• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    Rnd3表達改變對糖尿病大鼠內皮祖細胞生物學特性的影響*

    2021-06-02 11:55:28張書婭邵鐘銘伍彩霞劉曉曉郭峻莉
    中國病理生理雜志 2021年5期
    關鍵詞:骨髓培養(yǎng)基血管

    張書婭,邵鐘銘,伍彩霞,劉曉曉,鄒 園,揭 偉,△,郭峻莉△

    (1海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院海南省熱帶心血管病研究重點實驗室,海南醫(yī)學院急救與創(chuàng)傷研究教育部重點實驗室,海南???71199;2廣東醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院病理學系,廣東湛江524023)

    當前全球糖尿病患病率增長迅速且居高不下。據(jù)統(tǒng)計,2019年糖尿病患病數(shù)僅在20~79歲年齡段全世界就有4.63億;預計到2045年,這個數(shù)字將會增加超過7億[1]。血糖持續(xù)控制不良的情況下,糖尿病血管并發(fā)癥的患病率、致殘率和致死率也相應增加。血管功能障礙在糖尿病血管并發(fā)癥易感性方面起著重要作用,也是獨立預測因子[2]。內皮祖細胞(endothelial progenitor cells,EPCs)是內皮細胞的前體細胞,并且是多能干細胞,在再生醫(yī)學研究中具有重要的地位[3]。糖尿病狀態(tài)下EPCs數(shù)量和功能受損是糖尿病血管并發(fā)癥發(fā)生的重要機制。在血管受到缺血或缺氧刺激時,骨髓來源的EPCs可從骨髓動員到外周血并趨化遷移至缺血損傷部位分化為成熟的血管內皮細胞,形成新生血管,直接發(fā)揮其血管新生作用,也可通過分泌促血管新生的細胞因子以“旁分泌”的形式間接發(fā)揮其促血管新生的作用[4-5]。因而,EPCs的數(shù)量及增殖、遷移和分化等功能與血管疾病進程和死亡率呈負相關[6-7]。

    Rho家族GTP酶3(Rho family GTPase 3,Rnd3)是小GTP酶Rho家族的Rnd亞家族成員[8-9],可以競爭性結合RhoA的靶分子ROCK1而拮抗RhoA的生物學功能,在細胞的骨架和極性維持、周期、凋亡、遷移及黏附過程中起到了關鍵作用[10-13]。早期有研究顯示[14],與消瘦的非糖尿病人群相比,伴有肥胖的Ⅱ型糖尿病患者的骨骼肌組織中Rnd3表達增加,ROCK1活性減少,初步提出了糖尿病狀態(tài)與Rnd3表達之間的關系。本課題組前期結果顯示,Rnd3表達不足抑制了心肌梗死后血管新生,因而是體內調控血管新生的重要因子[15]。關于Rnd3與EPCs功能的關系,特別是在糖尿病狀態(tài)下的影響,目前尚未見報道。本研究旨在應用Rnd3基因敲除的大鼠,首次探討糖尿病狀態(tài)下Rnd3改變對骨髓源性EPCs一般生物學特性的影響,為后續(xù)相關機制和在體研究提供實驗依據(jù)和理論基礎。

    材料和方法

    1 實驗動物

    6周齡雌性和雄性Rnd3基因敲除的雜合子(Rnd3+/-)Sprague-Dawley(SD)大鼠均由江蘇賽業(yè)生物科技有限公司提供,許可證號為SYXK(粵)2015-0147。Rnd3+/-大鼠飼養(yǎng)并繁殖于廣東醫(yī)科大學醫(yī)學實驗動物中心,子代鼠經(jīng)基因型分析,分別得到Rnd3+/-和野生型(wild-type,WT)大鼠。

    2 材料和主要試劑

    RPMI-1640培養(yǎng)基和鏈脲佐菌素(Sigma);EGM-2專用培養(yǎng)基(LONZA);FITC-UEA-1和胎牛血清(fetal bovine serum,F(xiàn)BS)購自Gibco;大鼠淋巴細胞分離液(天津灝洋生物公司);DiI標記的乙?;兔芏戎鞍祝―iI-acLDL)購自廣州奕源生物科技有限公司;抗β-actin抗體(Santa Cruz);抗caspase-3抗體(CST);抗Bcl-2抗體(Proteintech);增強型CCK-8試劑盒(碧云天);Matrigel和Transwell小室(Corning);血管內皮生長因子(vascular endothlial growth factor,VEGF)ELISA試劑盒(R&D)。

    3 實驗方法

    3.1 糖尿病SD大鼠模型建立與分組委托江蘇賽業(yè)生物公司基于CRISPR/Cas9技術構建Rnd3基因敲除SD大鼠,經(jīng)PCR和測序鑒定合格的Rnd3+/-大鼠用于后代繁育,得到Rnd3+/-和WT大鼠。分別使用成年Rnd3+/-和WT大鼠來構建糖尿病動物模型,參考既往報道進行[16]。簡言之,使用高脂飼料適應性喂養(yǎng)大鼠1周。將STZ與檸檬酸鈉緩沖液混勻,配制終濃度為10 g/L。實驗組予STZ溶液以60 mg/kg一次性腹腔注射,對照組注射等比例檸檬酸鈉緩沖液。期間飼以高脂飼料。STZ注射3周后,以連續(xù)2次空腹血糖值≥16.7 mmol/L為建模成功。實驗分為4組:WT對照(WT-Ctrl)組、WT糖尿?。╓T-DM)組、Rnd3基因敲除雜合子對照(Rnd3+/--Ctrl)組和Rnd3基因敲除雜合子糖尿病(Rnd3+/--DM)。每組20只大鼠。

    3.2 大鼠骨髓源性EPCs的分離、培養(yǎng)及鑒定采用既往報道方法進行[17]。簡言之,大鼠經(jīng)阿佛汀完全麻醉后,將雙下肢迅速剝離,注意保持完整性。使用RPMI-1640培養(yǎng)基反復沖洗骨髓腔,經(jīng)70μm濾網(wǎng)過濾。采用大鼠淋巴細胞分離液分離出骨髓單個核細胞,RPMI-1640培養(yǎng)基清洗1次。將得到的細胞加入EGM-2內皮細胞專用完全培養(yǎng)基,輕輕重懸底層細胞。培養(yǎng)皿放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。48 h后吸取上清,二次接種于新的培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)。以后每48~72 h用EGM-2完全培養(yǎng)基換液。收集第3代貼壁細胞,加入10 mg/L的DiI-acLDL,避光于37℃孵育4 h;PBS漂洗2次,4%多聚甲醛固定20 min;加入10 mg/L的FITC-UEA-1,避光孵育1 h,PBS漂洗3次,加入抗熒光淬滅封片液封片。使用激光掃描共聚焦顯微鏡鑒定。DiI-acLDL和FITC-UEA-1表達雙陽性可以鑒定為EPCs[18]。本實驗所用的EPCs未做純度檢測。

    3.3 CCK-8法檢測細胞活力取WT-Ctrl、WT-DM、Rnd3+/--Ctrl和Rnd3+/--DM組生長狀態(tài)良好的第2代EPCs以每孔3×103接種于96孔板,每組6個復孔。每孔加入10μL CCK-8試劑,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h,酶標儀上讀取450 nm的吸光度(A)值。共設置0 d、1 d、2 d、3 d、5 d和7 d共6個時點。

    3.4 Western blot檢測各組EPCs的細胞凋亡相關分子的表達分別提取各組第2代EPCs總蛋白,BCA法測定蛋白濃度,每孔按35μg蛋白上樣,經(jīng)12%的SDS-PAGE分離。蛋白轉移至NC膜,各膜經(jīng)含5%BSA的TBST室溫搖床上封閉2 h,TBST洗滌2次后與相應Ⅰ抗過夜4℃孵育??贵w使用情況如下:Bcl-2,1∶500;caspase-3,1∶1 000;β-actin,1∶2 000。TBST洗滌15 min×3遍,各膜再與HRP-標記IgG室溫下結合1 h,洗滌后經(jīng)ECL發(fā)光液顯影,天能凝膠成像分析系統(tǒng)掃描和分析條帶。

    3.5 Transwell小室細胞遷移實驗第2代細胞以無血清同步化2 h,各組細胞以每孔2×104的數(shù)量(總體積200μL,含0.5%FBS)接種于Transwell小室的上室,下室每孔加入500μL含10%FBS的EGM-2完全培養(yǎng)液,細胞常規(guī)培養(yǎng)24 h后取出小室,PBS清洗小室2遍,用棉簽輕輕擦去微孔膜上層的細胞。4%多聚甲醛固定20 min后,結晶紫染色30 min,三蒸水漂洗3次,晾干,倒置顯微鏡觀察,拍照計數(shù)。每組設置3個復孔。

    3.6 ELISA檢測EPCs上清液中VEGF含量分別將同樣數(shù)量的對數(shù)生長期的第2代EPCs接種于6孔板,收集24 h貼壁后各孔內細胞上清標記為0 d組,細胞繼續(xù)培養(yǎng)3 d后再次收集未換液的細胞上清,標記為3 d組。根據(jù)ELISA試劑盒配制所有試劑與樣品進行VEGF濃度檢測。每組3個復孔。

    3.7 EPCs成管實驗48孔板每孔加入100μL稀釋后的Matrigel,放入37℃培養(yǎng)箱孵育30 min。第2代EPCs用無血清EBM-2培養(yǎng)基饑餓處理2 h,以每孔2×104的密度接種于Matrigel上,37℃、CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h后,置于光鏡下觀察,拍照,使用ImageJ軟件處理圖片。

    4 統(tǒng)計學處理

    采用GraphPad Prism 8.0軟件進行統(tǒng)計學分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。采用單因素方差分析進行Tukey兩兩對比分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    結 果

    1 成功分離大鼠骨髓源性EPCs

    分離的骨髓單個核細胞經(jīng)EGM-2培養(yǎng)基選擇性培養(yǎng)7 d后,可觀察到細胞呈簇狀,周圍呈梭形為主并放射狀生長,集落中央的細胞呈圓形,細胞較小。繼續(xù)培養(yǎng)至21 d左右,細胞形態(tài)相互融合呈典型的“鋪路石”狀(圖1A)。在熒光顯微鏡下觀察,吞噬DiI-acLDL的細胞呈現(xiàn)紅色熒光標記,特異結合FITC-UEA-1的細胞呈綠色熒光,同時攝取DiI-acLDL又結合FITC-UEA-1呈橘黃色熒光標記的雙陽性即為EPCs(圖1B)。

    Figure 1.The morphological and functional identification of EPCs.A:morphological change of EPCs at 21 d;B:functional identification of EPCs under fluorescence microscope.The scale bar=150μm.圖1 EPCs的形態(tài)與功能鑒定

    2 糖尿病狀態(tài)增強了Rnd3基因敲除對EPCs的活力的抑制效應

    CCK-8實驗結果顯示,相對于WT-Ctrl組,WTDM組在3 d時細胞活力顯著下降(P<0.05),Rnd3+/--Ctrl組在5 d時顯示出顯著下調趨勢(P<0.05)。與WT-Ctrl和Rnd3+/--Ctrl組對比,Rnd3+/--DM在各時點均顯示了顯著的下降趨勢(P<0.05),見圖2。

    Figure 2.Insufficient expression of Rnd3 promoted the inhibitory effect of diabetes on the viability of EPCs.Mean±SD.n=3-6.*P<0.05,**P<0.01 vs WT-DMgroup;#P<0.05,##P<0.01 vs WT-Ctrl group.圖2 Rnd3表達不足促進了糖尿病對EPCs活性的抑制效應

    3 糖尿病狀態(tài)下Rnd3基因敲除改變EPCs中細胞凋亡相關蛋白的表達

    使用Western blot檢測各組EPCs中凋亡相關蛋白Bcl-2和caspase-3的表達,結果如圖3所示。凋亡抑制蛋白Bcl-2在Rnd3+/--Ctrl組與Rnd3+/--DM組相較于WT-Ctrl組EPCs中的表達都表現(xiàn)為下降,而促進凋亡蛋白總caspase-3則表達上調(P<0.05,P<0.01)。本研究中未檢測活化的caspase-3蛋白。

    Figure 3.Insufficient expression of Rnd3 changed the expression of apoptosis-related proteins in EPCs from diabetic rats.Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01 vs WT-Ctrl group;#P<0.05 vs WT-DM group.圖3 Rnd3表達不足改變了糖尿病對EPCs凋亡相關蛋白的表達

    4 糖尿病狀態(tài)下Rnd3敲除抑制EPCs的細胞遷移能力

    Transwell小室遷移實驗結果顯示(圖4),相對于WT-Ctrl組,WT-DM和Rnd3+/--Ctrl組穿過PVDF膜的細胞數(shù)明顯下降(P<0.05);與Rnd3+/--Ctrl組對比,Rnd3+/--DM組遷移能力進一步下降(P<0.05)。

    5 糖尿病狀態(tài)下Rnd3敲除抑制EPCs分泌VEGF

    應用ELISA檢測各組EPC釋放至培養(yǎng)液上清中VEGF濃度的結果顯示,與WT-Ctrl組相比較,WTDM組和Rnd3+/--Ctrl組EPCs釋放VEGF水平均明顯減弱,提示糖尿病和Rnd3表達減弱均顯著抑制了EPCs釋放VEGF;與Rnd3+/--Ctrl組相比,Rnd3+/--DM組3 d時VEGF濃度與Rnd3+/--Ctrl組相似,均處于與0 d時相似的基線水平,已無進一步下調的空間(圖5)。

    6 糖尿病狀態(tài)下Rnd3敲除減弱了EPCs的血管樣結構形成能力

    成管實驗結果顯示,糖尿病顯著抑制了EPCs的血管樣結構形成能力,而Rnd3敲除則進一步加劇了糖尿病對EPCs血管樣結構形成能力的抑制效應(圖6)。

    討 論

    Figure 4.Defects in Rnd3 expression amplified the inhibitory effect of diabetes on the migration of EPCs.The scale bar=200μm.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs WT-Ctrl group;#P<0.05 vs Rnd3+/--Ctrl group.圖4 Rnd3敲除放大了糖尿病對EPCs遷移的抑制效應

    Figure 5.Insufficient expression of Rnd3 deteriorated the inhibitory effect of diabetes on the secretion of VEGF in EPCs(2×105 cells).Mean±SD.n=6.**P<0.01 vs WT-Ctrl group;##P<0.01 vs WT-DMgroup;△△P<0.01 vs day 0.圖5 Rnd3敲除惡化了糖尿病對EPCs中VEGF分泌的抑制作用

    Figure 6.Insufficient expression of Rnd3 deteriorated the inhibitory effect of diabetes on the ability of EPCs to form tube-like structures.The scale bar=200μm.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs WT-Ctrl group;#P<0.05 vs Rnd3+/--Ctrl group;△P<0.05 vs WT-DMgroup.圖6 Rnd3敲除惡化了糖尿病對EPCs血管樣結構形成能力

    血管內皮細胞功能紊亂是糖尿病血管并發(fā)癥的根本原因。糖尿病傷口局部血管新生及傷口愈合與EPCs的數(shù)量及功能密切相關[19-20]。已經(jīng)證實,無論是I型糖尿病還是II型糖尿病患者,其外周血EPCs的數(shù)量和血管生成功能均顯著下降[21-22],但相關的機制仍不明確。因而,明確糖尿病患者EPCs數(shù)量減少及功能受損的機制,從而尋找合適靶點來改善患者自體EPCs增殖和遷移等功能,并提高其分泌促血管新生因子的能力,可能為將來EPCs移植治療糖尿病缺血性心血管病提供重要的理論基礎。

    預實驗發(fā)現(xiàn),糖尿病狀態(tài)下野生型EPCs要比正常狀態(tài)下EPCs中Rnd3蛋白的表達減少(未發(fā)表資料),同時鑒于前期觀察到Rnd3表達不足后顯著抑制了心肌梗死后的血管生成能力[15],我們設想Rnd3不足也可能影響了EPCs的功能。為此,本研究基于CRISPR/Cas9技術編輯了大鼠Rnd3基因,獲得Rnd3基因敲除后的雜合子和WT鼠,復制了糖尿病模型,分離了骨髓源性EPCs,首次探索Rnd3不足對EPCs一般生物學特性的影響。實驗結果顯示,糖尿病狀態(tài)明顯減弱了野生型SD大鼠骨髓源性EPCs的活力、遷移和旁分泌VEGF能力,促進細胞凋亡的蛋白表達增加,功能上表現(xiàn)為成血管能力的削弱。這些結果與既往的他人報道的有關糖尿病損傷EPCs的基本生物學功能的結果高度一致[23-25]。本實驗發(fā)現(xiàn)Rnd3表達與既往Chun等[14]的報道的在糖尿病患者骨骼肌中Rnd3表達上調的結果相反,其原因可能為Chun等[14]的報道納入對象為消瘦非糖尿病、肥胖非糖尿病和肥胖伴糖尿病三類人群,肥胖伴糖尿病者與消瘦非糖尿病人群對比,組織中Rnd3表達是升高的;而本研究構建的糖尿病大鼠是消瘦狀態(tài)。兩者實驗對象的差異可能是Rnd3表達趨勢相反的根本原因。本研究中我們首次發(fā)現(xiàn),Rnd3表達不足明顯的增加了糖尿病對EPCs上述活力、遷移、旁分泌和血管生成等一般生物學特性的負性影響作用,但相關機制尚不明確。

    Rnd3是缺乏GTP水解活性的非典型Rho GTP酶,該分子具有多種細胞生物學功能,在細胞增殖、周期、凋亡、遷移、極性化及分化中發(fā)揮重要作用[26-28]。Rnd3不足可影響HIF-1α的穩(wěn)定性而直接抑制HIF-1α下游靶基因VEGF的表達[15]。Rnd3缺陷也可通過影響p65和p50的穩(wěn)定性而促進NF-κB信號的活化[29]。早期的報道顯示糖尿病心肌組織中HIF-1α表達下調而NF-κB信號是活化的[30-31],由此,我們猜測本研究發(fā)現(xiàn)的Rnd3不足導致EPCs相應生物學功能的缺陷很可能也與HIF-1α和NF-κB信號的異常活化有關。生物信息學分析表明,大鼠Rnd3基因啟動子-2010~120 bp上具有3個低氧反應元件,我們猜測Rnd3與HIF-1α之間極有可能形成信號調控反饋環(huán)路。因此很可能糖尿病時此調控反饋環(huán)路異常調節(jié)是Rnd3參與調控EPCs生物學特性的重要機制之一,但這一猜測還需進一步研究來證實。

    總之,本研究基于Rnd3基因編輯大鼠成功復制了II型糖尿病模型,首次發(fā)現(xiàn)Rnd3表達不足促進了糖尿病對骨髓源性EPCs的活力、遷移、血管生成能力的負性影響,因而維持Rnd3表達在防止糖尿病血管并發(fā)癥上具有潛在的靶向干預價值。本研究未做EPCs純度分析,不能排除其中含有其他細胞的可能和由此對結果可靠性和結論可信度的影響。盡管為了保證EPC的質量,我們在實際操作中是盡量用前2代細胞,以上結論仍需更多實驗加以驗證。

    猜你喜歡
    骨髓培養(yǎng)基血管
    Ancient stone tools were found
    宮頸癌術后調強放療中骨髓抑制與骨髓照射劑量體積的關系
    贊美骨髓
    文苑(2018年18期)2018-11-08 11:12:42
    血管里的河流
    西江月(2018年5期)2018-06-08 05:47:42
    最傷血管的六件事
    海峽姐妹(2017年5期)2017-06-05 08:53:17
    骨髓穿刺涂片聯(lián)合骨髓活檢切片在骨髓增生異常綜合征診斷中的應用
    蛹蟲草液體發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選
    各種培養(yǎng)基制作應注意的幾個事項
    KBM581培養(yǎng)基:人T細胞誘導與擴增培養(yǎng)基應用指南
    血管
    中國水利(2015年14期)2015-02-28 15:14:16
    久久中文字幕一级| 1024视频免费在线观看| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 日日爽夜夜爽网站| 亚洲色图综合在线观看| 看免费av毛片| 亚洲精品国产色婷婷电影| 亚洲精品久久午夜乱码| 最新在线观看一区二区三区| 精品熟女少妇八av免费久了| 亚洲伊人久久精品综合| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 国产成人a∨麻豆精品| 欧美人与性动交α欧美软件| 国产精品熟女久久久久浪| 动漫黄色视频在线观看| 丝袜喷水一区| 18禁国产床啪视频网站| 蜜桃在线观看..| 亚洲视频免费观看视频| 人妻一区二区av| 久久精品人人爽人人爽视色| 天堂中文最新版在线下载| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 亚洲综合色网址| 多毛熟女@视频| 在线观看免费高清a一片| 国产成人欧美| 久久精品人人爽人人爽视色| 十分钟在线观看高清视频www| 国产精品一区二区免费欧美 | 国产亚洲欧美在线一区二区| 久久狼人影院| 在线观看一区二区三区激情| 少妇精品久久久久久久| 日本黄色日本黄色录像| 亚洲黑人精品在线| 久久精品久久久久久噜噜老黄| av天堂久久9| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 动漫黄色视频在线观看| 亚洲专区字幕在线| 色老头精品视频在线观看| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 一级毛片电影观看| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 十分钟在线观看高清视频www| 国产成人啪精品午夜网站| 91老司机精品| 一区二区三区乱码不卡18| 一级黄色大片毛片| 欧美日韩黄片免| 亚洲成人免费av在线播放| 国产精品久久久人人做人人爽| 久久久水蜜桃国产精品网| 国产有黄有色有爽视频| 久久精品成人免费网站| 热99re8久久精品国产| 免费av中文字幕在线| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 一区二区三区乱码不卡18| 动漫黄色视频在线观看| 婷婷成人精品国产| 一级毛片女人18水好多| 99国产精品99久久久久| 国产精品一区二区精品视频观看| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 久久久国产欧美日韩av| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 成年人黄色毛片网站| 99香蕉大伊视频| 国产精品免费大片| 91精品伊人久久大香线蕉| 精品福利观看| 嫩草影视91久久| 国产一卡二卡三卡精品| 天天添夜夜摸| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 色婷婷av一区二区三区视频| 两个人看的免费小视频| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 亚洲三区欧美一区| 少妇精品久久久久久久| 久久中文看片网| 久久中文字幕一级| 男人操女人黄网站| 亚洲精品国产一区二区精华液| av国产精品久久久久影院| 色老头精品视频在线观看| 男人舔女人的私密视频| 亚洲第一av免费看| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 亚洲av美国av| 午夜福利一区二区在线看| 欧美激情 高清一区二区三区| www.av在线官网国产| 男女之事视频高清在线观看| a在线观看视频网站| 99热网站在线观看| 国产精品欧美亚洲77777| 看免费av毛片| www日本在线高清视频| 超碰97精品在线观看| 新久久久久国产一级毛片| 另类亚洲欧美激情| 丝袜美腿诱惑在线| 中文字幕色久视频| 99国产精品一区二区三区| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 母亲3免费完整高清在线观看| 美女扒开内裤让男人捅视频| 又紧又爽又黄一区二区| 亚洲精品美女久久av网站| 69精品国产乱码久久久| 搡老熟女国产l中国老女人| 91成人精品电影| 精品国产乱码久久久久久男人| 午夜福利免费观看在线| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 日韩免费高清中文字幕av| 亚洲成人免费av在线播放| 性色av乱码一区二区三区2| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 中文字幕精品免费在线观看视频| 美女午夜性视频免费| 国产免费福利视频在线观看| 国产男人的电影天堂91| 国产精品国产三级国产专区5o| 人妻一区二区av| 波多野结衣一区麻豆| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 男男h啪啪无遮挡| 欧美国产精品va在线观看不卡| 久久久久久免费高清国产稀缺| 国产野战对白在线观看| 亚洲国产精品999| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 亚洲美女黄色视频免费看| 亚洲免费av在线视频| 成人影院久久| 超碰成人久久| 18禁观看日本| 久久亚洲国产成人精品v| 免费观看av网站的网址| 成人手机av| 婷婷丁香在线五月| 一级毛片精品| 久久人人爽人人片av| 亚洲国产看品久久| 99国产综合亚洲精品| 国产熟女午夜一区二区三区| 正在播放国产对白刺激| 曰老女人黄片| 国产野战对白在线观看| videosex国产| 99精品久久久久人妻精品| 午夜久久久在线观看| 我要看黄色一级片免费的| 午夜精品国产一区二区电影| 国产精品二区激情视频| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 欧美乱码精品一区二区三区| 久久久久久久大尺度免费视频| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 国产黄色免费在线视频| 美女扒开内裤让男人捅视频| 欧美 亚洲 国产 日韩一| av线在线观看网站| 国产三级黄色录像| 久9热在线精品视频| 亚洲情色 制服丝袜| 亚洲专区国产一区二区| 国产成人系列免费观看| 最近中文字幕2019免费版| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 91老司机精品| 亚洲五月色婷婷综合| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 天堂中文最新版在线下载| 最新在线观看一区二区三区| 日韩免费高清中文字幕av| 国产在线一区二区三区精| av有码第一页| 最黄视频免费看| 亚洲 欧美一区二区三区| 亚洲精品第二区| 免费少妇av软件| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 99精品久久久久人妻精品| 久久久久久久精品精品| 婷婷成人精品国产| 高清视频免费观看一区二区| 嫁个100分男人电影在线观看| www.熟女人妻精品国产| av免费在线观看网站| 精品视频人人做人人爽| 黄频高清免费视频| 一本色道久久久久久精品综合| 人妻人人澡人人爽人人| 新久久久久国产一级毛片| 黄色视频,在线免费观看| 亚洲伊人久久精品综合| netflix在线观看网站| 国产在线一区二区三区精| 精品久久久久久久毛片微露脸 | 又黄又粗又硬又大视频| 欧美日韩亚洲高清精品| 欧美激情 高清一区二区三区| 久久精品成人免费网站| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 精品福利观看| 人妻 亚洲 视频| 男女下面插进去视频免费观看| 精品欧美一区二区三区在线| www日本在线高清视频| 青春草视频在线免费观看| 最近最新中文字幕大全免费视频| 大码成人一级视频| 色老头精品视频在线观看| 精品视频人人做人人爽| 久久免费观看电影| 男女高潮啪啪啪动态图| 久久人人爽人人片av| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 亚洲五月婷婷丁香| 黑人欧美特级aaaaaa片| 韩国高清视频一区二区三区| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 交换朋友夫妻互换小说| 2018国产大陆天天弄谢| a级毛片黄视频| 久热这里只有精品99| 亚洲黑人精品在线| 男女高潮啪啪啪动态图| 国产精品一二三区在线看| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | a在线观看视频网站| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 欧美日韩黄片免| 色94色欧美一区二区| 日本vs欧美在线观看视频| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | avwww免费| 精品免费久久久久久久清纯 | 亚洲精品美女久久av网站| 日韩有码中文字幕| 午夜福利视频精品| 国产高清视频在线播放一区 | 午夜免费鲁丝| 亚洲中文字幕日韩| 国产91精品成人一区二区三区 | 精品国产一区二区久久| 亚洲国产欧美网| 免费在线观看影片大全网站| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 免费av中文字幕在线| 咕卡用的链子| 波多野结衣av一区二区av| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 国产麻豆69| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 午夜影院在线不卡| 国产精品 国内视频| 黑人欧美特级aaaaaa片| 丰满饥渴人妻一区二区三| 在线永久观看黄色视频| 超色免费av| 久久久精品94久久精品| 欧美成人午夜精品| 十八禁网站免费在线| 麻豆国产av国片精品| 9191精品国产免费久久| av在线老鸭窝| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 国产黄色免费在线视频| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 国产xxxxx性猛交| 中文字幕人妻熟女乱码| 999久久久精品免费观看国产| 欧美精品一区二区大全| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 国产高清videossex| 一个人免费看片子| av片东京热男人的天堂| av线在线观看网站| 精品国产一区二区久久| 欧美+亚洲+日韩+国产| 在线观看免费日韩欧美大片| 99久久综合免费| 国产日韩欧美在线精品| 老鸭窝网址在线观看| 国产精品 欧美亚洲| 国产视频一区二区在线看| 日韩三级视频一区二区三区| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 又黄又粗又硬又大视频| 国产主播在线观看一区二区| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 久久久久久久精品精品| av天堂在线播放| 天天操日日干夜夜撸| 欧美久久黑人一区二区| 老熟妇仑乱视频hdxx| 亚洲九九香蕉| 多毛熟女@视频| 久久久久久久大尺度免费视频| 欧美xxⅹ黑人| 黄色a级毛片大全视频| 丁香六月天网| 一级片免费观看大全| 色视频在线一区二区三区| 亚洲全国av大片| 在线看a的网站| av天堂久久9| 国产精品影院久久| 中文字幕人妻丝袜制服| 青春草亚洲视频在线观看| 成年av动漫网址| 69av精品久久久久久 | 99国产精品99久久久久| 成年动漫av网址| 操出白浆在线播放| 亚洲一区中文字幕在线| 99re6热这里在线精品视频| 精品久久久久久电影网| 下体分泌物呈黄色| 久久久水蜜桃国产精品网| 日韩大片免费观看网站| 亚洲欧美激情在线| 成人亚洲精品一区在线观看| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 国产精品久久久久久精品古装| 亚洲性夜色夜夜综合| 国产片内射在线| 久久人人97超碰香蕉20202| 国产成人精品久久二区二区91| 天堂8中文在线网| 国产野战对白在线观看| 又大又爽又粗| 午夜91福利影院| 18禁国产床啪视频网站| 两人在一起打扑克的视频| 一级黄色大片毛片| 欧美激情高清一区二区三区| 制服人妻中文乱码| 国产精品影院久久| 这个男人来自地球电影免费观看| 99国产精品99久久久久| 国产主播在线观看一区二区| 黄色片一级片一级黄色片| 9热在线视频观看99| 国产精品.久久久| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 亚洲av欧美aⅴ国产| 午夜福利视频精品| 另类亚洲欧美激情| 婷婷丁香在线五月| 黄色 视频免费看| 大型av网站在线播放| 中文字幕av电影在线播放| 男人添女人高潮全过程视频| 久久久国产成人免费| 国产精品久久久久久精品电影小说| 99国产精品免费福利视频| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 亚洲三区欧美一区| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 国产一区有黄有色的免费视频| 成人黄色视频免费在线看| 欧美国产精品va在线观看不卡| 亚洲精品美女久久av网站| 美女扒开内裤让男人捅视频| 黄色 视频免费看| 亚洲黑人精品在线| 亚洲av片天天在线观看| 他把我摸到了高潮在线观看 | 欧美另类亚洲清纯唯美| 婷婷色av中文字幕| cao死你这个sao货| 亚洲av片天天在线观看| 亚洲av美国av| 欧美一级毛片孕妇| 亚洲精品中文字幕在线视频| 国产福利在线免费观看视频| 久久 成人 亚洲| 亚洲视频免费观看视频| 两人在一起打扑克的视频| 999精品在线视频| 亚洲精品中文字幕一二三四区 | 老司机影院成人| 女性生殖器流出的白浆| 中国国产av一级| 久久国产精品男人的天堂亚洲| a级毛片在线看网站| 色播在线永久视频| 欧美久久黑人一区二区| 亚洲五月色婷婷综合| 香蕉丝袜av| 亚洲中文日韩欧美视频| 国产成人啪精品午夜网站| 欧美日韩精品网址| 亚洲精品中文字幕一二三四区 | 国产欧美日韩一区二区三区在线| 在线永久观看黄色视频| 成人影院久久| 欧美激情 高清一区二区三区| 精品欧美一区二区三区在线| 丁香六月天网| 国产男人的电影天堂91| 精品亚洲成a人片在线观看| 99久久精品国产亚洲精品| 嫩草影视91久久| 国产精品秋霞免费鲁丝片| av线在线观看网站| 欧美黄色淫秽网站| 欧美在线黄色| 亚洲成国产人片在线观看| 国产又爽黄色视频| 一级毛片电影观看| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 成人影院久久| 国产欧美亚洲国产| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 亚洲性夜色夜夜综合| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 免费观看人在逋| 国产精品久久久久成人av| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 日韩 亚洲 欧美在线| 日韩大码丰满熟妇| 成人av一区二区三区在线看 | 国产一区有黄有色的免费视频| 少妇的丰满在线观看| 美女中出高潮动态图| svipshipincom国产片| 欧美变态另类bdsm刘玥| 91老司机精品| 成人亚洲精品一区在线观看| 欧美人与性动交α欧美软件| 久久99一区二区三区| 日韩 亚洲 欧美在线| 一区二区三区精品91| 悠悠久久av| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 亚洲少妇的诱惑av| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 国产亚洲欧美在线一区二区| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 香蕉丝袜av| 一区二区三区四区激情视频| 极品少妇高潮喷水抽搐| 国产一区二区三区综合在线观看| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 亚洲精品自拍成人| 高清在线国产一区| 亚洲国产精品成人久久小说| 一个人免费看片子| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 咕卡用的链子| 999精品在线视频| a级毛片黄视频| 美女午夜性视频免费| 亚洲欧美精品自产自拍| av网站免费在线观看视频| 国产一区二区三区av在线| 免费不卡黄色视频| 美女福利国产在线| 欧美+亚洲+日韩+国产| 母亲3免费完整高清在线观看| 亚洲国产av影院在线观看| 激情视频va一区二区三区| 最黄视频免费看| 亚洲少妇的诱惑av| 欧美另类一区| 国产一区二区三区综合在线观看| 国产成+人综合+亚洲专区| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 国产成人欧美| 在线av久久热| 欧美变态另类bdsm刘玥| 久久 成人 亚洲| 精品国产乱码久久久久久男人| a 毛片基地| 国产精品偷伦视频观看了| 纯流量卡能插随身wifi吗| 亚洲精品乱久久久久久| 1024香蕉在线观看| 国产免费视频播放在线视频| 精品免费久久久久久久清纯 | 欧美大码av| 欧美激情极品国产一区二区三区| 国产成+人综合+亚洲专区| 视频在线观看一区二区三区| 欧美日韩亚洲高清精品| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 欧美另类一区| 国产一区二区激情短视频 | 国产黄频视频在线观看| 国产深夜福利视频在线观看| 国产男女内射视频| 日本黄色日本黄色录像| 亚洲欧美清纯卡通| 超色免费av| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 精品少妇黑人巨大在线播放| 咕卡用的链子| 日韩大码丰满熟妇| 午夜免费成人在线视频| 男女高潮啪啪啪动态图| 久久精品人人爽人人爽视色| av免费在线观看网站| 最黄视频免费看| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 两个人看的免费小视频| 成在线人永久免费视频| 国产精品免费视频内射| 国产成人av教育| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 国产精品一区二区免费欧美 | 又紧又爽又黄一区二区| 99久久国产精品久久久| 久久久精品免费免费高清| 在线观看免费高清a一片| 狠狠狠狠99中文字幕| 不卡一级毛片| 一本色道久久久久久精品综合| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 最新的欧美精品一区二区| av线在线观看网站| av天堂久久9| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 久久人人爽人人片av| 色婷婷av一区二区三区视频| 亚洲视频免费观看视频| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 男女边摸边吃奶| 成人国产一区最新在线观看| √禁漫天堂资源中文www| 国产亚洲欧美在线一区二区| 水蜜桃什么品种好| 亚洲国产av影院在线观看| 欧美午夜高清在线| 久久精品国产综合久久久| 亚洲av国产av综合av卡| av天堂在线播放| 国产人伦9x9x在线观看| 大陆偷拍与自拍| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久 | 午夜两性在线视频| 99热网站在线观看| 久久av网站| 热99国产精品久久久久久7| 黄色 视频免费看| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 日韩欧美一区视频在线观看| 国产成人免费无遮挡视频| 欧美在线一区亚洲| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 国产一区二区激情短视频 | 视频区图区小说| 国产免费av片在线观看野外av| 国产成人a∨麻豆精品| 18在线观看网站| 在线观看人妻少妇| 青青草视频在线视频观看| 久久精品国产亚洲av高清一级| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| av网站在线播放免费| 视频区欧美日本亚洲| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 99re6热这里在线精品视频| 国产精品熟女久久久久浪| 99热国产这里只有精品6| 考比视频在线观看| 一本久久精品| 亚洲熟女精品中文字幕| 美女中出高潮动态图| 亚洲成人手机| 又大又爽又粗| 涩涩av久久男人的天堂| 久久久久久久久免费视频了| 日本a在线网址| 纯流量卡能插随身wifi吗| 伦理电影免费视频| 香蕉丝袜av| 久久久久久人人人人人| av网站在线播放免费| 90打野战视频偷拍视频| 亚洲中文字幕日韩| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 日韩三级视频一区二区三区| 97人妻天天添夜夜摸| 色婷婷av一区二区三区视频| 在线精品无人区一区二区三| 欧美日韩av久久| 亚洲国产av影院在线观看| 日本精品一区二区三区蜜桃| 日韩免费高清中文字幕av| 国产熟女午夜一区二区三区| 少妇被粗大的猛进出69影院| 无限看片的www在线观看| 久久久国产成人免费| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 各种免费的搞黄视频| 岛国毛片在线播放| 亚洲精品第二区|