NLRP3 炎癥小體與腦梗死后患者神經(jīng)功能恢復(fù)的相關(guān)性分析

王 玲 孫玉華 浮榮莉 黃曉哲 王斌杰 王長(zhǎng)福

河南大學(xué)淮河醫(yī)院，河南 開(kāi)封475000

腦梗死是因局部血供障礙導(dǎo)致腦組織缺血壞死而起，患者的典型表現(xiàn)為神經(jīng)功能缺損，而早期改善患者神經(jīng)功能對(duì)降低殘障率意義重大。相關(guān)研究表明，腦梗死患者神經(jīng)功能恢復(fù)狀況仍有待改善，而導(dǎo)致腦梗死患者神經(jīng)功能恢復(fù)不佳的因素較多，包括高齡、糖尿病與血清C 反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）異常表達(dá)等［1-2］。糖尿病可導(dǎo)致腦血管發(fā)生彌散性改變與血管壁損傷，進(jìn)而損害大腦中動(dòng)脈及周邊組織，造成相應(yīng)的功能障礙［3］，且長(zhǎng)期血糖高負(fù)荷還會(huì)損傷微血管，引發(fā)腔隙性梗死，進(jìn)而加重腦梗死患者的局部血供障礙，導(dǎo)致血腦屏障被破壞，最終造成不可逆的神經(jīng)損傷［4-5］。CRP 是常見(jiàn)炎癥因子，能直接損傷神經(jīng)元，破壞額葉皮質(zhì)下的神經(jīng)環(huán)路，進(jìn)而損害神經(jīng)功能，且腦梗死患者發(fā)生神經(jīng)功能缺損的主要原因是局部腦組織炎性損傷，故CRP 水平能反映神經(jīng)功能缺損程度［6］。目前，隨著臨床對(duì)上述危險(xiǎn)因素的認(rèn)識(shí)加深，相關(guān)的干預(yù)手段也得到廣泛應(yīng)用，而為了進(jìn)一步改善腦梗死患者的預(yù)后狀況，對(duì)神經(jīng)功能恢復(fù)影響因素的深入探索顯得愈發(fā)重要。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，人體的核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor family pyrin domain，NLRP3）炎癥小體能通過(guò)模式識(shí)別受體識(shí)別內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)，NLRP3 炎癥小體被激活后可促進(jìn)多種炎癥因子的釋放，介導(dǎo)腦組織的炎性損傷，在神經(jīng)血管疾病的發(fā)病中起重要作用［7］。NLRP3炎癥小體主要由NLRP3、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（apoptosis associated speckle-like protein containing CARD，ASC）與半胱天冬酶-1 前體組成，在人體內(nèi)皮細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元中呈多樣性表達(dá)，而NLRP3 炎癥小體的表達(dá)情況可能對(duì)腦梗死患者的神經(jīng)功能恢復(fù)有重要影響，但目前能證實(shí)這一推測(cè)的報(bào)告較少［8］。

本研究著重分析腦梗死患者NLRP3炎癥小體表達(dá)與神經(jīng)功能恢復(fù)的關(guān)系，旨在為未來(lái)腦梗死的治療提供新方向，以改善患者的神經(jīng)功能恢復(fù)現(xiàn)狀。

1 資料與方法

1.1 一般資料回顧分析2018-01—2019-12 河南大學(xué)淮河醫(yī)院收治的102 例腦梗死患者的臨床資料。（1）納入條件：①符合腦梗死診斷標(biāo)準(zhǔn)；②初次發(fā)?。虎郯l(fā)病至入院時(shí)間≤24 h；④中重度神經(jīng)功能缺損［美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生院卒中量表（National Institutes of Health stroke scale，NIHSS）［9］評(píng)分≥4分］。（2）排除條件：①合并心血管疾病者；②合并炎癥性疾病或感染性疾病者；③合并惡性腫瘤者；④合并顱腦創(chuàng)傷、腦出血、癲癇、腦代謝性疾病者；⑤臨床資料、實(shí)驗(yàn)室資料或隨訪資料缺失者。根據(jù)神經(jīng)功能恢復(fù)情況將102 例患者分為恢復(fù)組（n=70 例）與未恢復(fù)組（n=32例），恢復(fù)組男44 例，女26 例；年齡40 ～74（57.11±8.65）歲；發(fā)病至入院時(shí)間0.5 ～24（11.98±6.37）h。未恢復(fù)組男22 例，女10 例；年齡40 ～74（57.64±8.73）歲；發(fā)病至入院時(shí)間1～24（12.66±6.43）h。2組一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 神經(jīng)功能恢復(fù)情況：應(yīng)用NIHSS量表評(píng)估患者入院時(shí)、入院后第1個(gè)月神經(jīng)功能缺損程度。NIHSS量表包含意識(shí)和定向、視野、上肢運(yùn)動(dòng)、下肢運(yùn)動(dòng)、語(yǔ)言、忽視等11 個(gè)項(xiàng)目，分值范圍0 ～42 分，評(píng)分愈高表示患者神經(jīng)功能缺損愈嚴(yán)重。神經(jīng)功能缺損分度：NIHSS 評(píng)分＜4 分為輕度，4 ～15 分為中度，＞15分為重度。患者入院后第1 個(gè)月的NIHSS 評(píng)分較入院時(shí)降低≥2分表示神經(jīng)功能恢復(fù)，神經(jīng)功能恢復(fù)率=神經(jīng)功能恢復(fù)例數(shù)/總例數(shù)×100%。

1.2.2 臨床資料：統(tǒng)計(jì)患者一般資料，包括性別（男、女）、年齡、發(fā)病至入院時(shí)間、高血壓（有、無(wú)）、糖尿?。ㄓ?、無(wú)）、神經(jīng)功能缺損分度（中度、重度，入院時(shí)采用NIHSS 評(píng)估）、NLRP3 炎癥小體表達(dá)。高血壓：舒張壓＞90 mmHg 和（或）收縮壓＞140 mmHg。糖尿?。嚎崭寡撬剑?.0 mmol/L 或餐后2 h 血糖水平＞11.1 mmol/L。入院時(shí)采患者肘靜脈血3 mL，以3 000 r/min 的速率離心20 min，留取下層沉淀細(xì)胞，以2 000 r/min 的速率離心30 min，可見(jiàn)液體分3 層，上、中層交界的白色狹窄帶即為單核細(xì)胞層。留取單個(gè)核細(xì)胞層以1 500 r/min的速率離心10 min，收集細(xì)胞沉淀，再次離心得到單核細(xì)胞。采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)外周血單核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）的NLRP3-mRNA 水平，以2-ΔΔCT值表示進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，試劑盒由北京盛科博源生物科技有限公司提供。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，所有計(jì)量資料做Shapiro-Wilk 正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用%表示，采用χ2檢驗(yàn)；腦梗死患者PBMC中的NLRP3-mRNA表達(dá)對(duì)早期神經(jīng)功能恢復(fù)的影響，采用Logistic回歸分析；PBMC中NLRP3-mRNA 水平與NIHSS 評(píng)分減分情況（入院時(shí)NIHSS 評(píng)分 入院后第1 個(gè)月NIHSS 評(píng)分）的關(guān)系，采用雙變量Pearson 直線相關(guān)性檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能恢復(fù)情況入院后第1個(gè)月70例腦梗死患者梗死后NIHSS 評(píng)分較入院時(shí)降低≥2 分，神經(jīng)功能恢復(fù)率為68.63%（70/102）。

2.2 不同神經(jīng)功能恢復(fù)情況比較2 組患者的性別、年齡、發(fā)病至入院時(shí)間、合并高血壓情況、合并糖尿病情況、神經(jīng)功能缺損分度比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；神經(jīng)功能恢復(fù)患者PBMC 中NLRP3-mRNA 表達(dá)低于未恢復(fù)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 2組一般資料比較 ［n（%）］Table 1 Comparison of general information of two groups［n（%）］

2.3 Logistic 回歸分析以腦梗死患者神經(jīng)功能恢復(fù)情況為因變量，未恢復(fù)賦值為“1”，恢復(fù)賦值為“0”，以患者PBMC 中NLRP3-mRNA 表達(dá)為自變量，Logistic回歸分析顯示，NLRP3-mRNA過(guò)表達(dá)是腦梗死患者早期神經(jīng)功能恢復(fù)不佳的危險(xiǎn)因素（OR＞1，P＜0.05）。相關(guān)參數(shù)見(jiàn)表2。

2.4 雙變量Pearson直線相關(guān)性分析70例腦梗死神經(jīng)功能恢復(fù)患者治療前后NIHSS 評(píng)分差值（5.06±1.43）分，經(jīng)雙變量Pearson 相關(guān)性分析顯示，腦梗死患者PBMC中的NLRP3-mRNA表達(dá)與NIHSS評(píng)分減分情況呈負(fù)相關(guān)（r= 0.703，P＜0.001）。相關(guān)散點(diǎn)圖見(jiàn)圖1。

3 討論

神經(jīng)功能缺損是腦梗死患者的典型表現(xiàn)，若不能及時(shí)改善，則會(huì)導(dǎo)致患者出現(xiàn)偏癱、失語(yǔ)、肢體麻木等后遺癥，嚴(yán)重影響其生活自理能力。因此，促進(jìn)腦梗死患者神經(jīng)功能恢復(fù)對(duì)改善預(yù)后具有重要作用。

本研究102 例腦梗死患者入院后1 個(gè)月的神經(jīng)功能恢復(fù)率為68.63%，可見(jiàn)腦梗死患者住院期間神經(jīng)功能恢復(fù)狀況仍有待改善。局部炎癥反應(yīng)會(huì)影響腦梗死患者神經(jīng)功能缺損的發(fā)生發(fā)展，而相關(guān)報(bào)告指出白介素1β（interleukin 1β，IL-1β）、IL-18等炎癥因子水平與腦梗死患者的神經(jīng)功能缺損程度呈正相關(guān)［9-10］。NLRP3 炎癥小體能促進(jìn)IL-1β、IL-18 的釋放［11-12］。由此推測(cè)NLRP3炎癥小體可經(jīng)促進(jìn)炎癥因子的分泌影響腦梗死患者神經(jīng)功能的恢復(fù)。本研究顯示，腦梗死后神經(jīng)功能恢復(fù)患者PBMC 中的NLRP3-mRNA 水平低于未恢復(fù)患者，提示腦梗死患者的NLRP3 炎癥小體表達(dá)可能會(huì)影響神經(jīng)功能恢復(fù)。據(jù)此進(jìn)一步做Logistic 回歸分析發(fā)現(xiàn)，NLRP3炎癥小體的過(guò)表達(dá)是腦梗死患者早期神經(jīng)功能恢復(fù)不佳的危險(xiǎn)因素。NLRP3炎癥小體能識(shí)別人體內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)，參與信號(hào)傳導(dǎo)，是人體固有免疫的重要組分，而免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)會(huì)促進(jìn)腦缺血時(shí)膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元凋亡［13-14］。因此，NLRP3 炎癥小體呈高表達(dá)的腦梗死患者，其膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元大量損傷、凋亡，神經(jīng)功能缺損也較為嚴(yán)重，致其神經(jīng)功能早期難以有效改善。經(jīng)雙變量Pearson 直線相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，腦梗死患者PBMC 中NLRP3-mRNA 水平與NIHSS 評(píng)分減分情況呈負(fù)相關(guān)。因此，抑制腦梗死患者的NLRP3炎癥小體表達(dá)可能有助于促進(jìn)患者神經(jīng)功能的早期恢復(fù)。

表2 腦梗死患者PBMC中NLRP3-mRNA表達(dá)對(duì)早期神經(jīng)功能恢復(fù)影響的Logistic回歸分析Table 2 Logistic regression analysis of the effect of NLRP3-mRNA expression in PBMC of patients with cerebral infarction on the recovery of early neurological function

圖1 腦梗死PBMC 中NLRP3-mRNA 表達(dá)與NIHSS 評(píng)分減分情況相關(guān)性的散點(diǎn)圖Figure 1 Scatter diagram of the correlation between the expression of NLRP3- mRNA in PBMC of cerebral infarction and the reduction of NIHSS score

相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，腦缺血大鼠發(fā)生腦損傷期間，NLRP3炎癥小體先在小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)激活，而后多數(shù)表達(dá)于神經(jīng)元內(nèi)，也有一部分表達(dá)于微血管內(nèi)皮細(xì)胞中，而通過(guò)靜注免疫球蛋白抑制IL-1β、IL-18的表達(dá)能保護(hù)大鼠的神經(jīng)元，改善腦損傷［15-16］。未來(lái)通過(guò)阻斷NLRP3炎癥小體的激活途徑抑制其表達(dá)可能會(huì)成為治療腦梗死患者并改善其神經(jīng)功能缺損的重要靶點(diǎn)。動(dòng)物體內(nèi)NLRP3炎癥小體的組裝與活化需要核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）轉(zhuǎn)錄出NLRP3-mRNA，故調(diào)控NF-κB 活性可間接影響NLRP3炎癥小體的表達(dá)［17-18］。動(dòng)物體內(nèi)NLRP3炎癥小體的激活途徑還與其他多種因素有關(guān)，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激能誘導(dǎo)NLRP3 炎癥小體激活，這一過(guò)程的關(guān)鍵介質(zhì)為硫氧還蛋白互作蛋白（thioredoxin-interacting protein，TXNIP）［19-20］；氧化應(yīng)激反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致TXNIP 從硫氧還蛋白中解離并與NLRP3 相互作用，進(jìn)而激活NLRP3 炎癥小體［21-22］；溶酶體破裂及自噬也可激活NLRP3 炎癥小體，但這一過(guò)程的信號(hào)通路尚不明確［23］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，姜黃素可通過(guò)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激阻礙NLRP3 炎癥小體激活，進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)，并保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞不受谷氨酸神經(jīng)毒性的損害［24-25］。針對(duì)腦梗死患者的氧化應(yīng)激反應(yīng)，臨床可加用普羅布考、丁苯酞加以抑制［26-27］。此外，NLRP3炎癥小體由NLRP3、ASC和半胱天冬酶-1前體組成，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明傘形酮能抑制NLRP3炎癥小體組分的表達(dá)［28-29］。上述機(jī)制可為抑制人體NLRP3炎癥小體表達(dá)提供思路，進(jìn)而指導(dǎo)未來(lái)藥物的選擇或開(kāi)發(fā)，以達(dá)到早期改善腦梗死患者神經(jīng)功能的目的。

NLRP3 炎癥小體的高表達(dá)不利于腦梗死患者的早期神經(jīng)功能恢復(fù)，而NLRP3 炎癥小體水平愈低，則患者早期神經(jīng)功能恢復(fù)愈明顯，臨床可通過(guò)阻斷激活途徑與抑制組分表達(dá)的方式抑制NLRP3炎癥小體表達(dá)，進(jìn)而提高腦梗死患者神經(jīng)功能恢復(fù)。