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    PPARγ在結(jié)核分枝桿菌感染小鼠脂質(zhì)代謝中的作用*

    2021-06-02 11:55:30趙曉杰韓曉群周智興劉冬梅王海利
    中國(guó)病理生理雜志 2021年5期
    關(guān)鍵詞:內(nèi)脂宿主脂質(zhì)

    趙曉杰,韓曉群,鄧 琴,楊 婧,周智興,劉冬梅,王海利

    (宜春學(xué)院1化學(xué)與生物工程學(xué)院,2醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)免疫與微生物學(xué)教研室,江西宜春336000)

    結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)引起的、嚴(yán)重危害人類健康的呼吸道傳染病。目前盡管在監(jiān)測(cè)和治療肺結(jié)核方面做出了持續(xù)和廣泛的努力,但全球每年仍有約20億人感染MTB,100多萬(wàn)人死于結(jié)核病及其并發(fā)癥[1]。因而,探索針對(duì)細(xì)菌和宿主的治療方法以阻止MTB感染和進(jìn)展為活動(dòng)性結(jié)核病迫在眉睫。

    MTB在宿主體內(nèi)可通過(guò)調(diào)節(jié)多種基因表達(dá),進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體的脂質(zhì)代謝和炎癥反應(yīng),從而為其適應(yīng)細(xì)胞內(nèi)的生活方式提供條件[2],其中過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ)便是在脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用的胞內(nèi)誘導(dǎo)基因之一。PPARγ是一種配體激活的轉(zhuǎn)錄因子,與視黃醇X受體(retinoid X receptor,RXR)形成異二聚體,通過(guò)與靶基因啟動(dòng)子區(qū)的特異性PPAR反應(yīng)元件(PPAR-response elements,PPRE)結(jié)合,調(diào)控多種基因表達(dá)[3],使其成為一種穩(wěn)定的葡萄糖穩(wěn)態(tài)和脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)劑,參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展[4]、細(xì)胞分化[5]、脂質(zhì)代謝[6]和炎癥反應(yīng)[7-8]等多種病理生理過(guò)程[9]。

    研究證實(shí),MTB感染巨噬細(xì)胞中PPARγ的表達(dá)在脂質(zhì)聚集中發(fā)揮重要作用[10],而脂質(zhì)聚集有助于細(xì)胞內(nèi)MTB的存活和/或復(fù)制[11],但其作用是否通過(guò)PPARγ依賴途徑及其機(jī)制尚未闡明。另外,PPARγ的抑制在體內(nèi)MTB感染過(guò)程中能否增強(qiáng)機(jī)體對(duì)胞內(nèi)病原體的清除作用尚無(wú)體內(nèi)研究予以證實(shí)。因此,本研究通過(guò)探討PPARγ對(duì)MTB感染小鼠機(jī)體脂質(zhì)代謝及肺組織損傷的影響及機(jī)制,為揭示MTB的致病機(jī)理提供重要線索,為結(jié)核病的防治提供新的理論依據(jù)。

    材料和方法

    1 實(shí)驗(yàn)材料

    1.1 實(shí)驗(yàn)用菌株與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物MTB標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。細(xì)菌在含有馬鈴薯、蛋黃、孔雀綠的羅氏培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期,無(wú)菌濾過(guò),調(diào)整單細(xì)胞懸液菌濃度為5×109CFU/L,分裝凍存于-80℃低溫冰箱備用。

    6~8周齡SPF級(jí)C57BL/6雄性小鼠60只,體重18~20 g,購(gòu)自三峽大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。動(dòng)物在感染前1周進(jìn)入生物安全Ⅲ級(jí)實(shí)驗(yàn)室。

    1.2 主要試劑Trizol試劑購(gòu)自北京艾德萊生物科技有限公司;SYBR Green Master Mix購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;高效RNA-cDNA試劑盒購(gòu)自Applied Biosystems;總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所;油紅O購(gòu)自Sigma;抗CD36抗體購(gòu)自Abcam。

    2 方法

    2.1 實(shí)驗(yàn)分組及處理方法實(shí)驗(yàn)分4組:(1)對(duì)照(control)組:尾靜脈注射PBS;(2)MTB組:尾靜脈注射MTB菌液,感染劑量為5×105CFU;(3)MTB+羅格列酮(rosiglitazone,ROZ)組:注射MTB前3 d,給予ROZ灌胃,劑量為4 mg·kg-1·d-1,注射MTB后1 h再給予當(dāng)天的羅格列酮灌胃,以后按照計(jì)劃劑量(4 mg·kg-1·d-1)給予灌胃;(4)MTB+GW9662組:注射MTB后1 h,給予腹腔內(nèi)注射GW9662,劑量為4 mg/kg,以后按照計(jì)劃劑量(4 mg·kg-1·d-1)給予GW9662腹腔注射。按照以上分組方法處理小鼠6周后,禁食12 h,斷頭采血,離心分離血漿,置于-80℃冰箱保存。取小鼠部分肺組織置于-80℃冰箱保存?zhèn)錅y(cè)PPARγ表達(dá),剩余肺組織進(jìn)行油紅染色、荷菌量檢測(cè)及病理分析。

    2.2 肺組織荷菌量檢測(cè)嚴(yán)格無(wú)菌條件下取各組小鼠肺組織充分漂洗,加入生理鹽水1mL,用組織勻漿器研磨制備組織懸液,取0.1mL以生理鹽水作10倍倍比稀釋,取各稀釋度的組織稀釋液100μL接種于羅氏斜面培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)4周后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。取每個(gè)斜面上的菌落數(shù)在5~50 CFU范圍內(nèi)的稀釋度進(jìn)行組織荷菌量計(jì)算。

    2.3 HE染色觀察肺組織的病理變化取各組小鼠部分肺組織,用4%多聚甲醛固定液固定24h,經(jīng)過(guò)梯度乙醇脫水后進(jìn)行石蠟包埋、切片及脫蠟、HE染色,光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織病理變化。

    2.4 RT-qPCR檢測(cè)肺組織PPARγ的mRNA表達(dá)取-80℃冰箱中保存的新鮮冰凍肺組織制成組織勻漿,按照文獻(xiàn)報(bào)道的方法[12],采用RT-qPCR檢測(cè)肺組織PPARγ的mRNA表達(dá)。引物序列如表1所示。以β-actin為內(nèi)參照,相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。mRNA水平用β-actin表達(dá)的相對(duì)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,結(jié)果用2-ΔΔCt方法分析。

    表1 RT-qPCR引物序列Table 1.Primer sequences for RT-qPCR

    2.5 Western blot檢測(cè)肺組織PPARγ的蛋白表達(dá)取肺組織100 mg,用RIPA裂解液提取肺組織中的蛋白。按常規(guī)操作進(jìn)行PPARγ的Western blot檢測(cè),蛋白條帶通過(guò)化學(xué)發(fā)光劑顯影,用BandScan分析膠片灰度值,目標(biāo)蛋白表達(dá)量通過(guò)β-actin進(jìn)行校正。

    2.6 油紅O染色觀察肺組織內(nèi)脂質(zhì)蓄積冰凍切片用甲醛-鈣固定10 min,蒸餾水洗,繼之以60%異丙醇浸洗,油紅O染液染10 min,60%異丙醇分色至背景無(wú)色,再次蒸餾水洗。Mayer蘇木素復(fù)染數(shù)分鐘,PBS浸洗(藍(lán)化)3 min。蒸餾水洗后水溶性封片劑封片,顯微鏡下觀察。

    2.7 ELISA檢測(cè)血漿脂質(zhì)水平使用TC、TG、LDLC和HDL-C試劑盒,采用ELISA在全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Thermo Scientific)上進(jìn)行檢測(cè)。

    2.8 免疫組化檢測(cè)肺組織CD36的表達(dá)組織塊經(jīng)乙醇脫水后經(jīng)二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片、烤片和脫蠟后,加適量的0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液(pH 6.0)置于微波爐中進(jìn)行抗原修復(fù)。3%的過(guò)氧化氫滴加于切片組織上以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。加Ⅰ抗后于4℃濕盒中孵育過(guò)夜(15 h)。加酶標(biāo)Ⅱ抗,37℃孵育30 min。每一步操作之間均以0.01 mol/L PBS液沖洗3 min。DAB顯色,蘇木素復(fù)染2 min,脫水透明后封片,顯微鏡下觀察。

    3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組獨(dú)立、正態(tài)、方差齊資料組間比較采用單因素方差分析,多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1 MTB感染后小鼠肺組織PPARγ表達(dá)的變化

    如圖1所示,對(duì)照組、MTB組、MTB+ROZ組及MTB+GW9662組之間PPARγ表達(dá)的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組相比,MTB組、MTB+ROZ組及MTB+GW9662組小鼠肺組織PPARγ的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05);MTB+ROZ組小鼠肺組織PPARγ表達(dá)顯著高于MTB組,MTB+GW9662組小鼠肺組織PPARγ表達(dá)則較MTB組顯著降低(P<0.05)。

    Figure 1.Expression of PPARγat mRNA and protein levels in the lung tissue of mice in each group.A:the mRNA expression of PPARγin the lung tissue of mice in each group;B:the protein expression of PPARγin the lung tissue of mice in each group.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs control group;#P<0.05 vs MTBgroup.圖1 各組小鼠肺組織PPARγ的mRNA和蛋白表達(dá)

    2 各組小鼠肺組織脂質(zhì)水平

    油紅O染色結(jié)果顯示,MTB組小鼠肺組織可見少量橙紅色脂滴;MTB+ROZ組小鼠肺組織內(nèi)橙紅色脂滴彌漫分布,較單純MTB組明顯增多;而MTB+GW9662組小鼠肺組織內(nèi)脂滴數(shù)量較MTB組明顯減少,見圖2。

    Figure 2.Lipid level in the lung tissue of mice in each group(Oil red Ostaining,×400).圖2 各組小鼠肺組織脂質(zhì)水平

    3 各組小鼠肺組織荷菌量的比較

    如圖3所示,MTB組、MTB+ROZ組及MTB+GW9662組之間肺組織荷菌量的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=13.247,P<0.05)。與MTB組比較,MTB+ROZ組小鼠肺組織荷菌量明顯升高(6.20±0.58vs6.92±0.21,P<0.05);MTB+GW9662組小鼠肺組織荷菌量明顯降低(6.20±0.58vs5.50±0.49,P<0.05)。

    Figure 3.Bacterial load in lung tissue of mice in each group.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs MTB group.圖3 各組小鼠肺組織荷菌量

    4 肺組織PPARγ表達(dá)與荷菌量相關(guān)性分析

    相關(guān)性分析結(jié)果顯示各組小鼠肺組織PPARγ表達(dá)與荷菌量對(duì)數(shù)值呈正相關(guān)(r=0.812,P<0.01),見圖4。

    Figure 4.The correlation between PPARγexpression and bacterial load.Mean±SD.n=3.圖4 小鼠肺組織PPARγ表達(dá)與荷菌量相關(guān)性

    5 各組小鼠肺組織CD36表達(dá)

    免疫組化染色結(jié)果顯示,CD36鏡下觀察為棕褐色沉淀。CD36在MTB組呈中等表達(dá),在MTB+ROZ組呈高表達(dá),而在對(duì)照組和MTB+GW9662組不表達(dá)和呈低表達(dá),見圖5。這表明PPARγ活化能夠增加CD36的表達(dá),而拮抗PPARγ活性則抑制CD36的表達(dá)。

    Figure 5.Expression of CD36 in lung tissue of mice in each group(×400).圖5 各組小鼠肺組織CD36表達(dá)

    6 各組小鼠血漿脂質(zhì)濃度

    如圖6所示,對(duì)照組、MTB組、MTB+ROZ組及MTB+GW9662組之間TC、TG、LDL-C及HDL-C的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。MTB組小鼠血漿脂質(zhì)水平均明顯低于對(duì)照組(P<0.05);與單純MTB感染組相比,感染的同時(shí)給予PPARγ激動(dòng)劑羅格列酮和PPARγ拮抗劑GW9662,血漿脂質(zhì)水平分別表現(xiàn)為明顯下降(P<0.05)和升高(P<0.05)。

    7 各組小鼠肺組織病理變化

    MTB組及MTB+ROZ組小鼠肺組織鏡下均可見肺泡壁增厚、肺組織壞死和出血、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),后者可見肺泡腔內(nèi)出現(xiàn)粉紅色滲出液,提示病變更為嚴(yán)重;MTB+GW9662組小鼠肺組織鏡下雖然亦可見組織壞死及出血,但病變較輕,見圖7。

    討 論

    MTB侵入人體后,肺泡巨噬細(xì)胞是抵御細(xì)菌感染的第一道防線[13]。PPARγ在肺泡巨噬細(xì)胞的高表達(dá),在結(jié)核病的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用。本課題組前期研究顯示,結(jié)核病患者外周血單核細(xì)胞PPARγ表達(dá)高于健康對(duì)照組[14]。從本研究結(jié)果來(lái)看,MTB感染小鼠后,對(duì)肺組織造成了一定的結(jié)核性損傷,PPARγ的mRNA和蛋白表達(dá)均較對(duì)照組明顯升高。本研究亦對(duì)肝臟和脾臟進(jìn)行了組織病理學(xué)檢測(cè),僅顯示輕度炎癥反應(yīng),肝、脾組織PPARγ的mRNA和蛋白表達(dá)與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異(結(jié)果未在文中列出)。進(jìn)一步證實(shí)PPARγ與結(jié)核病發(fā)病存在一定的關(guān)系。

    Figure 6.Lipid concentration in plasma of mice in each group.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs control group;#P<0.05 vs MTBgroup.圖6 各組小鼠血漿脂質(zhì)濃度

    Figure 7.Pathological changes of the lung tissue of mice in each group(left:×40;right:×200).A:control group;B:MTB group;C:MTB+ROZ group;D:MTB+GW9662 group.圖7 各組小鼠肺組織病理變化

    MTB感染期間,慢性炎癥的一個(gè)重要特征是由MTB所誘導(dǎo)的泡沫巨噬細(xì)胞的積累,這是破壞巨噬細(xì)胞中脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)的因素之一,而這些脂質(zhì)的聚集會(huì)影響宿主對(duì)感染或細(xì)菌清除的反應(yīng),并且為細(xì)菌的生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng),從而促進(jìn)細(xì)菌生長(zhǎng)[15]。結(jié)核病患者的干酪性結(jié)核肉芽腫中表現(xiàn)出過(guò)多的宿主脂質(zhì)代謝基因表達(dá)上調(diào)[16],導(dǎo)致組織中脂質(zhì)蓄積。本課題組前期研究結(jié)果證實(shí)了結(jié)核病患者PPARγ表達(dá)的增加與其血漿脂質(zhì)水平的變化具有一定的關(guān)系[14]。本研究結(jié)果顯示,MTB感染小鼠肺組織中可見紅色脂滴形成。有研究報(bào)道,MTB感染后通過(guò)多種機(jī)制誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞泡沫化,繼之抑制巨噬細(xì)胞膜的修復(fù)功能,最終導(dǎo)致其破裂壞死,釋放胞內(nèi)脂質(zhì)成分而形成干酪樣壞死[17],因而推測(cè)肺泡巨噬細(xì)胞可能是MTB感染肺組織脂質(zhì)的重要來(lái)源。MTB+ROZ組肺組織內(nèi)橙紅色脂滴彌漫分布,較單純MTB組明顯增多,MTB+GW9662組肺組織內(nèi)脂滴數(shù)量明顯減少??梢?,PPARγ的活化能夠加劇MTB所誘導(dǎo)的脂質(zhì)聚集,而PPARγ拮抗劑GW9662則對(duì)MTB所致的脂質(zhì)聚集具有逆轉(zhuǎn)作用,表明PPARγ在結(jié)核病相關(guān)脂質(zhì)代謝中發(fā)揮了重要的作用。

    Knight等[18]認(rèn)為,MTB特異性地激發(fā)脂滴的形成,是一種致病策略,目的是建立宿主脂質(zhì)庫(kù),作為碳源來(lái)促進(jìn)自身在細(xì)胞內(nèi)的生長(zhǎng)。MTB優(yōu)先利用脂質(zhì)促進(jìn)多種代謝功能,包括能量合成,毒力因子表達(dá),細(xì)胞壁和外膜構(gòu)建,為自身在宿主體內(nèi)生長(zhǎng)提供有益條件[11]。本研究對(duì)小鼠肺組織荷菌量檢測(cè)結(jié)果顯示,與單純感染MTB相比較,同時(shí)給予PPARγ激動(dòng)劑,小鼠肺組織荷菌量明顯升高,PPARγ拮抗劑則可降低肺組織荷菌量。相關(guān)性分析結(jié)果顯示,各組小鼠肺組織PPARγ表達(dá)與荷菌量呈正相關(guān),也從另一個(gè)角度說(shuō)明了,PPARγ的抑制所致的脂滴耗竭能夠增強(qiáng)機(jī)體對(duì)胞內(nèi)MTB的清除。

    CD36作為一種識(shí)別氧化脂質(zhì)或氧化凋亡蛋白的B型清道夫受體[19],介導(dǎo)脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)、吞噬作用和炎癥對(duì)各種病原體(包括MTB)的反應(yīng)。MTB感染能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞CD36的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn),PPARγ介導(dǎo)的脂質(zhì)積聚與麻風(fēng)病皮損內(nèi)巨噬細(xì)胞中CD36表達(dá)增加呈正相關(guān)[20]。氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,oxLDL)可以通過(guò)激活PPARγ誘導(dǎo)CD36表達(dá)[21]。本研究結(jié)果顯示,小鼠肺組織CD36在單純MTB感染組呈中等表達(dá),而在感染的同時(shí)給予PPARγ激動(dòng)劑羅格列酮,CD36則呈高表達(dá),PPARγ拮抗劑GW9662則降低了CD36表達(dá),證實(shí)了CD36表達(dá)確實(shí)與PPARγ活化有關(guān)。正常情況下,體內(nèi)肺泡巨噬細(xì)胞可通過(guò)CD36攝取LDL之間的協(xié)作來(lái)維持胞內(nèi)脂質(zhì)的平衡[16]。正是MTB感染上調(diào)了PPARγ的表達(dá),導(dǎo)致下游信號(hào)CD36對(duì)脂質(zhì)的過(guò)度攝取,引起外源性脂質(zhì)的流入增加,因而導(dǎo)致MTB感染小鼠肺組織脂質(zhì)水平的變化??梢?,MTB感染過(guò)程中,PPARγ可通過(guò)調(diào)節(jié)參與脂質(zhì)吸收的CD36表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的積累[22],但并不排除PPARγ介導(dǎo)的脂質(zhì)積聚還與其他清道夫受體,如巨噬細(xì)胞清道夫受體(macrophage scavenger receptor,MSR)、具有膠原結(jié)構(gòu)的巨噬細(xì)胞受體(macrophage receptor with collagenousstructure,MARCO)等表達(dá)有關(guān)。

    近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn),結(jié)核分枝桿菌依賴機(jī)體的脂類來(lái)決定其存活或增殖,因此其感染后誘導(dǎo)的機(jī)體脂代謝下調(diào)是該病原菌致病的主要特點(diǎn)。血液中脂質(zhì)水平的降低被認(rèn)為會(huì)加速肺部疾病的發(fā)展,而且是傳染病的主要危險(xiǎn)因素[23-25]。本研究檢測(cè)血漿TC、TG、LDL-C和HDL-C濃度,結(jié)果顯示PPARγ表達(dá)增加或其活化反而降低血脂水平,與PPARγ活化致肺組織脂質(zhì)增加相反。有理論認(rèn)為MTB感染產(chǎn)生過(guò)氧化作用,可能導(dǎo)致血脂濃度降低和組織炎癥[23]。此外,CD36能夠參與和增加對(duì)外源性脂質(zhì)的攝取[26],推測(cè)血脂降低與PPARγ誘導(dǎo)的CD36表達(dá)亦存在一定的關(guān)系。

    宿主脂質(zhì)在MTB細(xì)胞壁和胞內(nèi)內(nèi)含物中積累是MTB維持毒力所必需的[27]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)肺組織病理學(xué)觀察顯示,MTB感染過(guò)程中,PPARγ活化會(huì)導(dǎo)致肺組織出現(xiàn)更嚴(yán)重的病理?yè)p傷,而這種損傷伴隨著組織中脂滴的積聚,細(xì)菌數(shù)量的增加以及系統(tǒng)性血清脂質(zhì)的損耗。因而脂質(zhì)代謝異常對(duì)MTB感染和疾病進(jìn)展具有一定的促進(jìn)作用。

    總之,本研究探討了PPARγ通過(guò)CD36途徑在MTB感染小鼠脂質(zhì)代謝中的作用,闡明了MTB誘導(dǎo)的PPARγ表達(dá)所導(dǎo)致的脂質(zhì)聚集能夠影響宿主對(duì)細(xì)菌的清除[28],有助于MTB在體內(nèi)的存活和復(fù)制,這對(duì)MTB來(lái)說(shuō)是一種逃逸宿主免疫反應(yīng)的機(jī)制。從而提示PPARγ和CD36作為脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,有望成為遏制結(jié)核病進(jìn)展的候選靶標(biāo)。

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