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    lncRNA TDRG1通過調(diào)節(jié)miR-101-3p促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移*

    2021-06-02 11:55:36王帥奇張壽儒陳利輝陳秀峰
    中國病理生理雜志 2021年5期
    關(guān)鍵詞:螢光靶點抑制劑

    王帥奇,孫 浩,張壽儒,陳利輝,陳秀峰,李 衛(wèi)

    (重慶大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院胃腸腫瘤中心,重慶400030)

    結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)是全球發(fā)病率最高的腫瘤之一,每年有近160萬例新發(fā)CRC病例[1]。CRC的存活率約為58%,并且一旦CRC進(jìn)入晚期,手術(shù)切除是無用的,患者的預(yù)后極差[2]。盡管一些研究已經(jīng)確定了許多與腫瘤發(fā)生有關(guān)的基因,但這些過程的分子機(jī)制尚不清楚[3-4]。因此,迫切需要進(jìn)一步研究CRC發(fā)生發(fā)展的機(jī)制,尋找具有預(yù)后和治療價值的新的治療靶點。越來越多的研究表明,長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNA)在腫瘤的發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用,包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和轉(zhuǎn)移[5-6]。最近的報告發(fā)現(xiàn)一些lncRNA在CRC的發(fā)展中起作用[7]。睪丸發(fā)育相關(guān)基因1(testicular development-related gene 1,TDRG1)是一種新發(fā)現(xiàn)的lncRNA,在多種腫瘤包括肺腺癌、甲狀腺乳頭狀癌、宮頸癌和食管鱗狀細(xì)胞癌中起原癌基因的作用[8-9]。然而,TDRG1在CRC中的作用尚未闡明。在本研究中,我們檢測了CRC組織和正常組織中TDRG1的表達(dá),并通過構(gòu)建敲減TDRG1表達(dá)的CRC細(xì)胞模型,揭示TDRG1調(diào)節(jié)CRC細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的機(jī)制。

    材料和方法

    1 臨床組織標(biāo)本

    于2016年5月~2018年8月,在重慶大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院共收集40對CRC組織及相應(yīng)的癌旁組織。標(biāo)本冷凍保存在-80℃。

    2 方法

    2.1 細(xì)胞培養(yǎng)人正常結(jié)腸上皮NCM460細(xì)胞及CRC細(xì)胞系HT-29、SW480和LoVo購自ATCC。細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清(FBS)和1%青霉素/鏈霉素的McCoy′s 5A和高糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco)中。

    2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司合成了抗TDRG1(sh-TDRG1)和非靶向?qū)φ眨╯h-NC)的慢病毒短發(fā)夾RNA(shRNA),miR-101-3p模擬物(pre-miR-101-3p)和miR-101-3p阻遏物(antimiR-101-3p)及其各自的非靶向序列(pre-NC或anti-NC)。使用Lipofectamine 3000試劑(Life Technologies)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。通過qPCR檢測細(xì)胞過度表達(dá)和沉默的效率。

    2.3 RT-qPCR實驗使用Trizol試劑(Invitrogen)從細(xì)胞或組織中分離總RNA,并使用PrimeScript RT試劑盒(TaKaRa)將RNA反向轉(zhuǎn)錄成cDNA。RT-qPCR分析采用SYBR Green PCR試劑盒(TaKaRa)進(jìn)行。U6用于標(biāo)準(zhǔn)化miR-101-3p的相對表達(dá),和β-actin用于標(biāo)準(zhǔn)化TDRG1的相對表達(dá)。采用2-ΔΔCt法計算相對表達(dá)。TDRG1的正向引物序列為5′-CGGGAACAAGCCCTGTG-3′,反 向 引 物 序 列 為5′-CCGGCCCAAAGATGATG-3′;miR-101-3p的正向引物序列為5′-TGCACCTAAAAGGAG-3′,反向引物序列為5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′;U6的正向引物序列為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,反向引物序列為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′;β-actin的正向引物序列為5′-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3′,反向引物序列為5′-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3′。

    2.4 CCK-8法檢測細(xì)胞活力細(xì)胞以每孔2.5×103個細(xì)胞的密度接種于96孔板中,培養(yǎng)24、48、72和96 h后,在每個孔中加入10μL CCK-8分析劑(Dojindo)。繼續(xù)培養(yǎng)2 h后,以0.1%的最終濃度加入DMSO,使用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測溶液的吸光度(A)值。

    2.5 集落形成實驗將細(xì)胞以每孔1×103接種在6孔板中,并加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染2周后,用甲醇固定細(xì)胞,用0.1%結(jié)晶紫(Sigma)染色。在顯微鏡下計算可見集落數(shù)。

    2.6 Transwell測定在遷移實驗中,將細(xì)胞以每孔1×105的密度接種到24孔Transwell小室中,在上腔室中加入無血清培養(yǎng)基,在下腔室中加入完全培養(yǎng)基。孵育24 h后,將細(xì)胞用含有0.1%結(jié)晶紫的染料溶液染色。之后,使用顯微鏡拍攝照片,并從6個視野中隨機(jī)計數(shù)細(xì)胞。對于侵襲實驗,使用預(yù)先涂有BD BioCoat Matrigel的Transwell室(BD Biosciences)檢測細(xì)胞侵襲能力,其余步驟與細(xì)胞遷移測試相同。

    2.7 雙螢光素酶報告基因檢測通過雙重螢光素酶報告基因確認(rèn)TDRG1和miR-101-3p之間關(guān)系。用PCR擴(kuò)增含有預(yù)測miR-101-3p結(jié)合位點的TDRG1片段,克隆到含有螢光素酶的報告載體中來構(gòu)建TDRG1野生型(TDRG1-WT)。為了使預(yù)測的miR-101-3p結(jié)合位點在TDRG1內(nèi)發(fā)生突變,將假定的結(jié)合位點序列替換為TDRG1突變型(TDRG1-Mut)。用Lipofectamine 3000將載體和pre-miR-101-3p共轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞。48 h后,通過細(xì)胞裂解提取樣品以檢測螢光素酶活性。

    3 統(tǒng)計學(xué)處理

    使用SPSS17.0進(jìn)行分析。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,兩組之間的差異通過Student′st檢驗進(jìn)行了分析,多組間比較采用單因素方差分析以及Bonferroni事后檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1 TDRG1在人CRC組織中的表達(dá)情況

    應(yīng)用RT-qPCR檢測CRC組織中TDRG1的表達(dá)水平。如圖1所示,與匹配的癌旁組織相比,在CRC組織中觀察到TDRG1的表達(dá)水平顯著增加(P<0.01),見圖1A。此外,我們檢測了TDRG1在CRC細(xì)胞系中的表達(dá),結(jié)果表明,與正常細(xì)胞NCM460相比,TDRG1在CRC細(xì)胞系HT-29、SW480和LoVo中明顯上調(diào)(P<0.05或P<0.01),見圖1B。TDRG1表達(dá)與腫瘤病理參數(shù)的關(guān)系分析顯示,TDRG1表達(dá)與CRC的腫瘤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤大小呈正相關(guān)(P<0.05),見表1。

    Figure 1.TDRG1 was highly expressed in CRCtissues and cells.A:the expression of TDRG1 was analyzed by RT-qPCR(n=40);B:the relative expression of TDRG1 in 3 colorectal cancer cell lines and normal NCM460 cells was analyzed by RT-qPCR(n=3).Mean±SD.**P<0.01 vs normal tissues;#P<0.05,##P<0.01 vs NCM460 group.圖1 TDRG1在CRC組織和細(xì)胞中高表達(dá)

    表1 TDRG1表達(dá)與腫瘤病理參數(shù)的關(guān)系Table 1.Relationship between TDRG1 expression and tumor pathological parameters

    2 敲減TDRG1基因的表達(dá)對SW480細(xì)胞增殖及侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響

    為了探討TDRG1在CRC進(jìn)展中的作用,用敲減SW480細(xì)胞株中TDRG1表達(dá)(圖2A)的方法檢測細(xì)胞增殖及侵襲能力。如圖2B、C所示,敲減TDRG1基因的表達(dá)抑制了SW480細(xì)胞的活力和集落形成能力(P<0.01)。此外,sh-TDRG1轉(zhuǎn)染可觀察到遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)量顯著減少(P<0.01),見圖2D。

    3 miR-101-3p是TDRG1的直接靶點

    越來越多的證據(jù)表明,lncRNA可作為相應(yīng)miRNA的ceRNA[10]。因此,利用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫Starbase 2.0預(yù)測miR-101-3p作為TDRG1的靶點(圖3A),并通過雙螢光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C了二者關(guān)系(圖3B)。隨后,RT-qPCR分析顯示,敲減TDRG1的表達(dá)上調(diào)了SW480細(xì)胞中miR-101-3p的水平(圖3C)。此外,與正常組織相比,在CRC腫瘤組織中觀察到miR-101-3p低表達(dá)水平(P<0.05),見圖3D。Pearson相關(guān)分析顯示TDRG1與miR-101-3p呈負(fù)相關(guān)(R2=0.389,P<0.01),見圖3E。

    4 TDRG1通過miR-101-3p調(diào)節(jié)CRC的進(jìn)展

    為了進(jìn)一步探討miR-101-3p是否參與TDRG1相關(guān)的CRC進(jìn)展,使用miR-101-3p抑制劑轉(zhuǎn)染到SW480細(xì)胞。圖4A顯示miR-101-3p抑制劑的顯著抑制效率。CCK-8和集落形成實驗的結(jié)果表明,miR-101-3p抑制劑減輕了敲減TDRG1表達(dá)導(dǎo)致的細(xì)胞活力和集落形成能力的降低(圖4B、C)。此外,Transwell實驗表明miR-101-3p抑制劑也減輕了敲減TDRG1表達(dá)引起的細(xì)胞侵襲能力的降低(圖4D)。

    討 論

    Figure 2.Knock-down of TDRG1 expression inhibited the proliferation,migration and invasion abilities of SW480 cells.A:knockdown efficiency of sh-TDRG1 transfection in SW480 cells;B and C:the proliferation of SW480 cells was detected by CCK-8 assay and colony formation assay;D:Transwell assay was used to detect the migration and invasion abilities of the cells.Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01 vs sh-NCgroup.圖2 敲減TDRG1基因的表達(dá)抑制SW480細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力

    Figure 3.miR-101-3p was the direct target of TDRG1.A:the binding site between TDRG1 and miR-101-3p was predicted by Starbase 2.0;B:luciferase reporter assay confirmed the interaction between TDRG1 and miR-101-3p in HEK-293T cells;C:knock-down of TDRG1 expression promoted the expression of miR-101-3p in SW480 cells;D:the expression of miR-101-3p in tumor tissues was lower than that in normal tissues;E:there was a negative correlation between miR-101-3p and TDRG1 in CRCtissues.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs pre-NCcells;##P<0.01 vs sh-NCgroup;△P<0.01 vs normal tissues.圖3 miR-101-3p是TDRG1的直接靶點

    Figure 4.miR-101-3p mediated TDRG1 to regulate the occurrence and development of CRC.A:the knock-down efficiency of miR-101-3p in SW480 cell line was detected by RT-qPCR;Band C:the proliferation of SW480 cells was detected by CCK-8 assay and colony formation assay after transfection;D:the migration and invasion abilities of the cells were detected by Transwell assay.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs sh-NC+anti-NCgroup;#P<0.05 vs sh-TDRG1+anti-NCgroup.圖4 miR-101-3p介導(dǎo)TDRG1調(diào)控CRC的發(fā)生發(fā)展

    CRC是第4大腫瘤相關(guān)死亡原因[10]。越來越多的證據(jù)表明,lncRNA在腫瘤進(jìn)展中起重要作用,并且在CRC中發(fā)現(xiàn)了lncRNA的異常表達(dá)[11-12]。因此,需要明確lncRNA在CRC發(fā)生發(fā)展中的確切作用,以期在CRC治療中尋找新的診斷生物標(biāo)志物。TDRG1是一種新的lncRNA,在多種人類腫瘤中起致癌作用。最近已證實TDRG1通過調(diào)節(jié)miR-326/絲裂原激活的蛋白激酶1或miR-214-5p/SOX4促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的生長、遷移和侵襲[8-9]。在NSCLC中,TDRG1通過調(diào)節(jié)miR3/ZEB1軸促進(jìn)NSCLC細(xì)胞轉(zhuǎn)移[13]。因此,在幾種惡性腫瘤中,TDRG1被認(rèn)為是有效的癌基因。然而,TDRG1在CRC中的作用尚未被探討。在本研究中,我們首先確定TDRG1在CRC中是起促進(jìn)癌癥的lncRNA,并證明TDRG1在人CRC組織中被過度調(diào)節(jié),其與CRC的腫瘤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤大小相關(guān);其次,我們進(jìn)行了功能喪失實驗,以探討TDRG1對CRC細(xì)胞惡性特征的影響。結(jié)果表明,敲減TDRG1的表達(dá)可抑制體外CRC細(xì)胞的增殖和侵襲,提示TDRG1可能作為CRC治療的生物標(biāo)志物。

    先前的研究已經(jīng)證明,lncRNA通過與miRNA競爭性結(jié)合而充當(dāng)ceRNA來調(diào)節(jié)癌癥相關(guān)基因的表達(dá)[14]。我們使用了生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(StarBase 2.0)分析確定了miR-101-3p可能與TDRG1相互作用,并通過隨后的螢光素酶實驗證實了這一點。miR-101-3p被報道為不同腫瘤中的腫瘤抑制miRNA,如乳腺癌、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、骨肉瘤、卵巢癌和肝細(xì)胞癌[15-16]。值得注意的是,Jin等[17]發(fā)現(xiàn)miR-101-3p在CRC組織中下調(diào),miR-101-3p的表達(dá)增加抑制了CRC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。在這項研究中,我們在CRC腫瘤組織中觀察到miR-101-3p低表達(dá)水平,并且Pearson相關(guān)分析顯示TDRG1與miR-101-3p呈負(fù)相關(guān)。此外,轉(zhuǎn)染miR-101-3p抑制劑部分減輕了敲減TDRG1表達(dá)引起的細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的降低??偠灾?,本研究發(fā)現(xiàn)的miR-101-3p在CRC進(jìn)展中的表達(dá)模式和抑癌作用的研究結(jié)果與Jin等[17]的結(jié)果一致。因此,靶向TDRG1/miR-101-3p可能是治療CRC的一種新途徑。

    綜上所述,本研究證明TDRG1是CRC中的一個癌基因,并且與CRC的進(jìn)展密切相關(guān)。敲減TDRG1的表達(dá)聯(lián)合miR-101-3p過表達(dá)在體外具有抑瘤作用,且兩者之間存在負(fù)相關(guān)。TDRG1/miR-101-3p可能在人CRC中發(fā)揮重要作用,為CRC的治療提供了一個有前途的靶點。

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