液體活檢技術(shù)在腫瘤診斷中的最新研究進(jìn)展

夏艷艷，沈 瀚，許紅攀，李智洋（南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院，南京 210008）

惡性腫瘤是嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的重大疾病，其發(fā)病率和死亡率居高不下[1]。由于腫瘤早期癥狀隱匿且多樣化，很多患者在首次診斷時(shí)已屬腫瘤晚期[2]。癌癥的預(yù)后與病程有著密切關(guān)聯(lián)，臨床研究表明，原位癌治愈率達(dá)90%以上，I 期癌癥患者的5年生存率達(dá)60%～90%，II 期患者的5年生存率約50%，而III b 和IV 期患者的5年生存率僅5%～20%，提示早期發(fā)現(xiàn)、診斷是改善腫瘤預(yù)后的關(guān)鍵[3]。因此，如何提高腫瘤早期診斷水平已成為腫瘤防治工作中面臨的緊迫任務(wù)。

目前腫瘤的診斷技術(shù)主要包括腫瘤標(biāo)志物、計(jì)算機(jī)斷層攝影（computed tomography,CT）、組織活檢。腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)雖然操作簡(jiǎn)單，但是其診斷的特異度和敏感度很低，只有30%和18%～70%[4]。雖然CT 針對(duì)早期腫瘤檢出率能達(dá)到40%～60%，但其假陽(yáng)性率較高（達(dá)到50%以上），常導(dǎo)致患者過(guò)多的輻射暴露和沉重的心理負(fù)擔(dān)，甚至不必要的手術(shù)帶來(lái)的身體及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[5]。組織活檢是確認(rèn)的金標(biāo)準(zhǔn)，但是有創(chuàng)的侵入性操作會(huì)對(duì)患者造成生理負(fù)擔(dān)和心理影響，同時(shí)由于其只能針對(duì)少數(shù)部分進(jìn)行取材，穿刺活檢也未必能獲得準(zhǔn)確性信息[6]。因此發(fā)展敏感度及特異度更高，更加精準(zhǔn)、無(wú)創(chuàng)、簡(jiǎn)便地腫瘤早期篩查技術(shù)是臨床亟待解決的重大科學(xué)問(wèn)題。

液體活檢是對(duì)患者外周血液進(jìn)行檢測(cè)分析，獲得患者腫瘤相關(guān)信息的一項(xiàng)新興技術(shù)，主要包括循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell,CTC）、循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumour DNA,ctDNA）和外泌體。液體活檢具有操作方便快捷、能反復(fù)獲取、易于實(shí)時(shí)監(jiān)控等優(yōu)點(diǎn)，為腫瘤的早期診斷提供了新方法。以下就液體活檢技術(shù)在腫瘤早期診斷中的應(yīng)用價(jià)值以及存在的優(yōu)勢(shì)和局限性進(jìn)行綜述，以期為腫瘤患者早期診斷提供新方法。

1 液體活檢中CTC 在腫瘤診斷中的應(yīng)用

CTC 是腫瘤細(xì)胞從原發(fā)部位分離，進(jìn)入血液循環(huán)，并可以通過(guò)血液循環(huán)播散并進(jìn)行遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。研究表明，CTC 在腫瘤直徑＜ 0.1 cm 時(shí)就已表現(xiàn)出異常，在時(shí)間上比傳統(tǒng)影像學(xué)早6～9 周[7]。YU 等[8]通過(guò)磁珠富集CTC，再標(biāo)記腫瘤特異度配體葉酸進(jìn)行PCR 檢測(cè)，結(jié)果顯示該方法診斷非小細(xì)胞肺癌（non small cell lung cancer，NSCLC）的敏感度為73.2%，特異度為84.1%，但是對(duì)I 期NSCLC 患者的診斷敏感度只有67.2%，仍舊有1/3 的漏診率。這主要是由于CTC 在血液中的含量極低（一般患者10 ml 血液中只有1～10 個(gè)CTC）、半衰期短所致，此外目前缺乏可用的特異度標(biāo)志物來(lái)識(shí)別CTC，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性的情況[9]。

2 液體活檢中ctDNA 在腫瘤診斷中的應(yīng)用

ctDNA 也是腫瘤診斷中研究的熱點(diǎn)。深度測(cè)序檢測(cè)ctDNA 顯示[10]，在72%的患者中，ctDNA 可早于影像學(xué)5.2 個(gè)月檢測(cè)到腫瘤，并且在首次治療后檢測(cè)復(fù)發(fā)率的準(zhǔn)確度達(dá)到94%。早期腫瘤患者ctDNA 等位基因移位和雜合性丟失頻繁發(fā)生，因此檢測(cè)ctDNA 能夠發(fā)現(xiàn)腫瘤早期基因的改變[11]。但是ctDNA 代表的是死細(xì)胞的信息[12]，半衰期僅有2 h[13]；而且含量低，約占整個(gè)循環(huán)DNA 的1%，甚至只有0.01%[14]，分離不當(dāng)還會(huì)造成背景值過(guò)高，而影響檢測(cè)的靈敏度。

3 液體活檢中外泌體在腫瘤診斷中的應(yīng)用

3.1 外泌體作為腫瘤標(biāo)志物的優(yōu)勢(shì) 外泌體可以在細(xì)胞間轉(zhuǎn)運(yùn)癌基因和蛋白質(zhì)，在腫瘤形成、生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和耐藥中起到關(guān)鍵作用[15]。作為腫瘤標(biāo)志物的優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)在：①數(shù)量多，在血清中外泌體濃度可達(dá)到3×106個(gè)/μl[16]，平均每個(gè)腫瘤細(xì)胞可釋放530個(gè)外泌體/24 h[17]；②信息豐富，非常類(lèi)似于腫瘤細(xì)胞。外泌體膜表面也有著和細(xì)胞膜同樣的蛋白，可以代表其親本細(xì)胞的特征和狀態(tài)[18]；③易于長(zhǎng)期保存和去除干擾。半衰期長(zhǎng)，有磷脂雙分子層的保護(hù)而不被蛋白酶和核酸酶降解，并且只要分離外泌體就可以去除干擾[19]；④無(wú)創(chuàng)檢測(cè)。外泌體可以穿過(guò)內(nèi)皮進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，因此在幾乎所有的體液中可以檢測(cè)到[20]，與組織活檢相比，外泌體是個(gè)性化醫(yī)療的有效生物標(biāo)志物。

外泌體相關(guān)蛋白、miRNA 等都可以作為腫瘤檢測(cè)的標(biāo)志物。采用表面增強(qiáng)拉曼光譜對(duì)肺癌患者外泌體進(jìn)行分析，結(jié)果顯示該方法區(qū)分肺癌和正常人外泌體的敏感度為95.3%，特異度為97.3%[21]，但表面增強(qiáng)拉曼光譜需要特定的設(shè)備，而且儀器環(huán)境輕微震動(dòng)會(huì)導(dǎo)致光學(xué)檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)較大偏差。VANNII 等[22]研究發(fā)現(xiàn)肺癌患者血液外泌體來(lái)源的miR-25 和miR-223 的表達(dá)水平較正常人升高，而1et-7f，miR-20b 和miR-30e-3p 的表達(dá)水平前者較后者明顯降低，這種差異性表達(dá)為肺癌的診斷帶來(lái)潛在應(yīng)用價(jià)值。因此，對(duì)肺癌患者的外泌體進(jìn)行檢測(cè)，將為肺癌患者的診斷提供更加科學(xué)的工具。然而目前針對(duì)外泌體miRNA 腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)都是連同正常外泌體miRNA 一起分析的，導(dǎo)致少量的腫瘤外泌體中過(guò)表達(dá)miRNA 信號(hào)常被噪聲淹沒(méi)[23]。而外泌體膜表面蛋白反映其來(lái)源細(xì)胞的特征和狀態(tài)，可借助親和結(jié)合直接特異檢測(cè)，因此發(fā)展以腫瘤外泌體表面特異蛋白為靶標(biāo)的檢測(cè)方法具有重要意義。

3.2 以外泌體表面蛋白為靶標(biāo)的檢測(cè)方法進(jìn)展 傳統(tǒng)檢測(cè)方法如蛋白印跡和酶聯(lián)免疫法，操作復(fù)雜,敏感度極低，不適合臨床推廣[24]。為了解決這些問(wèn)題，ZONG 等[25]采用磁珠捕獲外泌體，再與結(jié)合在納米棒上的探針相結(jié)合，利用表面增強(qiáng)拉曼散射檢測(cè)腫瘤來(lái)源外泌體；ZHAO 等[26]利用微流控芯片實(shí)現(xiàn)了外泌體表面多個(gè)蛋白的同時(shí)檢測(cè)；JEONG等[27]采用磁珠直接捕獲血清中的外泌體，利用電化學(xué)法分析了多種蛋白質(zhì)；DOLDAN 等[28]報(bào)道了一種基于電化學(xué)“三明治”免疫夾心的方法，用來(lái)定量檢測(cè)外泌體。

核酸適配體（aptamer）具有與抗體相似的高親和性，特異度高，識(shí)別能力強(qiáng)，可以特異地將腫瘤外泌體與正常外泌體區(qū)分開(kāi)[29]。XIA 等[30]將針對(duì)CD63 蛋白的Aptamer 整合到單壁碳納米管上，利用可視化的比色反應(yīng)來(lái)檢測(cè)乳腺癌來(lái)源外泌體；ZHOU 等[31]將外泌體CD63 蛋白特異性Aptamer 固定在金電極表面并整合到微流體裝置上，利用電化學(xué)生物傳感器定量檢測(cè)肝癌外泌體；JIANG 等[32]利用金納米粒子和外泌體競(jìng)爭(zhēng)性的與Aptamer 結(jié)合，導(dǎo)致金納米粒子的聚合或者解聚，從而形成可視化的比色反應(yīng)來(lái)檢測(cè)外泌體；CHEN 等[33]基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移Aptamer 傳感，將外泌體固定在上轉(zhuǎn)換納米粒子和金納米棒之間進(jìn)行檢測(cè)；WANG 等[34]報(bào)道了一種增強(qiáng)電化學(xué)Aptamer 傳感器，它利用DNA 納米四面體結(jié)構(gòu)捕獲Aptamer，并固定在金電極上，在加入外泌體后發(fā)生氧化還原反應(yīng)，并通過(guò)K3[Fe(CN)6]/KCl 覆蓋住整個(gè)電極來(lái)產(chǎn)生信號(hào)放大，納米四面體結(jié)構(gòu)有效地阻止了Aptamer 在電極上容易聚集、纏結(jié)的現(xiàn)象，因此在檢測(cè)外泌體時(shí)可產(chǎn)生更強(qiáng)、更穩(wěn)定的檢測(cè)信號(hào)。表1 總結(jié)了外泌體的檢測(cè)方法。

表1 外泌體表面蛋白檢測(cè)方法

4 總結(jié)和展望

腫瘤的早期診斷對(duì)腫瘤的預(yù)后和5年生存率有著重要作用，然而目前的早期診斷技術(shù)難以滿足臨床需求。液體活檢技術(shù)作為無(wú)創(chuàng)的新興的腫瘤檢測(cè)方法，在腫瘤的早期診斷、預(yù)后監(jiān)測(cè)中都有重大的臨床價(jià)值。外泌體與CTC,ctDNA 都屬于液體活檢的重要組成成分，但是外泌體具有分布廣泛、來(lái)源于活細(xì)胞、分離鑒定相對(duì)簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，受到越來(lái)越多的關(guān)注。雖然外泌體在腫瘤診斷中有巨大應(yīng)用價(jià)值，但仍存在很大的探索空間。目前外泌體診斷研究的標(biāo)本量較少，仍需大樣本、多中心的臨床研究。而且外泌體表面蛋白的檢測(cè)方法大都是利用親和分子特異性結(jié)合后進(jìn)行檢測(cè)，因此在應(yīng)用該類(lèi)方法進(jìn)行臨床檢測(cè)時(shí)，比腫瘤來(lái)源外泌體多很多的正常外泌體會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性地占據(jù)捕獲分子，導(dǎo)致無(wú)法結(jié)合腫瘤來(lái)源外泌體，而使檢測(cè)靈敏度降低，因此如何保證所有腫瘤來(lái)源外泌體均能與特異的識(shí)別分子結(jié)合，對(duì)腫瘤的早期篩查具有非常重要的意義。同時(shí)將外泌體與腫瘤相關(guān)的其他檢測(cè)指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)，或許能取得更好的診斷效能。