PGS/SF小口徑人工血管性能研究及體外細(xì)胞共培養(yǎng)

文/劉月

心血管疾病是世界上最普遍的疾病之一，腦血管、心血管和外周血管系統(tǒng)中血管直徑大多數(shù)小于6 mm[1]。

PGS有良好彈性和熱穩(wěn)定性，回彈性在99.5%以上，但是PGS的力學(xué)性能較低，降解速率較慢[2-3]，PGS到達(dá)一定溫度后會(huì)發(fā)生固化，可以通過(guò)調(diào)節(jié)固化溫度和固化時(shí)間來(lái)提高其力學(xué)性能。除此之外，還可以與其他材料復(fù)合來(lái)提高其機(jī)械性能。

本文是之前研究的延續(xù)，進(jìn)一步優(yōu)化了PGS/SF小口徑人工血管的制備條件，并對(duì)其形貌及機(jī)械性能進(jìn)行了表征，同時(shí)在PGS/SF樣品膜上開(kāi)展HUVECs和VSMCs體外細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

聚癸二酸甘油酯（PGS），家蠶生絲，六氟異丙醇（C3H2F6O），聚環(huán)氧乙烷（PEO），胰蛋白酶（EDTA），HUVECs，VSMCs，DMEM高糖培養(yǎng)基，胎牛血清（FBS），雙抗，二甲基亞砜（DMSO），二乙酸熒光素（FDA），戊二醛（C5H8O2）。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

靜電紡絲機(jī)（長(zhǎng)沙納儀儀器科技有限公司），CO2培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），臺(tái)式電鏡（日立公司），全自動(dòng)酶標(biāo)儀（Bio-Tek公司），激光共聚焦顯微鏡（A1R-si，Confocal Microscope公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 PGS熱性能研究樣品制備

1.3.1 .1 PGS預(yù)聚物的合成

將20.225 g癸二酸和9.209 g丙三醇加入到三頸燒瓶中，在三頸燒瓶中通入氮?dú)獠⒅糜?25℃油浴鍋中加熱攪拌2天后得到PGS預(yù)聚物。放入燒杯中冷卻至室溫，在4-8℃下密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1 .2 PGS固化方法

取適量的PGS放入真空干燥箱中，分別設(shè)置120、140、150、160℃對(duì)PGS預(yù)聚物進(jìn)行固化，固化時(shí)間為24 h。用差示掃描量熱儀（DSC）對(duì)PGS預(yù)聚物和固化后的PGS進(jìn)行分析。

1.3.2 PGS/SF小口徑人工血管的制備

稱取0.63 g PGS預(yù)聚物和0.27 g SF膜放入帶有磁力攪拌子的燒杯中，加入定量的六氟異丙醇（HFIP）配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9%（w/w）的紡絲液。紡制膜及管狀樣品。靜電紡絲參數(shù)為：電壓為13.5 kV，接收距離為12 cm，流速為2 mL/h，轉(zhuǎn)速500 rpm，固化溫度為150℃。通過(guò)掃描電鏡、動(dòng)態(tài)表面張力儀觀察PGS/SF小口徑人工血管材料的微觀形貌和吸濕性。通過(guò)萬(wàn)能材料試驗(yàn)機(jī)和定制的模具對(duì)固化后PGS/SF小口徑人工血管材料進(jìn)行徑向拉伸測(cè)試。依據(jù)式（1-1）、式（1-2）計(jì)算PGS/SF小口徑人工血管的斷裂強(qiáng)度和斷裂伸長(zhǎng)率。

1.3.3 細(xì)胞培養(yǎng)及接種

將PGS/SF樣品浸入到VEGF，在4℃冰箱中過(guò)夜。滅菌后將PGS/SF膜浸泡在培養(yǎng)基中并置于培養(yǎng)箱中過(guò)夜，細(xì)胞計(jì)數(shù)后將HUVECs稀釋至5×104 cell/mL。吸取1 mL接種到24孔板中的PGS/SF膜上和爬片上；吸取200 μL接種到96孔板中的PGS/SF膜上和空白板上。

將VSMCs稀釋至1×106 cell/mL。吸取100 μL接種到24孔板中的PGS/SF膜上和爬片上，3 h后，再加入900 μL培養(yǎng)基；吸取20 μL接種到96孔板中的PGS/SF膜上和空白樣上，3 h后，再加入180 μL培養(yǎng)基。

1.3.4 HUVECs和VSMCs細(xì)胞共培養(yǎng)

先將HUVECs接種到PGS/SF膜上進(jìn)行培養(yǎng)，1 d后將膜翻轉(zhuǎn)朝下，用PGS/SF膜代替細(xì)胞小室中的Transwell膜，然后放入至12孔細(xì)胞小室和24孔細(xì)胞小室中，再在膜上接種VSMCs，3 h時(shí)后再在膜上加入培養(yǎng)基（細(xì)胞接種方式同（1.3.3），共培養(yǎng)時(shí)天數(shù)按照VSMCs的天數(shù)計(jì)算）。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用Origin作圖。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示，采用方差分析和t檢驗(yàn)計(jì)算數(shù)據(jù)的顯著性差異。P＜0.05時(shí)記為有顯著差異（*），P＜0.01時(shí)記為有極顯著差異（**）。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 PGS DSC分析

隨著PGS的固化和固化溫度的升高，PGS的熔融溫度和結(jié)晶溫度逐漸降低，第二次升溫的結(jié)晶溫度低于第一次的結(jié)晶溫度。這是因?yàn)殡S著固化溫度的升高，PGS結(jié)晶逐漸轉(zhuǎn)化為凝膠，該處的結(jié)晶峰主要是PGS中的凝膠部分引起的，PGS的結(jié)晶溫度隨著凝膠的量的增多而下降。在高溫區(qū)域，即在75-105℃出現(xiàn)熔融峰，說(shuō)明在高溫區(qū)熔融峰在凝膠熔融曲線上仍部分存在[4]。

2.2 PGS/SF小口徑人工血管性能研究

2.2.1 PGS/SF形貌分析

圖1為不同固化溫度下的PGS/SF小口徑人工血管微觀圖像，從圖中可以看出，材料中的纖維隨機(jī)排列，隨著溫度的升高，纖維的孔隙逐漸減少。

2.2.2 接觸角

120℃固化溫度下的樣品接觸角為77.7°，具有親水性。從130℃開(kāi)始，材料表面的接觸角開(kāi)始大于90°，具有疏水性。由微觀形貌分析可知，隨著固化溫度的升高，材料表面的孔隙逐漸減少。且PGS的親水性不足，隨著溫度的升高，PGS熔融逐漸覆蓋在SF纖維表面，導(dǎo)致材料表面的疏水性逐漸增強(qiáng)。

2.2.3 徑向拉伸性能

將之前的制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，即將靜電紡絲后的小口徑人工血管立即放入到真空干燥箱中，并提高其固化溫度，其力學(xué)性能得到提升。如圖3所示，隨著固化溫度的升高，斷裂強(qiáng)度和斷裂伸長(zhǎng)率都有所提高，與之相反，楊氏模量隨著固化溫度的升高而降低。120℃和130℃固化后的PGS/SF小口徑人工血管的斷裂強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于人內(nèi)乳動(dòng)脈斷裂強(qiáng)度（3.1 MPa）[5]，而140℃-160℃固化溫度后小口徑人工血管的斷裂強(qiáng)度高于人內(nèi)乳動(dòng)脈斷裂強(qiáng)度。通過(guò)以上研究表明PGS/SF小口徑人工血管固化溫度大于130℃能得到更好地力學(xué)性能。

從徑向拉伸性能的研究中可以看出，固化溫度為150℃的小口徑人工血管的斷裂強(qiáng)度略低于160℃，但是其斷裂伸長(zhǎng)率是高于160℃的，所以我們最終選擇固化溫度為150℃作為小口徑人工血管的制備條件。

2.3 細(xì)胞共培養(yǎng)

2.3.1 掃描電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)

HUVECs呈鋪路石狀黏附在PGS/SF材料上，HUVECs在2，4，8天的細(xì)胞數(shù)量隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加而增加，證明PGS/SF材料有利于HUVECs的黏附和增殖。

VSMCs在PGS/SF材料上呈長(zhǎng)梭形，VSMCs在PGS/SF材料上的細(xì)胞數(shù)量隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加而增加，證明PGS/SF有利于VSMCs的黏附與增殖。從圖4和圖5中也可以看出，HUVECs和VSMCs能同時(shí)在PGS/SF材料上黏附和增殖，說(shuō)明HUVECs和VSMCs能同時(shí)在材料上進(jìn)行共培養(yǎng)。

2.3.2 MTT測(cè)試

HUVECs和VSMCs在PGS/SF材料上細(xì)胞數(shù)量隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加而增加，加載VEGF的PGS/SF材料上HUVECs的細(xì)胞數(shù)量多于未加載VEGF PGS/SF材料上的細(xì)胞數(shù)量，說(shuō)明加載VEGF能促進(jìn)HUVECs的黏附和增殖。

3 結(jié)論

（1）隨著PGS的固化和固化溫度的升高，PGS的熔融溫度和結(jié)晶溫度逐漸降低。

（2）PGS/SF小口徑人工血管的疏水性隨著固化溫度的升高而逐漸增強(qiáng)。斷裂強(qiáng)度和斷裂伸長(zhǎng)率隨著固化溫度的升高而呈上升趨勢(shì)，楊氏模量隨著固化溫度的升高而逐漸降低。

（3）PGS/SF材料有利于HUVECs和VSMCs的黏附和增殖，加載VEGF能促進(jìn)HUVECs的黏附和增殖，HUVECs和VSMCs能同時(shí)在PGS/SF膜上共培養(yǎng)。