靜脈注射SCAD重組腺病毒減輕自發(fā)性高血壓大鼠心肌肥厚和纖維化*

馮靜韻，廖英勤，鐘小藝，蘇永少，馬智超，秦 學(xué)，潘雪刁，劉培慶，路 靜，周四桂△

（1廣東藥科大學(xué)藥學(xué)院臨床藥學(xué)系，廣東廣州510006；2中山大學(xué)藥學(xué)院藥理與毒理學(xué)實驗室，廣東廣州510006）

心臟是長期高血壓主要損傷的靶器官之一，主要表現(xiàn)為左心室結(jié)構(gòu)改變和重構(gòu)，最終導(dǎo)致心力衰竭的發(fā)生［1-2］。心肌肥厚和纖維化是心臟重構(gòu)的重要病理變化［3］。心臟重構(gòu)代償期的主要特點是心肌細(xì)胞增大，蛋白質(zhì)合成增強，細(xì)胞外基質(zhì)積累，胎兒心臟基因程序激活［4-5］。臨床上主要使用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、血管緊張素受體拮抗劑、β受體阻斷劑、鈣通道阻斷劑和降低鈉負(fù)荷等方法進行降血壓治療，雖然在一定程度上延緩了高血壓心肌肥厚和纖維化的發(fā)生發(fā)展，但并未明顯延緩心力衰竭進程［6］。因此，尋找抑制心肌肥厚和纖維化發(fā)生發(fā)展的藥物，從而防治心力衰竭具有十分重要的意義和價值。

短鏈脂酰輔酶A脫氫酶（short-chain acly-coenzyme A dehydrogenase，SCAD）是脂酰輔酶A脫氫酶家族中一員，可特異性分解短鏈脂酰輔酶A，是脂肪酸β氧化的第1個限速酶［7-8］。我們首次發(fā)現(xiàn)SCAD的表達在自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）肥厚和纖維化的心肌中明顯下調(diào)［9］。利用小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）技術(shù)敲減原代心肌細(xì)胞及心肌成纖維細(xì)胞SCAD表達，均可引起心肌細(xì)胞病理性肥大、心肌成纖維細(xì)胞增殖及膠原合成顯著增加，表明SCAD對心肌肥厚和纖維化具有負(fù)性調(diào)控作用［10-11］。本課題組前期研究表明尾靜脈注射SCAD重組腺病毒（SCAD recombinant adenovirus，Ad-SCAD）能逆轉(zhuǎn)SHR高血壓血管重構(gòu)［12］。黃素腺嘌吟二核苷酸（SCAD的輔酶）通過激活SCAD從而有效減輕SHR心肌肥厚和纖維化［13］。然而Ad-SCAD對SHR心肌肥厚和纖維化是否具有治療作用尚不清楚。本研究以SHR作為高血壓心肌肥厚和纖維化模型，采用尾靜脈注射Ad-SCAD的方式，探討SCAD過表達對SHR心臟功能和線粒體能量代謝的影響。

材料和方法

1 動物

18只雄性Wistar大鼠，12周齡，購自南方醫(yī)科大學(xué)動物中心，許可證號為SYXK（粵）2016-0041；18只雄性SHR，12周齡，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號為SCXK（京）2016-0006。

2 主要試劑

Ad-SCAD和GFP載體腺病毒（Ad-GFP）購自漢恒生物技術(shù)（上海）有限公司；SYBR Green Real-time PCR Master Mix（DRR420S）購自TaKaRa；兔抗SCAD單克隆抗體（Abcam；1∶1 000）；鼠抗GAPDH單克隆抗體（ProteinTech；1∶10 000）；兔Ⅱ抗/鼠Ⅱ抗（Sigma；1∶10 000）；SCAD酶活性試劑盒購自上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司；羥脯氨酸測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；ATP檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司；大鼠游離脂肪酸ELISA檢測試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。所用引物由上海生工生物工程股份有限公司根據(jù)設(shè)計合成，見表1。

3 主要方法

3.1 實驗分組按隨機數(shù)字表法將動物分為4組（n=9）：正常GFP陰性對照（Wistar+Ad-GFP）組、心肌肥厚和纖維化模型GFP陰性對照（SHR+Ad-GFP）組、正常Ad-SCAD給藥（Wistar+Ad-SCAD）組及心肌肥厚和纖維化模型Ad-SCAD給藥（SHR+Ad-SCAD）組。Ad-SCAD和Ad-GFP給藥劑量均為5×1013viral particles·L-1·d-1，持續(xù)8周。

3.2 超聲心動圖以異氟烷麻醉各組大鼠，采用Vevo 2100超高分辨率小動物彩色超聲多普勒成像系統(tǒng)實時監(jiān)測大鼠心功能變化，記錄大鼠心臟實時圖。取乳頭肌切面，探頭頻率為40 MHz。在二維超聲引導(dǎo)下取M超曲線，測定以下指標(biāo)：舒張末期左室前壁厚度（left ventricular anterior wall thickness at end-diastole，LVAWd）、收縮末期左室前壁厚度（left ventricular anterior wall thickness at end-systole，LVAWs）、舒張末期左室后壁厚度（left ventricular posterior wall thickness at end-diastole，LVPWd）、收縮末期左室后壁厚度（left ventricular posterior wall thickness at end-systole，LVAWs）、左室舒張末期容積（left ventricular end-diastolic volume，LVEDV）、左室收縮末期容積（left ventricular end-systolic volume，LVESV）、左心室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular internal dimension at end-diastole，LVIDd）、左心室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular internal dimension at end-systole，LVIDs）、左心室射血分?jǐn)?shù)（ejection fraction，EF）和左心室縮短率（fractional shortening，F(xiàn)S）。

表1 引物序列Table 1.The sequences of the primers for RT-qPCR

3.3 動物取材異氟烷麻醉各組大鼠，腹主動脈取血，靜置分離血清，液氮處理后-80℃保存。心臟主動脈灌注后取出心臟。部分心臟經(jīng)4%多聚甲醛固定進行石蠟包埋切片，部分心臟組織分裝、液氮處理后-80℃保存為進行后續(xù)實驗。

3.4 大鼠收縮壓及左室重量指數(shù)的測定采用無創(chuàng)血壓儀（CA-DA Monitor，KENT）測定各組大鼠尾動脈收縮壓，Ad-SCAD尾靜脈給藥前測量1次，之后每2周測量1次，直至第8周結(jié)束。取出心臟后，縱切，去除心房及心臟附件，濾紙吸干表面PBS，精密稱取心臟重量，左室重量（left ventricular weight，LVW）與體重（body weight，BW）的比值作為左室重量指數(shù)。

3.5 心肌組織的形態(tài)學(xué)檢測取出心臟后，心尖與左心耳中點連線縱切，濾紙吸干表面水分，心臟正面觀部分用4%多聚甲醛固定后石蠟包埋切片，進行SCAD熒光單標(biāo)染色、HE染色、麥胚凝集素（wheat germ agglutinin，WGA）染色和天狼星紅染色。天狼星紅染色后心肌纖維呈淡黃色，膠原纖維呈紅色，用于判斷大鼠心臟是否出現(xiàn)心肌纖維化及心肌纖維化的程度。

3.6 SCAD酶活性的檢測取材后液氮速凍后-80℃保存，第2天進行檢查。采用酶標(biāo)儀測定法檢測SCAD酶活性。實驗具體步驟嚴(yán)格依據(jù)SCAD酶活性檢測試劑盒說明書。

3.7 羥脯氨酸含量的測定采用經(jīng)典酸水解法測定羥脯氨酸含量。實驗具體步驟嚴(yán)格依據(jù)羥脯氨酸測定試劑盒說明書。

3.8 ATP含量的測定根據(jù)螢光酶素催化螢光素發(fā)光需要ATP提供能量的原理，檢測心臟組織勻漿液的ATP濃度。實驗具體步驟嚴(yán)格依據(jù)ATP檢測試劑盒說明書。

3.9 游離脂肪酸含量的檢測利用雙抗體夾心法測定大鼠心肌組織和血清的游離脂肪酸含量。實驗具體步驟嚴(yán)格依據(jù)試劑盒說明書。

3.10 Western blot分析根據(jù)組織大小加入適量裂解液，使570 nm下總蛋白吸光度在1.0左右，定量60～80μg，配制10%SDS-PAGE凝膠。電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉90 min，Ⅰ抗4℃孵育過夜，Ⅱ抗室溫孵育1 h，采用化學(xué)發(fā)光成像儀進行顯影。

3.11 RT-qPCR利用Trizol裂解法提取心肌中總RNA，通過紫外吸收測定法測定RNA在波長260 nm和280 nm的吸收值，獲得RNA的濃度并通過A260/A280及A260/A230值判斷RNA的純度。采用RT-PCR試劑盒（TaKaRa）去除gDNA后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)SYBR Green試劑盒說明書配制反應(yīng)體系，進行cDNA的擴增和檢測。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)的統(tǒng)計和分析均使用SPSS 21.0統(tǒng)計分析軟件。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。多組間比較采用單因素方差分析及Tukey′st檢驗進行兩兩比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組大鼠心肌SCAD蛋白和mRNA表達水平及酶活性的變化

如圖1所示，與Wistar+Ad-GFP組相比，SHR+Ad-GFP組SCAD蛋白和mRNA表達水平及酶活性顯著降低（P＜0.01），SCAD免疫熒光強度顯著減弱（P＜0.01），Wistar+Ad-SCAD組SCAD蛋白和mRNA表達水平及酶活性顯著升高（P＜0.01）；與SHR+Ad-GFP組相比，SHR+Ad-SCAD組SCAD蛋白和mRNA表達水平和酶活性顯著升高（P＜0.01），SCAD免疫熒光強度顯著增強（P＜0.01）。這表明Ad-SCAD尾靜脈注射8周，SCAD基因成功轉(zhuǎn)染進入大鼠心臟并出現(xiàn)過表達。

Figure 1.Comparison of SCAD expression and activity in the rats with different treatments.A：the protein expression of SCAD；B：the mRNA expression of SCAD；C：SCAD activity；D：left ventricular SCAD expression measured by immunofluorescence staining.Mean±SD.n=9.**P＜0.01 vs Wistar+Ad-GFPgroup；##P＜0.01 vs SHR+Ad-GFPgroup.圖1 各組大鼠心肌SCAD含量與酶活性的變化

2 各組大鼠收縮壓及左室重量指數(shù)的比較

研究表明12周齡的SHR大鼠已經(jīng)出現(xiàn)心肌肥厚和纖維化，可作為心肌肥厚和纖維化疾病模型［13-14］。如圖2A所示，與12周齡的Wistar+Ad-GFP組大鼠比較，同周齡的SHR+Ad-GFP組大鼠收縮壓顯著升高；連續(xù)給藥8周后，與SHR+Ad-GFP組相比，SHR+Ad-SCAD組收縮壓持續(xù)降低（P＜0.01）。慢性壓力過載導(dǎo)致的心肌肥厚以左心室肥厚為主，左心室重量增加是其主要表現(xiàn)，因此，采用左室重量指數(shù)（LVW/BW）來評價心肌肥厚情況。如圖2B所示，與Wistar+Ad-GFP組相比，SHR+Ad-GFP組左室重量指數(shù)顯著升高（P＜0.01）；與SHR+Ad-GFP組相比，SHR+Ad-SCAD組左室重量指數(shù)顯著降低（P＜0.01），表明Ad-SCAD能顯著減輕SHR心肌肥厚。

3 各組大鼠超聲心動圖的比較

如圖3所示，與Wistar+Ad-GFP組比較，SHR+Ad-GFP組LVAWd、LVAWs、LVPWd、LVPWs、EF和FS均顯著增大（P＜0.01），LVEDV、LVSDV、LVIDd和LVIDs均顯著減?。≒＜0.01），即左心室前、后壁出現(xiàn)明顯肥厚，左心室內(nèi)徑顯著減小，表明20周齡的SHR出現(xiàn)了明顯的向心性肥厚；與SHR+Ad-GFP組相比，SHR+Ad-SCAD組LVAWd、LVAWs、LVPWd、LVPWs、EF和FS均顯 著 減小，LVEDV、LVSDV、LVIDd和LVIDs均顯著增加（P＜0.01）。以上結(jié)果表明，Ad-SCAD通過上調(diào)心肌SCAD表達，顯著減輕了SHR心肌肥厚，改善了心臟舒張功能。

4 各組大鼠心臟HE和WGA染色及心肌肥厚標(biāo)志物mRNA表達水平的比較

Figure 2.Comparison of systolic blood pressure（A）and left ventricular mass index（B）of the rats in each group.Mean±SD.n=9.**P＜0.01 vs Wistar+Ad-GFPgroup；##P＜0.01 vs SHR+Ad-GFPgroup.圖2 各組大鼠收縮壓及左室重量指數(shù)的比較

Figure 3.Echocardiographic changes of the rats in each group.Mean±SD.n=9.**P＜0.01 vs Wistar+Ad-GFP group；##P＜0.01 vs SHR+Ad-GFPgroup.圖3 各組大鼠超聲心動圖的比較

為了進一步觀察大鼠左室心肌形態(tài)學(xué)改變，我們采用HE染色和WGA染色觀察大鼠左心室肥厚情況。如圖4所示，與Wistar+Ad-GFP組相比，SHR+Ad-GFP組發(fā)生了明顯的心肌肥厚，心室壁明顯增厚，心室腔顯著縮小，心肌細(xì)胞明顯增大，橫截面積顯著增加（P＜0.01），心肌肥厚標(biāo)志物心房鈉尿因子（atrial natriuretic factor，ANF）、腦鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）和β-肌球蛋白重鏈（β-myosin heavy chain，β-MHC）的mRNA表達水平均顯著增加（P＜0.01）；Ad-SCAD治療8周后，ANF、BNP和β-MHC的mRNA表達水平顯著下降（P＜0.01），心肌肥厚明顯減輕。

Figure 4.Hematoxylin-eosin（HE）staining（A），wheat germ agglutinin（WGA）staining（B and C）and mRNA levels of myocardial hypertrophy markers（D）of the rats in each group.Mean±SD.n=9.**P＜0.01 vs Wistar+Ad-GFP group；##P＜0.01 vs SHR+Ad-GFPgroup.圖4 各組大鼠心臟HE和WGA染色及心肌肥厚標(biāo)志物mRNA表達水平的比較

5 各組大鼠心臟天狼星紅染色、心肌羥脯氨酸含量及心肌纖維化標(biāo)志物mRNA表達水平的比較

如圖5所示，與Wistar+Ad-GFP組相比，SHR+Ad-GFP組心肌組織膠原纖維大量沉積（P＜0.01），羥脯氨酸含量顯著增加（P＜0.01），心肌纖維化標(biāo)志物I型膠原（collagen type I，Col I）、III型膠原（collagen type III，Col III）和α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）的mRNA表達水平均顯著增加（P＜0.01）；Ad-SCAD顯著減少了SHR心肌組織膠原纖維和羥脯氨酸含量（P＜0.01），下調(diào)了Col I、Col III和α-SMA的mRNA表達水平（P＜0.01）。這表明Ad-SCAD顯著抑制SHR心肌纖維化。

6 各組大鼠ATP及游離脂肪酸含量的比較

如圖6所示，與Wistar+Ad-GFP組相比，SHR+Ad-GFP組ATP含量顯著降低，心肌組織與血清游離脂肪酸含量均顯著升高（P＜0.01）；與SHR+Ad-GFP組相比，SHR+Ad-SCAD組ATP含量顯著升高，游離脂肪酸含量均顯著降低（P＜0.01）。這表明Ad-SCAD顯著增強心肌脂肪酸β氧化，增加心臟能量供應(yīng)，減少游離脂肪酸堆積。

Figure 5.Sirius red staining（A，B and C），cardiac hydroxyproline content（D）and mRNA levels of myocardial fibrosis markers（E）of the rats in each group.Mean±SD.n=9.**P＜0.01 vs Wistar+Ad-GFPgroup；##P＜0.01 vs SHR+Ad-GFPgroup.圖5 各組大鼠心臟天狼星紅染色、心肌羥脯氨酸含量及心肌纖維化標(biāo)志物mRNA表達水平的比較

Figure 6.Comparison of ATPand free fatty acid content of the rats in each group.A：ATPcontent；B：free fatty acid content in myocardium；C：free fatty acid content in serum.Mean±SD.n=9.**P＜0.01 vs Wistar+Ad-GFPgroup；##P＜0.01 vs SHR+Ad-GFPgroup.圖6 各組大鼠ATP含量和游離脂肪酸含量的比較

討 論

研究表明，病理性心肌肥厚是多種心血管疾病發(fā)生率和死亡率增加的獨立危險因素［15］。長期高血壓引起心臟慢性壓力過載，導(dǎo)致心臟發(fā)生適應(yīng)性重構(gòu)，進而發(fā)展為病理性心肌肥厚，最終導(dǎo)致心力衰竭發(fā)生［2］。心肌纖維化是高血壓心肌肥厚由代償期向失代償期轉(zhuǎn)變的重要病理過程，是引發(fā)心力衰竭的核心環(huán)節(jié)。

SHR具有高血壓遺傳背景，高血壓自發(fā)率為100%，與人類原發(fā)性高血壓疾病發(fā)展進程一致，伴隨大鼠周齡增加，其血壓不斷升高最終維持在200 mmHg以上。長期心臟壓力超負(fù)荷導(dǎo)致心臟結(jié)構(gòu)蛋白合成增多，左心室質(zhì)量增加、室壁增厚，進而發(fā)生心肌肥厚，病理性心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展往往伴隨著心肌纖維化［16-17］。因此，本研究采用SHR作為慢性壓力過載導(dǎo)致心肌肥厚和纖維化的動物模型。

大量證據(jù)表明，當(dāng)病理因素導(dǎo)致心肌肥厚時，心肌能源供給由脂肪酸的β氧化轉(zhuǎn)變?yōu)橐云咸烟墙徒鉃橹鳎葱募∧芰看x的“胚胎型再演”［18-20］。我們前期研究顯示，脂肪酸β氧化酶SCAD表達下調(diào)與心肌肥厚和纖維化發(fā)展密切相關(guān)［10，21-22］。此外，研究表明，自發(fā)性高血壓大鼠心臟的代謝變化先于心臟功能障礙和左心室肥大，2月齡SHR的心臟代謝產(chǎn)物分析顯示丙酮酸，脂肪?；椭ф湴被嵫苌娜鈮A含量升高，氧化應(yīng)激和炎癥明顯［23］。

腺病毒尾靜脈注射是可靠的心臟疾病研究基因給藥方式。有報道指出，使用腺相關(guān)病毒尾靜脈注射實現(xiàn)Ogdhl基因心臟過表達，從而改善心臟功能障礙［24］。通過尾靜脈注射腺相關(guān)病毒載體在心臟中過表達FGF23顯著加劇血管緊張素II誘導(dǎo)的心臟重塑［25］。腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的心臟AldoA體內(nèi)敲除挽救了異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心臟肥大［26］。為進一步明確SCAD在心肌肥厚和纖維化中的作用，本研究采用Ad-SCAD尾靜脈注射給藥方式，觀察SCAD過表達對SHR心肌肥厚和纖維化的影響。

本研究發(fā)現(xiàn)，SHR作為自發(fā)性心肌肥厚和纖維化的動物模型，采用Ad-SCAD尾靜脈注射治療8周，實現(xiàn)心肌SCAD過表達，能顯著降低SHR血壓與左心室重量指數(shù)，明顯減輕高血壓引起的心臟適應(yīng)性重構(gòu)、心肌細(xì)胞肥大與纖維化，減少膠原沉積。

心肌肥厚是對血流動力學(xué)壓力或心肌損傷的適應(yīng)性反應(yīng)，可使心臟滿足對氧的需求增加。心肌肥厚起初是有益的，但最終可導(dǎo)致心肌間質(zhì)纖維化增加和心室功能下降。代謝變化已成為病理性心肌重塑發(fā)展和進展的關(guān)鍵機制。由于心肌是高度氧化的組織，線粒體在維持心臟的最佳性能中起著核心作用［27］。SCAD作為線粒體脂肪酸β氧化第一步反應(yīng)的限速酶，對線粒體作用，心臟脂肪酸代謝和能量供應(yīng)起著重要作用。SHR經(jīng)尾靜脈注射Ad-SCAD后，SCAD酶活性顯著增加，ATP含量增高，游離脂肪酸含量減少，表明SCAD過表達促進了線粒體脂肪酸β氧化反應(yīng)。以上結(jié)果提示，Ad-SCAD減緩慢性壓力過載引起的心肌肥厚與纖維化發(fā)展進程，可能與SCAD對心臟能量代謝的積極調(diào)節(jié)作用和降低氧化應(yīng)激，進而抑制心肌細(xì)胞適應(yīng)性肥大及膠原產(chǎn)生和沉積的作用密切相關(guān)。

綜上所述，Ad-SCAD在心肌肥厚和纖維化治療中可能發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，為心肌肥厚和纖維化治療提供了一種新的治療策略。然而，SCAD過表達抑制心肌肥厚和纖維化的作用機制還有待進一步深入研究。