GeXP 多重RT-PCR 診斷小兒肺炎支原體感染性腦炎的價(jià)值分析

馮日昇 郭燕軍

鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院 河南省兒童醫(yī)院 鄭州兒童醫(yī)院，河南 鄭州450000

肺炎支原體（mycoplasma pneumoniae，MP）是兒 童呼吸道感染的常見病原體，因MP主要在宿主上皮細(xì)胞表面存活，同時(shí)還可進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行繁殖，并向外傳播，因此患兒不僅表現(xiàn)出呼吸系統(tǒng)癥狀，還可出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)損害，患兒合并腦炎、紋狀體壞死、無菌性腦膜炎等疾?。?］。但臨床以腦炎更為常見，其發(fā)病機(jī)制可能與自身免疫、血管閉塞有關(guān)，目前仍未明確［2］。因MP腦炎起病可急可緩，通常直接以神經(jīng)系統(tǒng)癥狀為首發(fā)，嚴(yán)重者可出現(xiàn)意識障礙、共濟(jì)失調(diào)、失語等，及時(shí)診斷對其預(yù)后十分重要［3］。MP 血清學(xué)檢查的敏感度、特異度受限，腦脊液內(nèi)特異性IgM 檢測則常作為補(bǔ)充手段，同時(shí)還需結(jié)合腦電圖檢查確診［4］。MP 感染的患兒腦脊液中PCR 陽性率較低，而MP 感染性腦炎可通過免疫損傷間接引起腦炎，因此，即使MP 感染性腦炎的PCR 診斷為陰性，仍存在假陽性的可能。MP感染性腦炎患兒病程長、并發(fā)癥多且病情復(fù)雜多樣，因?qū)P腦炎的發(fā)病機(jī)制尚未完全清晰，但可以明確的是如不及時(shí)確診予以針對性治療，可能影響患兒的中樞神經(jīng)系統(tǒng)、自身免疫系統(tǒng)，患兒預(yù)后較差。

PCR 是目前實(shí)驗(yàn)室常用的診斷技術(shù)，GeXP 多重RT-PCR 作為分子檢測技術(shù)，主要用于多種病原菌感染下的診斷、鑒別，利用毛細(xì)管電泳分離技術(shù)、多重基因分析技術(shù)大大提高了檢測靈敏度及速率，具有高效性和系統(tǒng)性［5-7］。另外，通過毛細(xì)管電泳可以直接顯示產(chǎn)物片段長度及相應(yīng)的熒光信號值大小評估檢查結(jié)果，可用于腦炎患兒病原菌的檢測，與普通的PCR 及其他血清學(xué)檢查方法，節(jié)省時(shí)間和勞動力［7］?？紤]GeXP 多重RT-PCR 檢測技術(shù)對標(biāo)本的要求低且檢測迅速、重復(fù)性好，為探討GeXP 多重RT-PCR 在感染性腦炎患兒中的診斷及鑒別效能，以鄭州市兒童醫(yī)院收治的疑似MP 腦炎患兒為研究對象，比較腦脊液病原菌檢測結(jié)果（規(guī)腦脊液細(xì)菌培養(yǎng)、腦脊液病毒檢測、支原體檢測）與GeXP 多重RT-PCR，分析不同病原菌檢測情況，同時(shí)分析GeXP 多重RT-PCR 漏診的原因，對GeXP 多重RT-PCR 漏診患兒腦脊液生化檢測分析，綜合評估其診斷效能。

1 資料與方法

1.1 一般資料以2017-05—2020-05 鄭州市兒童醫(yī)院收治的初診為疑似MP 感染性腦炎患兒為研究對象，采用回顧性研究，收集符合納入標(biāo)準(zhǔn)的85例患兒，年齡1 ～12 歲，男48 例，女37 例；臨床表現(xiàn)：以發(fā)熱伴頭痛為首發(fā)癥狀73 例，嘔吐或精神萎靡76 例，體格檢查腦膜刺激征陽性39例。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)參照劉成玉主編的《臨床檢驗(yàn)基礎(chǔ)》［8］相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)：（1）患兒臨床表現(xiàn)和體征有頭痛、嘔吐、發(fā)熱（體溫≥38 ℃）及腦膜刺激征陽性，表現(xiàn)出神經(jīng)系統(tǒng)受損，還可累及其他器官、系統(tǒng)；（2）病毒性腦炎樣腦脊液改變；（3）腦電圖檢查顯示彌漫性或局灶性慢波改變；（4）血清或腦脊液中MP-IgM陽性。

1.3 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）首診均為感染性腦炎；（2）臨床信息完整；（3）均為首發(fā)腦炎。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并其他器官、系統(tǒng)原發(fā)性感染者；（2）檢測前3 d使用紅霉素等大環(huán)內(nèi)酯類藥物，可能影響病原菌檢查者；（3）入組時(shí)已存在全身感染性疾病者；（4）合并嚴(yán)重血液系統(tǒng)疾病、免疫性疾病或腫瘤，可能影響病原菌檢測者。

1.4 方法患兒住院尚未進(jìn)行治療前，分別采集2 mL 靜脈血置于不同真空采血管中，進(jìn)行血清支原體抗體檢測和EB 病毒抗體四聯(lián)檢測。由醫(yī)師進(jìn)行腰椎穿刺收集腦脊液標(biāo)本，按照相關(guān)檢驗(yàn)流程分裝7 管，其中第1 管為2 mL，注入腦脊液培養(yǎng)瓶中，第2 ～7 管每管1 mL，做好標(biāo)記，不同腦脊液標(biāo)本用途不同，需分別進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)、新型陰性菌培養(yǎng)、抗酸染色涂片（均由其中1 管進(jìn)行）。不同用途的腦脊液標(biāo)本保存方式不一，待檢的采血管需低溫保存。余下的5 管腦脊液標(biāo)本中選取1 管進(jìn)行腦脊液生化檢驗(yàn)，1 管進(jìn)行腦脊液常規(guī)檢查，余3 管置于 80 ℃中待檢。

采集相應(yīng)標(biāo)本后分別進(jìn)行細(xì)菌檢測，如標(biāo)本檢測為陽性，則進(jìn)一步判斷細(xì)菌類型；在細(xì)菌培養(yǎng)中若有細(xì)菌生長，還需進(jìn)行相應(yīng)的藥敏試驗(yàn)，如無細(xì)菌生長，其檢驗(yàn)報(bào)告為“無細(xì)菌生長”。病毒檢測：將上述2 支采血管中血標(biāo)本進(jìn)行離心，得血清后進(jìn)行血清支原體抗體測定、EB 病毒殼抗原IgM 抗體檢測。

MP 檢測：（1）首先進(jìn)行血清MP 檢測：收集上述血清標(biāo)本進(jìn)行MP IgM 測定，采用被動顆粒凝集法進(jìn)行檢測，離心后留取血清備用，注意血清樣品中還存在紅細(xì)胞或其他有形成分時(shí)，應(yīng)在離心前除去，防止干擾試驗(yàn)結(jié)果。試驗(yàn)中所用的酶標(biāo)儀為瑞士Tecan sunrise 酶標(biāo)儀，試劑盒由上海酶聯(lián)生物公司提供。（2）腦脊液MP 檢測：采用GeXP 多重RTPCR 檢測。對MP 抗體濃度1∶160 及以上的患兒取其低溫保存的腦脊液標(biāo)本1 mL，平均分為2 份，每份0.5 mL。首選提取樣本總核酸，將提取的核酸置于 80 ℃低溫保存待檢測。配置BB5 和Carrier RNA 混合液，取待檢測的腦脊液樣品200 μL，分別加入1.5 mL 的離心管中，混合后室溫放置5 min。在離心柱中再次加入溶液和沉淀，再次離心，重復(fù)上述混合、放置步驟，于室溫下離心1 min，去除乙醇，徹底晾干離心柱。經(jīng)系列操作后，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。

RT 反應(yīng)體系：DNase/RNase Free H2O（白色），體積5.5 μL；5×RT Buffer（藍(lán)色），體積2.0 μL；Res V RT primer mix（橙色），體積1.0 μL；Reverse transcriptase（紅色），體積0.5 μL；共計(jì)9 μL。反應(yīng)序列如下：第一步48 ℃1 min，第二步42 ℃60 min，第三步95 ℃5 min，第四步4 ℃保持。

PCR 反應(yīng)：10×PCR Buffer（黃色），體積1.0 μL；25 mmol/L MgCl2（紫色），體積2.0 μL；Res V PCR primer mix（玫紅色），體積1.0 μL；Solution X（咖啡色），體積1.0 μL；Taq DNA Polymerase（綠色），體積0.35 μL；總計(jì)5.35 μL。PCR 反應(yīng)程序：第一步94 ℃1 min，第二步94 ℃30 s，60 ℃30 s，70 ℃30 s，35次；第三步4 ℃保持。

GeXP 毛細(xì)電泳分離樣品：SLS 上樣液，體積0.198 μL/孔；DNA Size Standard-400，體積0.2 μL/孔，總計(jì)20 μL/孔。

檢測結(jié)果時(shí)采用美國的Beckman Coulter公司的GeXP 片段分析系統(tǒng)。如檢測測位點(diǎn)峰高高于標(biāo)準(zhǔn)品，則判斷為陽性，反之為陰性。若檢測位點(diǎn)峰高處于標(biāo)準(zhǔn)品低峰和高峰之間，則為灰區(qū)，需重新進(jìn)行擴(kuò)增檢測，如結(jié)果再次檢測為灰區(qū)，可判為陰性。

1.5 觀察指標(biāo)記錄MP檢測結(jié)果，分別比較抗體顆粒凝集法與GeXP多重RT-PCR 法檢測結(jié)果，記錄不同結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦脊液病原菌檢測結(jié)果首次進(jìn)行細(xì)菌檢測中陽性21 例（24.71%），病毒檢測中陽性3 例（3.53%），在腦脊液標(biāo)本中檢測顯示支原體感染61 例（71.76%）。見表1。

表1 腦脊液病原菌檢測結(jié)果分析Table 1 Analysis of detection results of pathogenic bacteria in cerebrospinal fluid

2.2 血清標(biāo)本中腦脊液檢測結(jié)果經(jīng)細(xì)菌檢測及病毒檢測后，余61例患者進(jìn)行MP檢測，抗體顆粒凝集法檢測顯示15例標(biāo)本血清IgM陰性，46例陽性。GeXP多重RT-PCR法檢測顯示陽性55例，陰性6例。GeXP多重RT-PCR法檢測效能與抗體顆粒凝集法比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.659，P=0.031）。見表2。

表2 血清標(biāo)本與腦脊液標(biāo)本檢測結(jié)果情況Table 2 Detection results of serum samples and cerebrospinal fluid samples

2.3 GeXP 多重RT-PCR 法漏診分析6 例漏診患者的腦脊液生化檢測分析，其腦脊液蛋白質(zhì)水平處于不同兩個(gè)階段，包括0.3～0.2 g/L 階段、0.5～0.32 g/L的階段，結(jié)合血清肺IgM 滴度考慮，患者無合并其他細(xì)菌性肺炎或結(jié)核性腦炎，均為MP陽性株。

表3 GeXP多重RT-PCR法6例漏診分析Table 3 Analysis of 6 cases of missed diagnosis by GeXPbased multiplex RT-PCR

MP感染患兒的早期臨床癥狀并無特殊性，與結(jié)核性腦炎、病毒性腦炎早期癥狀相似，臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、惡心、嘔吐及其他系統(tǒng)性損傷等［9-10］，隨著病情的進(jìn)展，患者還可能出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。有關(guān)MP腦炎的發(fā)病機(jī)制目前仍不完全明確，可分為早發(fā)型和晚發(fā)型［11-13］，早發(fā)型由MP 直接侵入腦組織，晚發(fā)型則是由免疫介導(dǎo)引起，但不能將兩種機(jī)制完全分離，部分學(xué)者認(rèn)為，即使是免疫介導(dǎo)的，也不能排除MP直接感染，因此其治療方案還需依據(jù)病情發(fā)展、臨床經(jīng)驗(yàn)。

因MP 腦炎的臨床表現(xiàn)缺乏特異性，常規(guī)的腦脊液或外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)檢查、紅細(xì)胞沉降率等指標(biāo)對MP 腦炎并無明顯幫助，即使采取分子檢測法，也存在一定的漏診率和誤診率［14-16］。目前認(rèn)為檢測MP中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的金標(biāo)準(zhǔn)是病毒分離法，但鑒于MP 繁殖速度緩慢，需耗時(shí)3 周才能將其分離［17］，而MP 腦炎病情通常進(jìn)展迅速，患兒還可能合并多種病原體感染，增加治療難度，因此除了分子試驗(yàn)，臨床通常需根據(jù)患兒的臨床癥狀、腦電圖、實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)等進(jìn)行綜合分析［18］。MP 血清學(xué)檢查需根據(jù)急性期和恢復(fù)期雙份血清學(xué)檢查，如恢復(fù)期抗體滴度增加至少4 倍可認(rèn)為是MP 現(xiàn)癥感染［19-21］，但既往感染的患兒同樣可能被檢測出現(xiàn)癥感染，因此很大程度上限制了其在MP 腦炎中的作用［22］。為此，本研究將其作為MP 腦炎檢測第一步，再進(jìn)行GeXP 多重RT-PCR 進(jìn)行診斷。GeXP 是新的基因表達(dá)譜定量分析平臺，臨床通常將其用于腫瘤基因、藥物毒性分析［23-25］，隨著技術(shù)的完善、發(fā)展，還可用于呼吸道病毒和腦炎相關(guān)病原體檢測。一項(xiàng)調(diào)查報(bào)告顯示［26］，血清學(xué)和多重PCR 檢測之間的MP 實(shí)驗(yàn)室診斷不一，GeXP與血清學(xué)分析相比顯示出更靈敏和可靠的性能，能提供更多的信息。為減少多重PCR 的假陰性率，可結(jié)合GeXP分析。GeXP-多重PCR技術(shù)是指在同一個(gè)PCR 反應(yīng)體系中多通路檢測呼吸道病毒，相比普通的PCR，在節(jié)省大量人力、物力的同時(shí)，還具有較高靈敏度，故本研究將其用于MP 感染性腦炎的診斷。

本研究顯示，85 例患兒中細(xì)菌感染為24.71%，病毒感染為3.53%，支原體感染為71.76%。但采用被動顆粒凝集法進(jìn)行MP IgM 測定時(shí)，15 例標(biāo)本血清IgM 陰性，46 例陽性，GeXP 多重RT-PCR 法檢測顯示陽性55 例，陰性6 例，統(tǒng)計(jì)分析顯示GeXP 多重RT-PCR 法檢測效能優(yōu)于抗體顆粒凝集法。分析其漏診、誤診原因，可能是MP 的特異性抗體IgM 一般在MP 感染后的1 周出現(xiàn)，在3 ～4 周達(dá)到高峰再下降，考慮到抗體滴度及檢驗(yàn)時(shí)間因素，在疾病早期如早發(fā)性腦炎患兒易出現(xiàn)假陰性，尤其是免疫力低下不容易產(chǎn)生抗體的患兒。另外，肺炎支原體特異性抗體IgM 抗體通常在MP 感染12 ～16 周消失，如抗體滴度是肺炎支原體感染陰性血清的4 倍為陽性，此時(shí)期如想提高M(jìn)P 感染檢測準(zhǔn)確度，最好的改良辦法是在感染后2 ～3 周同時(shí)檢測IgM、IgG 2 次，且患兒不同于成年人，成年人中可能沒有IgM 反應(yīng)，而MP 感染史的患兒在較長的時(shí)間內(nèi)會出現(xiàn)體內(nèi)IgG抗體持續(xù)升高，因此不宜單獨(dú)進(jìn)行血清學(xué)檢查。針對GeXP 多重RT-PCR 法漏診的6 例患者的腦脊液生化檢測分析顯示，患兒的腦脊液蛋白質(zhì)水平處于0.3 ～0.2 g/L 階段、0.5 ～0.32 g/L 階段，含量較低可能引起漏診。

本研究選取研究對象均為首診為疑似MP 感染性患兒，故檢測出的MP 感染性腦炎較多，可能間接提高GeXP多重RT-PCR 法的診斷效能，但相對于既往實(shí)驗(yàn)室常用的抗體顆粒凝集法，具有較高的靈敏度、準(zhǔn)確率，同時(shí)為MP 感染性腦炎早期診斷及時(shí)提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。