慢病毒載體凍干制劑的制備與穩(wěn)定性研究

沈鴻偉, 李明昊, 徐 南, 邵佳琪, 王 鏡, 俞 磊

（華東師范大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院，上海 200062）

0 引 言

慢病毒載體(Lentiviral Vector, LV)是以人類免疫缺陷型病毒(HIV)為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的基因治療載體, 對(duì)分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力, 并可以在體內(nèi)長(zhǎng)期穩(wěn)定地表達(dá)[1]. 目前腫瘤免疫治療兩大主流的過(guò)繼性細(xì)胞療法包括T細(xì)胞受體(T Cell Receptor, TCR)?T 細(xì)胞和嵌合抗原受體(Chimeric Antigen Receptor, CAR)?T細(xì)胞療法, 其中LV已被廣泛應(yīng)用[2?3]. CAR?T細(xì)胞生產(chǎn)環(huán)節(jié)中包括以攜帶目的基因的慢病毒載體感染T細(xì)胞, 其中慢病毒的滴度對(duì)感染是否成功非常關(guān)鍵. 由于慢病毒載體實(shí)質(zhì)是由蛋白質(zhì)和核酸組成, 這就導(dǎo)致了其儲(chǔ)存條件的局限性[4]. 通常, 慢病毒載體無(wú)法在常溫及4 ℃冷藏的條件下長(zhǎng)時(shí)間保存, 其熱穩(wěn)定性較差, 同時(shí)反復(fù)凍融會(huì)降低其滴度, 甚至形成不同程度的降解物. 目前并沒(méi)有理想的慢病毒載體凍存保護(hù)液, 這就導(dǎo)致常規(guī)的–80 ℃條件冷凍保存或者加入甘油保護(hù)劑也不能有效防止慢病毒載體在儲(chǔ)存過(guò)程中滴度的降低[5?6]. 此外, 慢病毒載體在遠(yuǎn)距離運(yùn)輸時(shí), 需要采取冷鏈運(yùn)輸?shù)姆绞? 增加了運(yùn)輸成本; 即便使用較大量的干冰保護(hù), 也有可能由于溫度變化導(dǎo)致活性降低, 無(wú)法規(guī)避運(yùn)輸過(guò)程中帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn).

冷凍干燥(Freeze?drying或Lyophilization), 全稱真空冷凍干燥, 簡(jiǎn)稱凍干, 是在低溫減壓的條件下利用水的升華性能, 使藥物低溫脫水而達(dá)到干燥目的的一種技術(shù)[7]. 由于真空冷凍干燥技術(shù)在低溫、低氧環(huán)境下進(jìn)行, 大多數(shù)生物反應(yīng)停滯, 且處理過(guò)程無(wú)液態(tài)水存在, 水分以固體狀態(tài)直接升華, 使物料原有結(jié)構(gòu)和形狀得到最大程度的保護(hù), 最終獲得外觀和內(nèi)在品質(zhì)兼?zhèn)涞膬?yōu)質(zhì)干燥制品[8]. 通過(guò)真空冷凍干燥方法制備得到的粉體硬團(tuán)聚少、粒徑小且均勻, 已經(jīng)發(fā)展成為制備生物制品(尤其是蛋白多肽類)粉針劑的一種重要方法[9?11].

目前國(guó)內(nèi)外的專家學(xué)者對(duì)于慢病毒載體保存方法的研究少之又少. 有些學(xué)者對(duì)于慢病毒載體保存方法的研究主要為凍存保護(hù)液的處方優(yōu)化, 欲通過(guò)添加適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)劑或者改變緩沖體系增強(qiáng)其凍存穩(wěn)定性的效果[12?14]. 對(duì)于慢病毒載體凍干制劑鮮有研究, 且未取得良好的效果[15]. 針對(duì)這一研究現(xiàn)狀,本文以解決慢病毒載體儲(chǔ)存及運(yùn)輸穩(wěn)定性的問(wèn)題為目的, 提出以下研究思路.

本文旨在利用真空冷凍干燥的方法, 結(jié)合生物制品的保存技術(shù), 選取慢病毒載體來(lái)探索出適合病毒類載體儲(chǔ)存的新劑型, 同時(shí)制備得到新型的慢病毒載體凍干制劑, 通過(guò)篩選慢病毒載體凍干保護(hù)劑處方, 并以正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(DOE)的方法進(jìn)行處方優(yōu)化, 制備得到外觀良好、生物滴度高的慢病毒載體凍干制劑, 使得該制劑在常溫下具有較長(zhǎng)的保質(zhì)期, 并且能夠在高溫高濕的條件下依然保持較高的生物活性.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

75 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶, 24孔細(xì)胞培養(yǎng)皿(Corning公司); Labconco Freezone?真空冷凍干燥機(jī)(美國(guó)Labconco公司); HR40?IIA2型生物安全柜(海爾公司), CCL?170B?8型二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(ESCO公司),蠕動(dòng)泵(Thermo公司); AX224ZH/E型電子天平(奧豪斯公司); S470?K型pH計(jì)(梅特勒?托利多國(guó)際貿(mào)易有限公司); Attune NXT型流式細(xì)胞儀(Life Technologies公司); 100 kd超濾管, 0.22 μm濾膜(Millipore公司).

海藻糖(分析純, Pfanstiehl公司); DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清FBS購(gòu)自美國(guó)Gibco公司; 氫氧化鈉、蔗糖購(gòu)自Sigma公司; PBS購(gòu)自Corning公司; 二水氯化鈣、無(wú)水硫酸鎂、精氨酸、甘油、甘露醇、明膠、PEG6000購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司; 人血白蛋白; 右旋糖酐葡萄糖注射液;L?組氨酸、L?丙氨酸、甘氨酸購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán); 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水購(gòu)自廈門(mén)鱟試劑生物科技股份有限公司; QPCR基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 ssCART?19質(zhì)粒的構(gòu)建與抽提

對(duì)本實(shí)驗(yàn)所用的目的質(zhì)粒ssCART?19進(jìn)行構(gòu)建及抽提. 目的質(zhì)粒構(gòu)建主要為將目的基因與工具載體進(jìn)行重組、轉(zhuǎn)化挑取多個(gè)單克隆, 搖菌并小抽進(jìn)行酶切鑒定, 選擇一個(gè)酶切鑒定正確的單克隆進(jìn)行抽提, 得到含有anti?CD19基因的目的質(zhì)粒. 質(zhì)粒抽提主要使用中抽試劑盒, 通過(guò)對(duì)大腸桿菌的培養(yǎng)得到帶有目的基因的質(zhì)粒的菌液, 通過(guò)收集菌液、裂解中和、分離醇沉得到目的質(zhì)粒.

1.2.2 LV1819慢病毒載體的包裝與濃縮液制備

本實(shí)驗(yàn)中采用磷酸鈣?DNA共沉淀法制備LV1819慢病毒載體[14], 具體制備過(guò)程如下.

使用75 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶進(jìn)行293T細(xì)胞貼壁培養(yǎng), 待細(xì)胞狀態(tài)良好、細(xì)胞密度為70%～80%時(shí)采用四質(zhì)粒系統(tǒng)進(jìn)行293 T細(xì)胞轉(zhuǎn)染. 轉(zhuǎn)染后6 h進(jìn)行換液, 24 h后進(jìn)行補(bǔ)液, 48 h后收集病毒上清, 然后進(jìn)行澄清過(guò)濾, 過(guò)濾后使用小膜包進(jìn)行濃縮, 濃縮50倍得到慢病毒載體濃縮液. 在處方篩選與優(yōu)化實(shí)驗(yàn)過(guò)程中, 由于處方設(shè)計(jì)組數(shù)較多, 故在得到病毒上清澄清過(guò)濾后, 采用超濾的方法進(jìn)行濃縮, 將各組凍干保護(hù)劑置換原有的培養(yǎng)基得到濃縮液.

1.2.3 LV1819慢病毒載體凍干制劑制備

配制慢病毒載體凍干保護(hù)劑溶液, 將凍干保護(hù)劑處方中的各組分按照比例的含量稱取后溶解在PBS緩沖溶液中, 用1 mol/L PB調(diào)節(jié)混合溶液的pH值至7.4. 將配制好的凍干保護(hù)劑溶液按照凍干保護(hù)劑: 慢病毒載體濃縮液為3∶2的體積比加入濃縮液中, 混合均勻后分裝置于4 ℃保存. 采用傳統(tǒng)的真空冷凍干燥方法, 先將制品放置于–80 ℃超低溫保存冰箱預(yù)凍2 ～ 3 h, 使制品呈固狀, 擴(kuò)大表面積. 從冰箱中取出制品迅速置于真空冷凍干燥機(jī)的外掛瓶中, 等待真空度降至0.12 mbar以下, 冷阱溫度低于–45 ℃為佳. 在此條件下冷凍干燥約48 h, 得到慢病毒載體凍干制劑.

1.2.4 慢病毒載體凍干制劑預(yù)處方可行性研究

考察對(duì)慢病毒載體凍干制劑預(yù)處方的研究, 探索慢病毒載體凍干制劑制備的可行性. 通過(guò)設(shè)置對(duì)照組為HBSS, 實(shí)驗(yàn)組為預(yù)處方, 具體的凍干保護(hù)劑預(yù)處方各組分及其配方比如下: 1.0%甘油、20 mg/mL蔗糖、25 mg/mL甘露醇、1 mg/mL L?精氨酸、2 mg/mL甘氨酸、2% PEG6000、1.5%明膠, 加入磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中, 待保護(hù)劑充分溶解后, 用1 mol/L PB調(diào)節(jié)凍干保護(hù)劑預(yù)處方溶液的pH值至7.4.

1.2.5 慢病毒載體凍干保護(hù)劑處方的篩選

通過(guò)對(duì)慢病毒載體凍干保護(hù)劑5組處方的篩選, 從菌種凍干、脂質(zhì)體凍干、蛋白質(zhì)凍干(包括減毒活疫苗類)、其他病毒類凍干(腺病毒等)選定了5組基本的凍干保護(hù)劑處方, Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組分別通過(guò)QPCR的方法檢測(cè)得到生物滴度[15?21].

初選5組處方, 各組處方組成如表1所示, 其中I組為對(duì)照組, 不加任何凍干保護(hù)劑作為陰性對(duì)照. 按照上述各組凍干保護(hù)劑分組的配方比要求, 加入磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中, 待保護(hù)劑充分溶解后, 用孔徑為0.22 μm的濾膜過(guò)濾除菌.

表 1 不同凍干保護(hù)劑的效果Tab. 1 Effects of different lyophilized protectants

1.2.6 慢病毒載體凍干保護(hù)劑處方的優(yōu)化及用量的確定

以慢病毒載體的QPCR滴度回收率為考察指標(biāo), 以海藻糖用量及L?丙氨酸用量、L?組氨酸用量、CaCl2用量和MgSO4用量5個(gè)因素為考察因素, 用來(lái)確定凍干保護(hù)劑處方中有效成分的最佳用量, 采用正交實(shí)驗(yàn)(DOE)的方法對(duì)慢病毒載體凍干保護(hù)劑處方(Ⅱ組)進(jìn)行優(yōu)化, 實(shí)驗(yàn)因素如表2所示, 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表3所示(實(shí)驗(yàn)過(guò)程中用量為配制50 mL凍干保護(hù)劑溶液體系所需要的量).

表 2 正交實(shí)驗(yàn)因素水平Tab. 2 Factor level of orthogonal experiment

表 3 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表Tab. 3 Orthogonal experimental design table

1.2.7 慢病毒載體生物滴度的檢測(cè)方法

用實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)(QPCR)方法進(jìn)行慢病毒生物滴度測(cè)定[13,22]: 在24孔板上每孔加入293 T細(xì)胞懸液400 μL, 細(xì)胞密度為1.0 × 105個(gè)/mL. 以慢病毒載體濃縮液的滴度值為參照,10倍稀釋樣品. 取慢病毒載體凍干制劑加入500 μL細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水復(fù)溶, 待溶解完全后加入完全培養(yǎng)基進(jìn)行10倍稀釋, 輕柔吹打均勻后分別取100 μL、50 μL、25 μL慢病毒載體稀釋液至3個(gè)復(fù)孔中. 將孔板放置于37 ℃、5% CO2濃度的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h. 取出感染后的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞換液,繼續(xù)培養(yǎng)48 h后檢測(cè). 將24孔板每個(gè)孔中的培養(yǎng)上清棄去, 加入800 μL PBS吹打細(xì)胞, 將細(xì)胞從孔板中取下, 置于1.5 mL 離心管中, 3 000 r/min離心5 min后, 棄去上清收集沉淀. 使用試劑盒提取細(xì)胞基因組DNA. 配制實(shí)時(shí)定量QPCR反應(yīng)體系, 設(shè)置QPCR擴(kuò)增程序?yàn)閮刹椒? 預(yù)變性95 ℃、15 s;然后進(jìn)行變性95 ℃、15 s, 退火延伸60 ℃、36 s的40個(gè)循環(huán).

用流式細(xì)胞術(shù)(FACS)方法進(jìn)行慢病毒生物滴度測(cè)定: 細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程同上述方法, 但在加入慢病毒載體時(shí), 輕柔吹打均勻后分別取100 μL、50 μL、25 μL、12.5 μL慢病毒載體稀釋液至4個(gè)復(fù)孔中.將孔板放置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h. 第二天細(xì)胞補(bǔ)液, 繼續(xù)培養(yǎng)24 h. 后續(xù)操作同QPCR方法, 至檢測(cè)前棄去上清收集沉淀, 加入protein L抗體進(jìn)行避光孵育45 min. 待孵育結(jié)束, 加入PBS洗滌兩遍后, 使用流式細(xì)胞儀檢測(cè).

1.2.8 慢病毒載體凍干制劑殘余水分含量測(cè)定

通過(guò)卡爾費(fèi)休水分測(cè)定法, 檢測(cè)慢病毒載體凍干制劑中的殘余水分含量. 由于慢病毒載體凍干粉末吸濕性強(qiáng), 按照《中國(guó)藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范(2010年版)》卡爾費(fèi)休水分測(cè)定法測(cè)定凍干慢病毒載體含水量[23].

1.2.9 慢病毒載體凍干制劑影響因素穩(wěn)定性考察

考察了儲(chǔ)存溫度對(duì)慢病毒載體凍干制劑穩(wěn)定性的影響. 分別取適量慢病毒載體凍干制劑, 置于–20 ℃、23 ℃、4 ℃的3個(gè)不同儲(chǔ)存溫度條件下, 于第1、3、5、7、14、21、30天考察慢病毒載體凍干制劑的外觀、色澤、復(fù)溶性(再分散時(shí)間)和生物滴度.

1.2.10 慢病毒載體凍干制劑高溫加速實(shí)驗(yàn)

為了研究慢病毒載體凍干制劑與現(xiàn)有工藝(液體制劑–80 ℃保存)的質(zhì)量比較, 我們選擇了高溫加速實(shí)驗(yàn), 根據(jù)《中國(guó)藥典(2015年版)》“穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)原則”, 選擇了一個(gè)高溫加速實(shí)驗(yàn)溫度(42 ℃),另一個(gè)選擇了上述指導(dǎo)原則規(guī)定的低溫保存生物制品的加速實(shí)驗(yàn)溫度(4 ℃), 具體穩(wěn)定性研究方案如下[24].

分別將慢病毒載體凍干制劑置于42 ℃和4 ℃的溫度條件下, 貯藏1 ～ 30 d, 比較其生物滴度的變化. 于第1、3、5、7、14、21、30天考察慢病毒載體凍干制劑的外觀、色澤、復(fù)溶性(再分散時(shí)間)和生物滴度. 并以4 ℃溫度條件下的慢病毒載體凍干制劑做對(duì)比.

1.2.11 慢病毒載體凍干制劑反復(fù)凍融實(shí)驗(yàn)

將慢病毒載體凍干制劑與現(xiàn)有的凍存制劑進(jìn)行對(duì)比, 考察反復(fù)凍融對(duì)不同制劑的影響. 反復(fù)凍融即反復(fù)冷凍–解凍循環(huán), 將慢病毒凍干制劑與慢病毒凍存制品均置于–80 ℃超低溫冰箱保存, 每隔一段時(shí)間置于室溫條件下融化考察慢病毒載體凍干制劑的外觀、色澤、復(fù)溶性(再分散時(shí)間)和生物滴度. 共反復(fù)凍融6次.

1.2.12 數(shù)據(jù)分析方法

使用Minitab 19軟件對(duì)正交實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析與處理, 通過(guò)方差分析考察各個(gè)因素的主效應(yīng)及交互作用以及正態(tài)概率, 擬合回歸模型, 對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多響應(yīng)預(yù)測(cè).

使用GraphPad Prism軟件以及Adobe Illustrator軟件進(jìn)行圖表統(tǒng)計(jì)與分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 慢病毒載體凍干制劑制備可行性研究

2.1.1 理化性質(zhì)評(píng)價(jià)

采用凍干保護(hù)劑預(yù)處方進(jìn)行慢病毒載體凍干制劑可行性探究, 并制備得到外觀良好的慢病毒載體凍干制劑, 外觀、色澤度、復(fù)溶性(再分散時(shí)間)等理化性質(zhì)指標(biāo)如表4所示.

表 4 慢病毒凍干制劑的理化性質(zhì)評(píng)價(jià)Tab. 4 Evaluation of physical and chemical properties of the freeze-drying preparation technique

2.1.2 生物滴度考察及回收率測(cè)定

使用流式細(xì)胞術(shù)(FACS)和實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)(QPCR)的方法考察慢病毒載體的生物滴度, 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示.

圖 1 慢病毒載體凍干前后滴度值與回收率Fig. 1 Titer value and recovery rate of lentiviral vector before and after freeze?drying

比較凍干保護(hù)劑與HBSS對(duì)于慢病毒載體在–80 ℃保存以及在凍干的過(guò)程中的影響, 同時(shí)對(duì)比凍存前后以及凍干前后對(duì)慢病毒滴度的影響. 其中Dd組最后沒(méi)有測(cè)到數(shù)據(jù), 說(shuō)明在凍干的過(guò)程中,HBSS沒(méi)有起到對(duì)慢病毒的保護(hù)作用, 導(dǎo)致慢病毒全部損失. 在凍干的過(guò)程中, 凍干保護(hù)劑確實(shí)能夠起到保護(hù)作用, 最終兩種檢測(cè)方法均測(cè)得滴度回收率. 通過(guò)這兩種檢測(cè)方法可以看出慢病毒載體凍干制劑制備的可行性, 即慢病毒載體可以通過(guò)真空冷凍干燥的方法進(jìn)行制備得到慢病毒凍干粉.

2.2 慢病毒載體凍干保護(hù)劑處方的篩選

2.2.1 不同凍干保護(hù)劑對(duì)理化性質(zhì)的影響

采用5組處方進(jìn)行慢病毒載體凍干保護(hù)劑處方篩選, 以凍干產(chǎn)品的外觀、色澤和復(fù)溶性為指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)其理化性質(zhì), 考察了各種凍干保護(hù)劑對(duì)凍干產(chǎn)品的保護(hù)作用, 結(jié)果見(jiàn)表5.

2.2.2 不同凍干保護(hù)劑對(duì)滴度回收率的影響

篩選5組凍干保護(hù)劑處方的慢病毒載體滴度回收率結(jié)果如圖2所示.

表 5 不同凍干保護(hù)劑的效果Tab. 5 Effects of different lyophilized protectants

圖 2 慢病毒載體凍干制劑與凍存液滴度回收率Fig. 2 Recovery of the lyophilized lentiviral vector and cryopreservation titer

從圖2(a)中可以看出, Ⅱ組的凍干保護(hù)劑處方保護(hù)效果最佳, 加入Ⅱ組的凍干保護(hù)劑處方后制備得到的慢病毒載體凍干制劑, 感染細(xì)胞后通過(guò)QPCR的方法檢測(cè)得到的滴度值最高; 圖2(b)顯示,Ⅱ組慢病毒載體的滴度回收率最佳, 兩圖相符合, 無(wú)論在冷凍保存條件下還是在真空冷凍干燥后,Ⅱ組的凍干保護(hù)劑的效果均最好, 所以選擇II組保護(hù)劑進(jìn)行優(yōu)化并確定用量.

2.2.3 凍干保護(hù)劑的選擇

主要可分為以下幾類: 一般為多羥基化合物、糖類、氨基酸、蛋白質(zhì)、聚合物和無(wú)機(jī)鹽等化合物[25?27].因?yàn)椴坏哂斜Ｗo(hù)生物制品活性的效果和結(jié)構(gòu)不發(fā)生改變, 而且要具有凍干賦形作用. 糖是一種使用最廣泛的凍干保護(hù)劑, 本研究中采用的海藻糖屬于二糖, 比蔗糖具有更低的吸濕性和更高的玻璃態(tài)轉(zhuǎn)化溫度, 其羥基能替代水分子與蛋白質(zhì)分子表面部分結(jié)合, 而且海藻糖分子較小, 能填充到蛋白質(zhì)分子的空隙中, 有效地限制蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化, 在凍干時(shí)可以對(duì)慢病毒的蛋白衣殼形成保護(hù), 因此凍干制劑保護(hù)效果更好[28?29]. 氨基酸具有酸性羧基和堿性氨基, 能夠調(diào)節(jié)制品溶劑環(huán)境的pH值, 不同類別的氨基酸具有不同的親水性功能, 而親水性強(qiáng)的氨基酸較易與蛋白質(zhì)產(chǎn)生氫鍵, 這對(duì)蛋白質(zhì)在凍干的過(guò)程中的穩(wěn)定性和活性具有重要的保護(hù)作用, 如組氨酸、丙氨酸等, 可以增加慢病毒載體包膜蛋白和組氨酸磷酸鹽緩沖液間的張力, 提高慢病毒載體包膜蛋白水化水平. 而加入二價(jià)陽(yáng)離子類, 如CaCl2和MgSO4這兩種無(wú)機(jī)鹽, 可延遲海藻糖結(jié)晶, 通過(guò)和磷酸根陰離子存在下氫鍵網(wǎng)絡(luò)以及分子遷移率的變化抑制結(jié)晶.

2.3 慢病毒載體凍干保護(hù)劑處方的優(yōu)化并確定用量

2.3.1 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

將通過(guò)QPCR的方法檢測(cè)生物滴度的結(jié)果作為正交實(shí)驗(yàn)的響應(yīng)值, 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表如表6所示.

表 6 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表Tab. 6 Results of orthogonal experiment

2.3.2 方差分析表

結(jié)果詳見(jiàn)表7.

2.3.3 回歸擬合模型

結(jié)果詳見(jiàn)表8.

2.3.4 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化

結(jié)果詳見(jiàn)圖3.

由以上的方差分析結(jié)果及圖3(a)–(c)圖, 可以看出, 該組處方中所有的組分均具有顯著效應(yīng)(P＜0.05), 從側(cè)面印證了該組凍干保護(hù)劑處方的有效性. 從圖3(a)中可以看出, 除L?丙氨酸和CaCl2以外, 其余組分因子均表現(xiàn)出正效應(yīng)較強(qiáng); 從圖3(b)中可以發(fā)現(xiàn)生物滴度的結(jié)果正態(tài)概率分布良好, 觀測(cè)值順序與運(yùn)行順序無(wú)關(guān); 從圖3(c)中明顯看出高于2.57標(biāo)準(zhǔn)線的因子項(xiàng), 表現(xiàn)出顯著效應(yīng);從圖3(d)中可以看出處方中的相關(guān)組分之間均存在交互作用, 海藻糖與處方中其余組分間的交互作用較強(qiáng). 圖3(e)和圖3(f)兩圖顯示正態(tài)概率分布良好, 滿足實(shí)驗(yàn)要求. 圖3(g)顯示凍干保護(hù)劑處方各組分含量的最優(yōu)的范圍; 圖3(h)通過(guò)響應(yīng)器優(yōu)化, 得出凍干保護(hù)劑處方用量最優(yōu)的一組解.

2.3.5 多響應(yīng)預(yù)測(cè)結(jié)果

結(jié)果如表9所示.

表 7 正交實(shí)驗(yàn)方差分析表Tab. 7 Analysis of variance of orthogonal experiment

表 8 回歸擬合模型匯總表Tab. 8 Summary table of regression fitting model

根據(jù)多響應(yīng)預(yù)測(cè)結(jié)果, 確定最優(yōu)的凍干保護(hù)劑處方為15 g海藻糖、8.9 mg L?丙氨酸、15.5 mg L?組氨酸、1.0 mg CaCl2、0.76 mg MgSO4. 并根據(jù)這一處方要求的用量進(jìn)行了處方驗(yàn)證實(shí)驗(yàn), 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 在這一組凍干保護(hù)劑處方的條件下, 慢病毒載體的生物滴度可高達(dá)9.37 × 107IU/mL, 滴度回收率為50.15%. 凍干效果良好.

2.4 慢病毒載體凍干制劑殘余水分含量的測(cè)定

通過(guò)慢病毒載體凍干保護(hù)劑處方的篩選與優(yōu)化, 確定了最優(yōu)的一組凍干保護(hù)劑處方, 并通過(guò)3次驗(yàn)證確定了該處方對(duì)于慢病毒載體凍干的過(guò)程中保護(hù)效果. 使用驗(yàn)證過(guò)程中制備的慢病毒載體凍干制劑, 檢測(cè)殘余水分含量, 水分含量為(7 ± 0.05)%. 該結(jié)果滿足要求, 表明在此含水量條件下慢病毒載體凍干制劑最為穩(wěn)定. 凍干后水分含量直接影響了慢病毒載體的狀態(tài)和穩(wěn)定性, 維持較低的水分含量, 病毒才能維持休眠狀態(tài), 但水分含量低于0.5%時(shí)可能會(huì)引起凍干的過(guò)程中DNA鏈的斷裂導(dǎo)致病毒的活性降低甚至死亡.

圖 3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析圖Fig. 3 Analysis diagram of orthogonal experiment results

表 9 多響應(yīng)預(yù)測(cè)結(jié)果Tab. 9 Results of multiple response prediction

主要考察慢病毒凍干制劑的外觀、色澤、復(fù)溶性以及生物活性. 其中外觀是凍干制品的重要質(zhì)量屬性之一, 合格的凍干制品外觀應(yīng)是疏松多孔、色澤均勻、質(zhì)地細(xì)膩的粉末狀固體. 同時(shí)考察凍干制劑的穩(wěn)定性. 慢病毒載體的初步穩(wěn)定性主要考察 –20 ℃(相對(duì)濕度75%)、23 ℃(相對(duì)濕度75%)、2 ～ 8 ℃長(zhǎng)期保存條件以及42 ℃高溫加速實(shí)驗(yàn).

2.5.1 影響因素穩(wěn)定性研究

2.5.1.1 高溫加速實(shí)驗(yàn)對(duì)慢病毒凍干制劑穩(wěn)定性的影響

采用最優(yōu)的凍干保護(hù)劑處方制備得到外觀良好的慢病毒載體凍干制劑, 進(jìn)行凍干制劑穩(wěn)定性研究, 考察外觀、色澤度、復(fù)溶性(再分散時(shí)間)等理化性質(zhì)指標(biāo). 不同溫度對(duì)于慢病毒載體凍干制劑的儲(chǔ)存影響不大, 觀察4 ℃、–20 ℃以及23 ℃條件下的慢病毒載體凍干制劑, 可以看出隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng), 外觀與色澤度均未發(fā)生明顯改變, 疏松并呈蜂窩狀, 橙紅色, 加水復(fù)溶后狀態(tài)良好, 考察再分散時(shí)間均在30 s以內(nèi). 但是高溫保存慢病毒載體凍干制劑, 外觀與色澤度較差, 結(jié)果如表10所示.

表 10 高溫加速實(shí)驗(yàn)(42 ℃)條件下慢病毒凍干制劑的保存效果Tab. 10 Preservation effects of freeze-drying preparations at 42 ℃

2.5.1.2 不同溫度對(duì)慢病毒凍干制劑穩(wěn)定性的影響

使用QPCR檢測(cè)慢病毒載體凍干制劑和凍存制品的生物滴度(IU/mL), 對(duì)生物滴度值取lg對(duì)數(shù)函數(shù), 以lgT對(duì)時(shí)間t做圖, 結(jié)果可參見(jiàn)圖4.

由圖4可以看出, 不同溫度對(duì)于慢病毒載體凍干制劑和凍存樣品均有顯著的影響. 圖4(a)為4 ℃冷藏保存后慢病毒載體滴度結(jié)果, 由圖中的結(jié)果可以看出慢病毒載體凍干制劑有更好的保存效果, 隨著時(shí)間的增加, 滴度雖有下降但比較穩(wěn)定, 冷凍干燥前的樣品置于4 ℃冷藏保存后滴度下降明顯; 從圖4(b)可以看出, 在–20 ℃條件下保存, 無(wú)論是慢病毒載體凍干還是凍存樣品, 均比較穩(wěn)定; 從圖4(c)中發(fā)現(xiàn), 室溫條件對(duì)于慢病毒載體凍干制劑的保存效果更好; 圖4(d)為高溫加速穩(wěn)定性的結(jié)果, 高溫高濕的條件對(duì)于慢病毒凍干制劑和凍存制劑都產(chǎn)生了嚴(yán)重的不穩(wěn)定的影響, 對(duì)于慢病毒本身產(chǎn)生了極大的負(fù)面效應(yīng).

圖 4 不同溫度條件下滴度對(duì)數(shù)值結(jié)果Fig. 4 Titer log results at different temperatures

結(jié)果表明, 慢病毒載體在冷凍干燥以后可以實(shí)現(xiàn)較長(zhǎng)時(shí)間的保存, 但是生物滴度值會(huì)下降, 說(shuō)明在儲(chǔ)存時(shí)也會(huì)緩慢失活, 不同溫度下的降解速度大小為23 ℃ ＞ 4 ℃ ＞ –20 ℃. 但是在4 ℃保存的條件下慢病毒載體凍干制劑能更穩(wěn)定, 凸顯了其儲(chǔ)存優(yōu)勢(shì).

2.5.2 反復(fù)凍融穩(wěn)定性研究

2.5.2.1 反復(fù)凍融對(duì)慢病毒凍干制劑理化性質(zhì)的影響

采用最優(yōu)的凍干保護(hù)劑處方制備得到外觀良好的慢病毒載體凍干制劑, 進(jìn)行凍干制劑穩(wěn)定性研究, 考察外觀、色澤度、復(fù)溶性(再分散時(shí)間)等理化性質(zhì)指標(biāo)如表11所示.

表 11 反復(fù)凍融對(duì)慢病毒凍干制劑保存效果的影響Tab. 11 Effects of repeated freeze-thaw cycles on the preservation of freeze-drying preparations

2.5.2.2 反復(fù)凍融對(duì)慢病毒凍干制劑生物滴度的影響

使用QPCR檢測(cè)慢病毒載體凍干制劑和凍存制品的生物滴度(IU/mL), 結(jié)果可參見(jiàn)圖5.

圖 5 反復(fù)凍融對(duì)于慢病毒滴度的影響Fig. 5 Effects of repeated freezing?thawing cycles on the titer of lentiviral vectors

從圖5可以看出反復(fù)凍融對(duì)于慢病毒載體凍干制劑的影響并不明顯, 隨著反復(fù)凍融次數(shù)的增加,慢病毒滴度能維持穩(wěn)定, 然而對(duì)于慢病毒載體凍存制劑而言, 反復(fù)凍融的影響顯著, 尤其在第5次反復(fù)凍融時(shí), 慢病毒活性顯著降低, 表明慢病毒凍干制劑在反復(fù)凍融的條件下更加穩(wěn)定, 可以實(shí)現(xiàn)反復(fù)凍融5–6次, 克服了液體制劑反復(fù)凍融帶來(lái)的損失等問(wèn)題.

3 結(jié) 論

本文給出了一種新型的慢病毒載體凍干制劑的制備方法. 通過(guò)研究?jī)龈杀Ｗo(hù)劑的組分篩選與優(yōu)化、凍干產(chǎn)品的制劑學(xué)研究和穩(wěn)定性研究, 表明真空冷凍干燥的方法對(duì)于慢病毒載體的儲(chǔ)存帶來(lái)了新的突破. 在最優(yōu)凍干保護(hù)劑處方的條件下, 慢病毒載體凍干制劑能夠?qū)崿F(xiàn)儲(chǔ)存時(shí)間長(zhǎng)、運(yùn)輸過(guò)程簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性提高的優(yōu)點(diǎn), 為CAR?T細(xì)胞的大批量制備夯實(shí)了基礎(chǔ), 為CAR?T細(xì)胞免疫治療的進(jìn)一步推廣提供了技術(shù)基礎(chǔ).