五虎湯抑制STAT3通路并調(diào)節(jié)哮喘小鼠Th2/Th17免疫平衡*

丁 伊，王孟清，羅銀河△，胡 燕，江智豪，張 鑫，李 英，羅 菁，丁 煥，鄧羿駃

（1湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長(zhǎng)沙410208；2湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南長(zhǎng)沙410007；3深圳市南山區(qū)蛇口人民醫(yī)院，廣東深圳154100；4長(zhǎng)沙醫(yī)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410219）

支氣管哮喘（簡(jiǎn)稱(chēng)哮喘）是一種氣道異質(zhì)性疾病，其特征在于氣道炎癥和支氣管高反應(yīng)性，導(dǎo)致可逆性氣流受限［1］。呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）是嬰幼兒呼吸道感染最常見(jiàn)的病原體［2］。哮喘的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多樣，涉及各種免疫細(xì)胞和促炎細(xì)胞因子［3］。Th17細(xì)胞是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的不同于Th1和Th2的T淋巴細(xì)胞亞群，參與了哮喘的發(fā)生與發(fā)展［4］。越來(lái)越多研究認(rèn)為T(mén)h2/Th17免疫失衡在RSV誘發(fā)哮喘的發(fā)病機(jī)理和炎癥中起關(guān)鍵作用［5］。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）信號(hào)通路的激活參與Th2和Th17細(xì)胞因子的產(chǎn)生，與哮喘的發(fā)生關(guān)系密切［6］。相關(guān)研究已證實(shí)采用小分子C188-9可以通過(guò)拮抗小鼠STAT3信號(hào)通路抑制Th2/Th17細(xì)胞因子比例水平改善哮喘小鼠炎癥反應(yīng)［7］。

目前臨床通常認(rèn)為吸入皮質(zhì)類(lèi)固醇可以很好地控制哮喘，但長(zhǎng)期使用會(huì)引起各種副作用，中藥已被證明對(duì)哮喘有治療作用［8-10］。傳統(tǒng)古方五虎湯（Wuhu decoction）具有清瀉肺熱、止咳平喘之功效。前期臨床研究表明，五虎湯能明顯減少RSV毛細(xì)支氣管炎發(fā)展為典型哮喘［11］；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，五虎湯抑制RSV復(fù)制，降低哮喘氣道高反應(yīng)性，改善氣道炎癥及氣道重塑［12-13］。但關(guān)于五虎湯對(duì)RSV誘發(fā)的哮喘小鼠Th2/Th17免疫平衡機(jī)制的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究構(gòu)建RSV復(fù)合卵清蛋白（ovalbumin，OVA）哮喘小鼠模型，觀察STAT3信號(hào)通路對(duì)RSV誘發(fā)的哮喘小鼠Th2/Th17的免疫調(diào)節(jié)作用及五虎湯在其中的干預(yù)作用，為闡明五虎湯緩解RSV誘發(fā)的哮喘氣道免疫炎癥提供新的理論依據(jù)。

材料和方法

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠60只，4～6周齡，15～18 g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物資格證書(shū)編號(hào)為SCXK（湘）2019-0004。實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理審批號(hào)為ZYFY20200712。

1.2 藥物與試劑五虎湯由麻黃（不去節(jié)）2.4 g、杏仁（去尖皮）6.0 g、生石膏9.0 g、生甘草2.4 g和細(xì)茶葉4.8 g組成，每瓶100 mL，含生藥24.6 g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科制備。RSV Long株及人喉癌上皮Hep-2細(xì)胞（武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)部病毒學(xué)研究所）；雞OVA（Solarbio，批號(hào)9006-59-1）；STAT3抑制劑Stattic（MCE，批號(hào)HY-13818）；氯化乙酰膽堿（Selleck，批號(hào)2260-50-6）；白細(xì)胞介素4（interleukin-4，IL-4）、IL-5、IL-17A和IL-23 ELISA試劑盒（上海晶天生物科技有限公司）；抗STAT3抗體（批號(hào)ab119352）和抗p-STAT3抗體（批號(hào)ab76315）均購(gòu)自Abcam。

1.3 主要儀器超聲霧化器（南京道芬電子有限公司，型號(hào)S888E）；DHX-50小動(dòng)物呼吸機(jī)及氣道阻力和肺順應(yīng)性分析軟件（BUXCO）；透射電子顯微鏡（日立高新技術(shù)公司，型號(hào)HT7700）；臺(tái)式離心機(jī)（金壇市大地自動(dòng)化儀器廠，型號(hào)12008007）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物造模及分組SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠60只，隨機(jī)分20只為正常組，其余40只為模型組。參照前期文獻(xiàn)建立哮喘小鼠模型［12］，實(shí)驗(yàn)前2 d模型組每只小鼠鼻腔滴入RSV（0.05 mL）并腹腔注射0.25 mL 1%雞OVA，正常組予以等體積Hep-2細(xì)胞滴鼻，同時(shí)皮下注射等體積生理鹽水。從第9天起模型組小鼠予以1%雞OVA隔天霧化1次，每次30 min，正常組予同樣體積生理鹽水霧化吸入，持續(xù)2周。霧化結(jié)束后從正常組和模型組小鼠中分別隨機(jī)抽取10只進(jìn)行氣道反應(yīng)性測(cè)定，觀察到造模后小鼠氣道反應(yīng)性顯著高于正常組并出現(xiàn)氣短、喘息等行為學(xué)表現(xiàn)提示造模成功。將正常組及造模成功后的小鼠隨機(jī)分成4組，每組10只，即正常（normal）組、模型（model）組、五虎湯（Wuhu decoction）組和STAT3抑制劑（Stattic）組。

2.2 給藥按臨床量效關(guān)系觀察結(jié)果，擬定五虎湯組灌胃劑量為3.2 g/kg，同時(shí)腹腔注射0.9%生理鹽水（10 mL/kg）；Stattic組腹腔注射Stattic（3.75 mg/kg），并灌胃等容積生理鹽水；正常組及模型組均灌胃并腹腔注射相同體積生理鹽水，每日1次，連續(xù)2周。

2.3 氣道反應(yīng)性的測(cè)定小鼠末次給藥后24 h，麻醉、行氣管插管后，把小鼠放入體描箱中，連接呼吸機(jī)，調(diào)整呼吸機(jī)參數(shù)，頻率為75 min-1，潮氣量為8 mL/kg時(shí)記錄初始的氣道壓力、流速及潮氣量變化，待小鼠氣道壓力平穩(wěn)后，霧化吸入0.1 mL不同劑量（0、6.25、12.5、25和50μg/kg）的乙酰膽堿，每次吸入乙酰膽堿后，收集吸入后5 s～1 min的數(shù)據(jù)，并計(jì)算最大肺阻力（lung resistance，RL）。

2.4 組織學(xué)檢查肺組織由多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，切片，進(jìn)行HE染色，梯度脫水，透明切片滴上樹(shù)膠，蓋上蓋玻片并進(jìn)行鏡檢。

2.5 血清中IL-4、IL-5、IL-17A和IL-23含量的測(cè)定根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟，依次檢測(cè)血清中IL-4、IL-5、IL-17A和IL-23的含量，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其濃度。

2.6 肺組織中STAT3和p-STAT3蛋白水平的測(cè)定

2.6.1 Western blot法在肺組織中提取總蛋白，BAC法進(jìn)行蛋白定量，每組取50μg的總蛋白，按1∶4加入SDS上樣緩沖液，加熱5 min后加入樣品，進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜，封閉1 h，分別加入兔抗STAT3和抗p-STAT3多克隆抗體及內(nèi)參照抗β-actin抗體孵育過(guò)夜，TBST洗滌10 min×3次，加入Ⅱ抗，孵育1 h，再用TBST洗滌10 min×3次。掃描后用Quantity One灰度分析軟件，相應(yīng)目的蛋白表達(dá)量為目的蛋白與β-actin條帶灰度的比值。

2.6.2 免疫組化法石蠟切片脫蠟后水化，熱修復(fù)抗原，加入1%高碘酸，室溫10 min以滅活內(nèi)源性酶，PBS沖洗3 min×3次，滴加非免疫正常山羊血清100μL，室溫孵育60 min后移液槍吸去封閉液，分別滴加抗STAT3及抗p-STAT3的Ⅰ抗，4℃孵育過(guò)夜，使用PBST充分浸洗5 min×5次，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記聚合物，室溫孵育30 min，PBST充分浸洗5 min×5次，3，3′-二甲基聯(lián)苯胺（3，3′-diaminobenzidine，DAB）顯色30 s，蒸餾水洗滌終止顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察陽(yáng)性細(xì)胞并采用Image-Pro Plus 6.0專(zhuān)業(yè)圖像分析進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 25.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較采用Boferroni校正的t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 五虎湯對(duì)哮喘模型小鼠氣道反應(yīng)性的影響

乙酰膽堿濃度在6.25、12.5、25和50μg/kg時(shí)，與正常組比較，模型組小鼠RL顯著上升（P＜0.01）；與模型組比較，五虎湯組及Stattic組的RL則顯著下降（P＜0.01），見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠在不同劑量乙酰膽堿激發(fā)下的氣道反應(yīng)性Table 1.Effects of different concentrations of acetylcholine on airway responsiveness（lung resistance，R L）in mice（cmH2O·s/mL.Mean±SD.n=10）

2 五虎湯對(duì)哮喘模型小鼠肺組織病理學(xué)的影響

HE染色結(jié)果顯示，正常組小鼠肺組織周?chē)鸁o(wú)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，支氣管管腔規(guī)則，氣道黏膜上皮細(xì)胞完整；模型組小鼠支氣管管腔狹窄，毛細(xì)血管水腫，周?chē)梢?jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；五虎湯組和Stattic組上述肺組織損傷情況均明顯減輕，見(jiàn)圖1。

3 五虎湯對(duì)哮喘模型小鼠血清中IL-4、IL-5、IL-17A和IL-23含量的影響

ELISA結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組小鼠血清中IL-4、IL-5、IL-17A和IL-23的含量顯著上升（P＜0.01）；與模型組相比，五虎湯和Stattic灌胃處理后小鼠血清中IL-4、IL-5、IL-17A和IL-23的含量顯著降低（P＜0.01），見(jiàn)圖2。

Figure 2.The serum levels of inflammatory factors in mice of different groups.Mean±SD.n=10.**P＜0.01 vs normal group；##P＜0.01 vs model group；△△P＜0.01 vs Wuhu decoction group.圖2 各組小鼠血清中炎癥因子含量的比較

4 五虎湯對(duì)哮喘模型小鼠肺組織中STAT3和p-STAT3蛋白水平的影響

Western blot結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組小鼠肺組織中p-STAT3/STAT3比值顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，五虎湯組和Stattic組小鼠STAT3和p-STAT3蛋白水平均顯著下降（P＜0.01），見(jiàn)圖3。

免疫組化法結(jié)果顯示，正常組小鼠幾乎無(wú)STAT3及p-STAT3表達(dá)；模型組小鼠中STAT3表達(dá)呈棕黃色顆粒著色，表達(dá)較正常組增加（P＜0.01），p-STAT3的變化特點(diǎn)與STAT3一致（P＜0.01）；與模型組比較，五虎湯組和Stattic組STAT3及p-STAT3蛋白水平均顯著降低（P＜0.01），見(jiàn)圖4。

Figure 3.The protein levels of p-STAT3/STAT3 in mouse lung tissues from different groups were determined by Western blot.Mean±SD.n=10.**P＜0.01 vs normal group；##P＜0.01 vs model group.圖3 Western blot檢測(cè)各組小鼠肺組織p-STAT3/STAT3蛋白水平

Figure 4.The results of immunohistochemistry for STAT3 and p-STAT3 in mouse lung tissues fromeach group（×200），and the quantitative analysis（C）.Mean±SD.n=10.*P＜0.05，**P＜0.01 vs normal group；##P＜0.01 vs model group.圖4 免疫組化檢測(cè)各組小鼠肺組織中STAT3和p-STAT3蛋白水平

討 論

哮喘是復(fù)雜的宿主與環(huán)境相互作用的結(jié)果，涉及免疫反應(yīng)的多種表型特征。但研究表明，大多數(shù)哮喘表型與致病性Th2和Th17細(xì)胞有關(guān)［14］，Th17可以增強(qiáng)Th2介導(dǎo)的嗜酸性粒細(xì)胞哮喘的炎癥反應(yīng)［15］，Th2/Th17可能共同參與哮喘的發(fā)病機(jī)制。STAT3信號(hào)通路是炎癥細(xì)胞因子重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，可經(jīng)細(xì)胞因子和氧化刺激等激活后參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化及免疫調(diào)節(jié)等病理生理過(guò)程［16-17］。因此，各種細(xì)胞因子可以通過(guò)STAT3信號(hào)通路傳遞信息，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，參與哮喘發(fā)生［18］。

RSV誘導(dǎo)氣道慢性炎癥發(fā)生時(shí)，Th2細(xì)胞的主要細(xì)胞因子IL-4和IL-5大量分泌，刺激B淋巴細(xì)胞，促進(jìn)炎癥趨化因子的形成，從而加劇變態(tài)反應(yīng)過(guò)程［19］。Th17細(xì)胞特異性產(chǎn)生的IL-17A可致肺組織病理學(xué)改變，出現(xiàn)支氣管管腔狹窄及氣道上皮細(xì)胞損傷等炎癥反應(yīng)［20］。IL-23是Th17細(xì)胞的重要存活因子，可誘導(dǎo)初始CD4+T細(xì)胞分化為T(mén)h17細(xì)胞［21］。STAT3是STAT3信號(hào)通路的關(guān)鍵因子，參與細(xì)胞內(nèi)炎癥反應(yīng)的發(fā)生［22］。本研究結(jié)果顯示，RSV誘發(fā)的哮喘模型小鼠出現(xiàn)肺組織損傷，血清中IL-4、IL-5、IL-17A和IL-23的含量顯著上升，引起Th2/Th17免疫失衡，加重哮喘癥狀，同時(shí)肺組織中STAT3及p-STAT3的蛋白水平顯著升高，提示哮喘小鼠中STAT3蛋白的過(guò)度表達(dá)和持續(xù)激活。本研究以治哮名方五虎湯和STAT3抑制劑Stattic進(jìn)行灌胃干預(yù)處理，觀察其對(duì)Th2/Th17免疫平衡和STAT3通路的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)五虎湯和Stattic均可減輕RSV誘發(fā)的哮喘小鼠肺組織病理學(xué)改變，顯著減少炎癥因子的釋放，降低肺組織中STAT3及p-STAT3的蛋白水平，進(jìn)而糾正Th2/Th17失衡，減輕免疫炎癥。

綜上所述，本研究成功建立了RSV誘導(dǎo)的哮喘小鼠模型；五虎湯可能通過(guò)抑制STAT3通路，調(diào)節(jié)Th2/Th17免疫平衡，減少炎癥因子的分泌，進(jìn)而抑制免疫炎癥。