌組織與癌旁組織差異表達(dá)miRNA,篩選條件為Log2FC＞1,adjP＜0.05.microRNA靶基因在線預(yù)測算法Targetscan(http://www.targetscan.org/vert_72/),miRDB(http://www.mirdb.org/)和StarBase(http://starbase.sysu.edu.cn/starbase2/)預(yù)測xCT上游靶miRNA.GSE18392差異表達(dá)miRNA和預(yù)測靶基因取交集得到miR-128-3p.

圖 1 xCT基因在癌組織和癌旁組織中的相對表達(dá)水平.A:xCT基因在人多種正常組織中的相對表達(dá)水平;B:xCT基因在人多種腫瘤癌組織和癌旁組織中的表達(dá)水平比較.xCT:谷氨酸反轉(zhuǎn)運(yùn)體X.

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng):正常人結(jié)腸上皮細(xì)胞株(NCM460)、人結(jié)直腸癌細(xì)胞株(HT-29,SW480,LoVo及SW62)購自美國ATCC細(xì)胞庫.細(xì)胞采用DMEM培養(yǎng)基,胎牛血清血清(FBS),37 ℃,5% CO2,無菌培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng).

1.2.3 實時熒光定量PCR:采用qRT-PCR法檢測組織和細(xì)胞中xCT-AS1的表達(dá)水平.TRIzol法從組織和細(xì)胞中提取總RNA,經(jīng)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA,采用實時熒光定量PCR進(jìn)行PCR反應(yīng),條件為反應(yīng)條件為:94 ℃變性5 min,40次循環(huán),94 ℃持續(xù)30 s,58 ℃持續(xù)45 s,72 ℃持續(xù)30 s、然后在72 ℃下延長10 min.xCT和miR-128-3p分別以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)和U6為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法計算計算相對表達(dá)量.引物序列為:FP:TGAGCTGGGAACGTGCATTA;RP:AGGGCGAATAACCAGCAGTT.

1.2.4 MTT實驗:將轉(zhuǎn)染的SW460細(xì)胞配置為單細(xì)胞懸浮液,加入培養(yǎng)皿分別在37 ℃、5% CO2下放置24 h、48 h和72 h.加入MTT溶液20 μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去上清,每孔加入150 μL DMSO,置搖床上低速振蕩10 min,檢測OD490 nm處測量各孔的吸光值,繪制細(xì)胞增殖曲線.

1.2.5 劃痕實驗:取對數(shù)生長期SW460細(xì)胞,制備成細(xì)胞懸液接種于六孔板,以50%的細(xì)胞密度接種,置于37 ℃5% CO2孵箱中培養(yǎng).24 h轉(zhuǎn)染miR-128-3p mimic和對照(NC mimic)后繼續(xù)培養(yǎng)24 h,然后用1000 μL槍頭在貼壁細(xì)胞做垂直的劃痕,并拍照記錄劃痕寬度,后繼續(xù)培養(yǎng)并分別于培養(yǎng)24 h,48 h和96 h拍照記錄劃痕寬度,評價細(xì)胞遷移距離.

1.2.6 雙熒光素酶報告實驗:野生型(WT)-xCT,突變型(MUT)-含xCT設(shè)計并插入miR-128-3p的結(jié)合位點到pGL3熒光報告質(zhì)粒(Promega).熒光素酶報告基因分析,SW469細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-128-3p mimic組和對照組與上述熒光素酶報告載體共轉(zhuǎn)染.轉(zhuǎn)染48 h后,通過雙熒光素酶報告檢測系統(tǒng)進(jìn)行檢測.

1.2.7 xCT表達(dá)水平與淋巴細(xì)胞浸潤:在TIMER(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)數(shù)據(jù)庫中分析xCT基因表達(dá)水平與結(jié)直腸癌淋巴細(xì)胞浸潤的關(guān)系.檢索策略:Gene symbol選項為xCT,Cancer type選下為colorectal cancer.Immune infiltrates選項為Bcell,CD8+T cell,CD4+T cell,Macrophage,Neutrophil,Dendritic cell.

1.2.8 xCT相關(guān)信號通路:在TCGA數(shù)據(jù)庫中(http://www.cbioportal.org/)分析xCT基因及相關(guān)信號通路數(shù)據(jù)庫,檢索基因為xCT,物種為人類.

表2 xCT在人體多種腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá),并與某些生物學(xué)行為如侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)

統(tǒng)計學(xué)處理統(tǒng)計學(xué)分析采用R軟件(https://www.r-project.org/)及在線分析軟件完成,計量資料用mean±SD表示,組間比較采用t檢驗,計數(shù)資料采用相對數(shù)表示,行χ2檢驗,雙側(cè)P＜0.05為差別有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 xCT基因表達(dá)水平 xCT基因表達(dá)水平在人體不同組織中存在明顯差異(圖1A)在大多數(shù)腫瘤患者癌組織中表達(dá)水平高于對應(yīng)的癌旁正常組織(圖1B).在結(jié)直腸癌患者中,癌組織xCT表達(dá)水平顯著高于癌旁正常組織,且有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05),圖2.

2.2 xCT突變分析 xCT總體突變率為1%,突變形式主要為錯義突變、融合突變和缺失突變,圖3.

2.3 xCT上游靶基因預(yù)測 在GSE18392數(shù)據(jù)集中篩選出結(jié)直腸癌vs癌旁組織中差異表達(dá)microRNA 24個(圖4A).miRNA靶基因預(yù)測軟件miRDB,targetscan及StarBase預(yù)測xCT上游靶基因,同時與GSE18392差異表達(dá)基因重合的miRNA為miR-128-3p(圖4B).熒光素酶報告基因顯示,miR-128-3p可靶向結(jié)合xCT基因3’UTR區(qū)域(圖4C),結(jié)合位點序列如圖4D所示.

圖 2 xCT基因在結(jié)直腸癌患者癌組織和癌旁組織中的表達(dá)水平比較.A:xCT表達(dá)水平在結(jié)腸癌患者癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織;B:xCT表達(dá)水平在直腸癌患者癌組織中的表達(dá)水平明顯高于和癌旁組織;C:Oncomine數(shù)據(jù)庫中,結(jié)直腸癌組織中xCT表達(dá)水平高于癌旁組織.xCT:谷氨酸反轉(zhuǎn)運(yùn)體X.

圖 3 xCT基因在結(jié)直腸癌標(biāo)本中的突變分析.xCT:谷氨酸反轉(zhuǎn)運(yùn)體X.

2.4 miR-128-3p下調(diào)xCT抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增和遷移 xCT在人結(jié)直腸癌細(xì)胞系(HT-29,SW480,LoVo及SW620)中的表達(dá)水平顯著高于正常結(jié)腸上皮細(xì)胞(NCM460),且有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05),圖5A;miR-128-3p在人結(jié)直腸癌細(xì)胞系中(HT-29,SW480,LoVo及SW620)的表達(dá)水平顯著低于正常結(jié)腸上皮細(xì)胞(NCM460),且有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05),圖5B;外源性miR-128-3p mimic可顯著下調(diào)SW480細(xì)胞中xCT表達(dá)水平,圖5C;miR-128-3p mimic抑制SW480細(xì)胞xCT表達(dá)后,細(xì)胞增殖能力及細(xì)胞遷移能力減低,圖5D,E.

2.5 miR-128-3p與CT表達(dá)負(fù)相關(guān) xCT在38例結(jié)直腸癌患者癌組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織(P＜0.05),圖6A,而miR-128-3p在癌組織中相對表達(dá)水平顯著低于癌旁組織(P＜0.05),圖6B.癌組織中miR-128-3p與xCT表達(dá)負(fù)相關(guān)(rpearson=-0.43,P＜0.05),圖6C.

圖 4 miR-128-3p可與xCT基因3’UTR靶向結(jié)合抑制其表達(dá).A:火山圖篩選出GSE18392數(shù)據(jù)集中篩選出結(jié)直腸癌 vs 癌旁組織中差異表達(dá)microRNA 24個;B:miRNA靶基因預(yù)測軟件miRDB,targetscan及StarBase預(yù)測xCT上游靶基因,同時與GSE18392差異表達(dá)基因重合的miRNA為miR-128-3p;C:熒光素酶報告基因顯示,miR-128-3p可靶向結(jié)合xCT基因3’UTR區(qū)域;D:miR-128-3p與xCT基因3’UTR靶向結(jié)合序列及位點.xCT:谷氨酸反轉(zhuǎn)運(yùn)體X.

圖 5 miR-128-3p下調(diào)xCT抑制腸癌細(xì)胞增和遷移.A:xCT在人結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平顯著高于正常腸上皮細(xì)胞;B:miR-128-3p在人結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平顯著低于正常腸上皮細(xì)胞;C:外源性miR-128-3p mimic可顯著下調(diào)SW480細(xì)胞中xCT表達(dá)水平;D:miR-128-3p mimic抑制SW480細(xì)胞xCT表達(dá)后,細(xì)胞增殖能力減低;E:miR-128-3p mimic抑制SW480細(xì)胞xCT表達(dá)后,細(xì)胞遷移能力減低).aP＜0.05.xCT:谷氨酸反轉(zhuǎn)運(yùn)體X.

2.6 xCT表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征關(guān)系免疫組化顯示xCT陽性表達(dá)于細(xì)胞膜,呈棕黃色顆粒(圖7).38例結(jié)直腸癌組織中xCT陽性表達(dá)者24例(63.2%),陰性表達(dá)者14例(36.8%).xCT陽性表達(dá)與腫瘤分化(P＜0.05)和脈管浸潤(P＜0.05)有關(guān),表1.

圖 6 miR-128-3p與xCT在腸癌患者癌組織和癌旁組織中的表達(dá)情況比較. A:xCT在38例結(jié)直腸癌患者癌組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織;B:miR-128-3p在癌組織中相對表達(dá)水平顯著低于癌旁組織;C:癌組織中miR-128-3p與xCT表達(dá)負(fù)相關(guān).aP＜0.05.xCT:谷氨酸反轉(zhuǎn)運(yùn)體X.

圖 7 免疫組化檢測xCT蛋白表達(dá)情況.A:正常結(jié)腸組織中xCT無表達(dá);B:正常直腸組織中xCT無表達(dá);C:結(jié)腸癌患者癌旁組織中xCT陽性表達(dá)于細(xì)胞膜,呈棕黃色顆粒;D:結(jié)腸癌患者癌組織中xCT陽性表達(dá)于細(xì)胞膜,呈棕黃色顆粒.xCT:谷氨酸反轉(zhuǎn)運(yùn)體X.

2.7 xCT表達(dá)水平與淋巴細(xì)胞浸潤 xCT表達(dá)水平與結(jié)腸癌CD8+T細(xì)胞,中性粒細(xì)胞,樹突狀細(xì)胞浸潤有關(guān)(P＜0.05),與直腸癌CD8+T細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤有關(guān)(P＜0.05),而于其他淋巴細(xì)胞浸潤水平無關(guān)(P＞0.05),圖8.

2.8 xCT相關(guān)信號通路 xCT參與的鐵死亡是一種細(xì)胞死亡的調(diào)節(jié)形式,其特征是由鐵的積累和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species,ROS).在癌細(xì)胞和某些正常細(xì)胞中可由erastin、RSL3或臨床藥物如柳氮磺胺吡啶、索拉非尼誘導(dǎo).xCT參與多種生理和病理過程,如癌細(xì)胞死亡、神經(jīng)退行性疾病、組織損傷和急性腎功能衰,圖9.

圖 8 xCT表達(dá)水平與淋巴細(xì)胞浸潤水平相關(guān)性散點圖. xCT:谷氨酸反轉(zhuǎn)運(yùn)體X.

圖 9 xCT參與的鐵死亡相關(guān)信號通路示意圖. xCT:谷氨酸反轉(zhuǎn)運(yùn)體X.

圖 10 xCT蛋白三維結(jié)構(gòu)模式圖. A:前面觀;B:后面觀;C:側(cè)面觀.xCT:谷氨酸反轉(zhuǎn)運(yùn)體X.

3 討論

鐵死亡(Ferroptosis)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞死亡方式,一種依賴于鐵的程序性細(xì)胞死亡,以脂質(zhì)過氧化物的積累為特征.鐵死亡與細(xì)胞內(nèi)的氧化還原穩(wěn)態(tài)失衡相關(guān).與凋亡、壞死等傳統(tǒng)的死亡方式不同,細(xì)胞內(nèi)游離鐵增多和脂質(zhì)過氧化是鐵死亡獨(dú)特的代謝特征[12,13].已有諸多文獻(xiàn)表明,相對于人體正常體細(xì)胞,腫瘤細(xì)胞往往需要更多的鐵來維持自身的生長和增殖,該特征導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對于鐵死亡更加敏[14].鐵死亡是由谷胱甘肽依賴性抗氧系統(tǒng)的失效引起的,進(jìn)而導(dǎo)致失控的脂質(zhì)過氧化和最終的細(xì)胞死亡.盡管鐵與脂質(zhì)過氧化之間的聯(lián)系多年來一直受到重視,但直到2012年Brent Stockwell和Scott J.Dixon才發(fā)明了“鐵死亡”一詞用以描述不同于細(xì)胞凋亡的另一種細(xì)胞死亡過程[15].

xCT基因是目前已知的參與鐵死亡的相關(guān)基因.該基因定位于人體4q28.3,編碼一種胱氨酸-谷氨酸逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,該蛋白依賴于氯離子,稱為系統(tǒng)Xc-或xCT[16].xCT是一個非鈉離子依賴的異二聚體陰離子氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的成員,對胱氨酸和谷氨酸具有高度特異性.這種逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)口胱氨酸和出口谷氨酸,這兩種氨基酸.逆向轉(zhuǎn)運(yùn)器的功能是一對一的逆向轉(zhuǎn)運(yùn),即一種物質(zhì)在跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的同時,另一種物質(zhì)以相反的方向跨膜轉(zhuǎn)運(yùn).這種蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)包括兩條鏈:一條特定的輕鏈xCT和一條重鏈4F2,它們通過二硫鍵連接.xCT鏈有12個跨膜結(jié)構(gòu)域,由501個氨基酸組成,4F2鏈在轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中高度保守(圖10).它通過刺激突觸外受體來調(diào)節(jié)突觸活動,并釋放谷氨酸.該基因在星形膠質(zhì)細(xì)胞中高度表達(dá),并將胱氨酸的攝取與谷氨酸的釋放結(jié)合起來.xCT是構(gòu)成System Xc-的底物特異性亞基,負(fù)責(zé)將胱氨酸從細(xì)胞外運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi).當(dāng)細(xì)胞處于氧化應(yīng)激和半胱氨酸缺乏的情況時,核因子紅細(xì)胞2相關(guān)因子2和轉(zhuǎn)錄因子4可誘導(dǎo)XCT的表達(dá).研究發(fā)現(xiàn)xCT在腫瘤組織中高表達(dá),并且xCT的高表達(dá)可以抑制ROS誘導(dǎo)的鐵死亡[17].抑制細(xì)胞外胱氨酸進(jìn)入細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽水平降低,從而導(dǎo)致鐵死亡.從結(jié)構(gòu)上看,xCT可能是上述Xc-系統(tǒng)維持正常運(yùn)作的主要決定因素.

目前已有文獻(xiàn)證實xCT在人體多種腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá),并與某些生物學(xué)行為如侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)(表2)[9-11,18-21].Timmerma及其同事分析乳腺癌細(xì)胞中xCT表達(dá)及其與患者預(yù)后關(guān)系發(fā)現(xiàn),xCT在乳腺癌組織及細(xì)胞系中呈現(xiàn)高表達(dá),并與患者的預(yù)后不良有關(guān)[22].Sugano[18]對304例結(jié)直腸癌患者的組織標(biāo)本中xCT的表達(dá)水平進(jìn)行了分析,免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)68.4%(208例)的結(jié)直腸癌患者腫瘤組織中xCT蛋白呈現(xiàn)陽性表達(dá),并且陽性表達(dá)患者術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險顯著高于無表達(dá)者.同時,細(xì)胞實驗也顯示,在惡性黑色素瘤細(xì)胞中過表達(dá)xCT后細(xì)胞增殖和遷移能力增強(qiáng)[21].上述研究均提示xCT在腫瘤中往往高表達(dá),并與細(xì)胞的增殖和侵襲有關(guān).同時,高表達(dá)往往提示腫瘤患者預(yù)后不良.然而,xCT上游靶向調(diào)控基因并不清楚.

4 結(jié)論

在我們的研究中,我們從生物信息學(xué)分析入手,在生物信息數(shù)據(jù)庫、細(xì)胞試驗和組織標(biāo)本方面探討了xCT及其上游調(diào)控基因信號通路,探討了相關(guān)分子機(jī)制和對細(xì)胞生物學(xué)功能的影響.結(jié)果miR-128-3p可與xCT基因3’UTR靶向結(jié)合并抑制其表達(dá),從而影響腸癌細(xì)胞的增殖和遷移等生物學(xué)行為.這一發(fā)現(xiàn)豐富了xCT基因的生物學(xué)功能及調(diào)控信號通路,同時為以miR-128-3p/xCT通路相關(guān)的靶向治療藥物研發(fā)提供了思路,也豐富了鐵死亡的相關(guān)研究內(nèi)容.

文章亮點

實驗背景

結(jié)直腸癌(colorectal carcinoma,CRC)臨床上較為常見,但其發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移的確切分子機(jī)制仍不清.近年來鐵死亡在腸癌生物學(xué)功能分子機(jī)制研究研究中日益受到關(guān)注.鐵死亡是由谷胱甘肽依賴性抗氧化功能下降或缺失引起的,導(dǎo)致不受控制的脂質(zhì)過氧化和最終的細(xì)胞死亡谷氨酸反轉(zhuǎn)運(yùn)體X(cystine/glutamate antiporter,xCT)可通過介導(dǎo)胱氨酸攝取和谷氨酸釋放促進(jìn)谷胱甘肽的合成,保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激,維持細(xì)胞的氧化還原平衡,阻止脂質(zhì)過氧化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡.xCT被證實在多種腫瘤中高表達(dá)并與細(xì)胞的鐵死亡有關(guān).

實驗動機(jī)

通過生物信息學(xué)檢索相關(guān)數(shù)據(jù)庫、細(xì)胞分子實驗及臨床組織標(biāo)本探討xCT在人多種腫瘤和結(jié)直腸癌中的表達(dá),分析xCT基因上游靶基因及其抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、侵襲的分子機(jī)制.

實驗?zāi)繕?biāo)

探討xCT基因在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況,篩選出xCT基因上游靶基因及其調(diào)控的信號通路及分子機(jī)制,評估xCT表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病例特征關(guān)系.

實驗方法

首先采用生物信息分析方法比較xCT基因在人結(jié)直腸癌及多種實體腫瘤中的表達(dá)及其與淋巴細(xì)胞浸潤程度關(guān)系.篩序結(jié)直腸癌組織與癌旁組織差異表達(dá)miRNA并預(yù)測靶基為miR-128-3p.并采用雙熒光素酶報告實驗驗證miR-128-3p與xCT靶向調(diào)控關(guān)系.細(xì)胞學(xué)實驗驗證miR-128-3p與xCT的靶向關(guān)系及其對細(xì)胞生物學(xué)功能的影響.免疫組織化學(xué)發(fā)評價xCT蛋白表達(dá)水平及其與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征關(guān)系.

實驗結(jié)果

結(jié)直腸癌組織xCT表達(dá)水平顯著增高.miR-128-3p可靶向結(jié)合xCT基因3’UTR區(qū)域并抑制SW480細(xì)胞增殖和遷移能力.xCT在結(jié)直腸癌患者癌組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織(P＜0.05),而miR-128-3p在癌組織中相對表達(dá)水平顯著低于癌旁組織(P＜0.05).癌組織中miR-128-3p與xCT表達(dá)負(fù)相關(guān)(rpearson=-0.43,P＜0.05).xCT陽性表達(dá)與腫瘤分化和脈管浸潤有關(guān).xCT表達(dá)水平與結(jié)腸癌CD8+T細(xì)胞,中性粒細(xì)胞,樹突狀細(xì)胞浸潤有關(guān)(P＜0.05),與直腸癌CD8+T細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤有關(guān)(P＜0.05).

實驗結(jié)論

xCT在結(jié)直腸癌中表達(dá)水平明顯升高,miR-128-3p可靶向抑制xCT基因表達(dá)從而抑制腸癌細(xì)胞的增殖和遷移,miR-128-3p/xCT通路為腸癌靶向藥物的研發(fā)提供了新的思路.

展望前景

小干擾RNA miR-128-3p可靶向調(diào)控xCT表達(dá)并影響腸癌細(xì)胞的生物學(xué)功能.抑制結(jié)直腸癌miR-128-3p/xCT信號通路可能是腸癌靶向治療的新靶點.