替加環(huán)素與臨床常用抗生素對(duì)碳青霉烯耐藥高毒力肺炎克雷伯菌體外聯(lián)合藥敏試驗(yàn)

賈艷增，時(shí)東彥（河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，石家莊 050017）

肺炎克雷伯菌是呼吸科常見的條件致病菌[1]，特別是呼吸科重癥監(jiān)護(hù)病房及呼吸機(jī)輔助呼吸，可引起嚴(yán)重的肺部感染、尿路感染甚至血流感染。然而，近年來高毒力肺炎克雷伯菌（hypervirulentKlebsiella pneumonia,HvKP）是一種日益被認(rèn)識(shí)的病原菌，在呼吸科比較多見，比普通的肺炎克雷伯菌（classicKlebsiella pneumonia,cKP）更具有毒性，可導(dǎo)致健康的年輕人致病，包括肝膿腫、肺炎、腦炎等嚴(yán)重的社區(qū)獲得性感染，具有侵襲性[2-3]。在過去的觀點(diǎn)認(rèn)為HvKP 很少對(duì)抗生素產(chǎn)生耐藥性，除了天然耐藥氨芐西林,大多數(shù)菌株對(duì)常用藥物均敏感。然而，目前HvKP 出現(xiàn)多重耐藥，特別是碳青霉烯耐藥高毒力肺炎克雷伯菌株的報(bào)道不斷增加，在中國(guó)，CR-HvKP 出現(xiàn)可達(dá)15%[4]。CR-HvKP由碳青霉烯耐藥肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistantKlebsiella pneumoniae,CRKP）獲得pLVPK 樣毒力質(zhì)?；騂vKP 獲得碳青霉烯耐藥基因而形成且可在細(xì)菌之間快速傳播[5-6]。CR-HvKP 具有高毒性、耐多藥和傳播性的特點(diǎn)稱為真正超級(jí)細(xì)菌，給臨床治療和醫(yī)院感染控制帶來巨大的挑戰(zhàn)。CR-HvKP 感染的藥物極其有限且治療效果差，預(yù)后不良。替加環(huán)素是臨床上用于泛耐藥的革蘭陰性桿菌，目前臨床上治療CR-HvKP 的常用抗生素，但文獻(xiàn)報(bào)道單獨(dú)使用替加環(huán)素使其敏感性降低療效差[7]。本研究評(píng)價(jià)替加環(huán)素聯(lián)合臨床常用抗生素對(duì)抗CR-HvKP 的效果，為臨床治療CR-HvKP 感染提供較佳的方案。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 收集河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院2017～2019年臨床分離非重復(fù)CR-HvKP 菌20 株，分別來自血培養(yǎng)15 株，腹腔引流液5 株。

1.2 儀器與藥品 全自動(dòng)微生物鑒定儀（法國(guó)生物梅里埃公司Vitek2 Compact），聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增儀（美國(guó)Bio-Rad 公司），凝膠成像儀（美國(guó)Bio-Rad 公司），電泳儀（上海康華公司），細(xì)菌DNA 提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司），2×Taq Master Mix（北京康為科技有限公司），50×TAE 緩沖液（上海生工有限公司）。哥倫比亞血瓊脂、MH 培養(yǎng)基、MH 肉湯培養(yǎng)基(Oxoid 公司)，抗生素標(biāo)準(zhǔn)品：替加環(huán)素(大連美侖生物技術(shù)有限公司)，多黏菌素（大連美侖生物技術(shù)有限公司），頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉（輝瑞制藥有限公司），美羅培南(中國(guó)食品藥品檢定研究院)，阿米卡星(中國(guó)食品藥品鑒定研究院)，磷霉素(中國(guó)食品藥品鑒定研究院)。

1.3 方法

1.3.1 菌株鑒定及微量肉湯法藥敏試驗(yàn)：采用法國(guó)生物梅里埃公司全自動(dòng)微生物鑒定儀Vitek2 Compact 進(jìn)行菌株鑒定及藥敏試驗(yàn),藥敏結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)參照CLSI 2016年進(jìn)行藥敏結(jié)果判讀；質(zhì)控菌株為肺炎克雷伯菌ATCC700603，大腸埃希菌ATCC25922。按照CLSI 標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行微量肉湯稀釋法測(cè)定藥物的最低抑菌濃度(minimal inhibitiory concentration,MIC)值，參照CLSI 標(biāo)準(zhǔn)判定，頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉及替加環(huán)素折點(diǎn)參照美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(food and drug administration,FDA)判讀，其中替加環(huán)素折點(diǎn)為敏感（S）：MIC ≤2mg/L，耐藥（R）：MIC ≤8mg/L。

1.3.2 高黏液表型檢測(cè)：采用拉絲試驗(yàn)方法，用接種環(huán)挑取哥倫比亞血瓊脂平板上新鮮菌落進(jìn)行牽拉，重復(fù)兩次或兩次以上，黏液絲形成且長(zhǎng)度≥5mm 則判斷為高黏液表型陽性，黏液絲形成且長(zhǎng)度＜5mm判斷為陰性。

1.3.3 高毒力肺炎克雷伯菌菌株：參照文獻(xiàn)[8-9]資料，采用PCR 檢測(cè)rmpA/rmpA2 毒力基因、鐵載體毒力基因iroN，iutA，iucA，碳青霉烯酶基因（KPC-2，NDM-1，OXA，VIM 和IMP），血清型（K1，K2）。

1.3.4 高毒力肺炎克雷伯菌株的確認(rèn)：參考文獻(xiàn)[10]，拉絲試驗(yàn)與rmpA/rmpA2 基因均為陽性確定為HvKP。

1.3.5 多位點(diǎn)序列分析（MLST）：參考文獻(xiàn)[10]，通過對(duì)肺炎克雷伯菌7 個(gè)管家基因進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序，采用Bioedit 軟件數(shù)據(jù)進(jìn)行分析確定ST 型。

1.3.6 聯(lián)合藥敏試驗(yàn)采用96 孔：微量棋盤稀釋法檢測(cè)替加環(huán)素和7 種常用抗生素聯(lián)合檢測(cè)對(duì)CRHvKP 的體外抗菌活性。藥物濃度包含敏感、中介、耐藥的折點(diǎn)。部分抑菌濃度指數(shù)(fractional inhibitory concentration,FICI)=(聯(lián)合時(shí)A 藥的MIC/單用時(shí)AMIC)+(聯(lián)合時(shí)B 藥的MIC/單用時(shí)B 藥MIC)。

1.3.7 結(jié)果判讀：FICI 判斷標(biāo)準(zhǔn)：FICI ≤0.5 為協(xié)同作用，0.5＜FICI ≤1 為相加作用，1＜FICI ≤2 為無關(guān)，F(xiàn)ICI＞2 為拮抗。

2 結(jié)果

2.1 20 株CR-HvKP 分子生物學(xué)及臨床特征 見表1。20 株CR-HvKP 菌主要來自呼吸ICU 13 株，所占比例為65%,氣管插管輔助呼吸16 例，所占比例為80%，血清型12 株為K2 型，所占比例為60%，1 株為K1 型，所占比例為5%。20 株CR-HvKP 均為ST11 型。拉絲試驗(yàn)及毒力基因rmpA2 均為陽性。毒力基因entB 及yetS 均為陽性。鐵載體毒力基因iroN，iutA，iucA 分別為16 株，19 株，7 株，20株CR-HvKP 菌碳青霉烯酶基因均為KPC-2 型。

表1 20 株CR-HvKP 菌分子生物學(xué)及臨床特征

2.2 20 株CR-HvKP 臨床常用抗生素MIC 值 見表2。20 株CR-HvKP 微量肉湯稀釋法檢測(cè)對(duì)替加環(huán)素MIC 在0.125～1.0mg/L 范圍，均敏感；多黏菌素MIC 在0.125～1.0mg/L 范圍，均敏感；頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉、美羅培南、阿米卡星、磷霉素鈉均耐藥。

表2 20 株CR-HvKP 臨床常用抗生素MIC 值(mg/L)

2.3 替加環(huán)素聯(lián)合臨床常用藥對(duì)20 株CR-HvKP的藥敏結(jié)果 見表3。替加環(huán)素與臨床常用抗生素聯(lián)合藥敏結(jié)果顯示，替加環(huán)素與多黏菌素出現(xiàn)協(xié)同作用，百分比為60%。4 種抗生素與替加環(huán)素出現(xiàn)相加作用，分別為多黏菌素B 30%，頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉30%，美羅培南10%，阿米卡星50%。5 種抗生素與替加環(huán)素為無關(guān)作用，分別為多黏菌素B 70%，頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉70%，美羅培南90%，磷霉素鈉80%，阿米卡星50%。磷霉素鈉與替加環(huán)素出現(xiàn)拮抗作用為20%。

表3 替加環(huán)素聯(lián)合臨床常用抗生素對(duì)20 株CR-HvKP 聯(lián)合藥敏結(jié)果[n（%）]

3 討論

過去觀點(diǎn)認(rèn)為HvKP 很少對(duì)抗生素產(chǎn)生耐藥性，除了天然耐藥氨芐西林,大多數(shù)菌株對(duì)常用藥物均敏感，但近年來研究發(fā)現(xiàn)HvKP 存在多種結(jié)合和整合元素，使毒力基因/耐藥基因在細(xì)菌之間通過質(zhì)粒傳播[11-14]。目前，主要有兩種途徑形成CR-HVKP:一種是碳青霉烯耐藥高毒力肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistantKlebsiella pneumoniae，CRKP）通過質(zhì)粒獲得毒力基因而形成CR-HvKP；另一種為HvKP 通過質(zhì)粒獲得碳青霉烯酶基因形成的[13]，且可以在細(xì)菌之間快速傳播[6,14]。CR-HvKP具有高毒性、耐多藥和傳播性的特點(diǎn)被稱為真正超級(jí)細(xì)菌，給臨床治療和醫(yī)院感染控制帶來巨大的挑戰(zhàn)，因此需要迫切的對(duì)這種新型菌進(jìn)行聯(lián)合藥敏試驗(yàn)，給臨床提供更好的治療方案是十分必要的。

本研究收集的CR-HVKP 20 株，以黎斌斌等[10]文獻(xiàn)為參照，拉絲試驗(yàn)與rmpA/rmpA2 基因均為陽性確認(rèn)為高毒力肺炎克雷伯菌，研究結(jié)果顯示，20株均為rmpA2 毒力基因陽性。本研究中，K2 是CRHvKP 菌主要血清型，所占比例達(dá)60%，與SIU 等[15]報(bào)道類似。20 株CR-HvKP 菌均為ST11 型，碳青霉烯酶基因均為KPC-2型，與DONG等[16]報(bào)道相似。本研究主要出現(xiàn)血清型為K2，碳青霉烯酶基因?yàn)镵PC-2 型ST11 的CR-HvKP。

本研究中使用了替加環(huán)素與臨床常用治療CRKP的5 種抗生素進(jìn)行組合。研究發(fā)現(xiàn)，替加環(huán)素與多黏菌素對(duì)產(chǎn)生KPC-2 的CRKP 菌存在協(xié)同作用百分比較高，與TOLEDO 等[17-19]研究基本類似。POURNARAS 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，體外藥敏試驗(yàn)中與碳青霉烯類藥物完全沒有協(xié)同作用，本研究結(jié)果與其一致，替加環(huán)素與美羅培南對(duì)產(chǎn)生KPC-2 的CRKP 菌沒有協(xié)同作用同時(shí)也沒有拮抗作用，這與TOLEDO 等[17]報(bào)道的結(jié)果一致，但是ZHANG 等[18]報(bào)道是替加環(huán)素與美羅培南聯(lián)合使用時(shí)確實(shí)有拮抗作用，這有待于進(jìn)一步研究。同時(shí)本研究結(jié)果顯示，替加環(huán)素聯(lián)合頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉、阿米卡星，磷霉素對(duì)抗產(chǎn)KPC-2 的CR-HvKP 菌感染體外試驗(yàn)無協(xié)同作用，而ZHANG 等[18]報(bào)道是替加環(huán)素與阿米卡星聯(lián)合使用時(shí)有協(xié)同作用。

CR-HvKP 感染是復(fù)雜的，通常攜帶多種耐藥基因，限制了治療效果，目前，只有多黏菌素、替加環(huán)素、頭孢他啶/阿維巴坦等藥物仍具有較好的體外抗CR-HvKP 活性，而多黏菌素存在潛在的腎毒性限制了其廣泛應(yīng)用，尤其是腎功能不全的患者。頭孢他啶/阿維巴坦作為新的藥物在逐漸上市，臨床抗CR-HvKP 感染療效還未能全面評(píng)估且只抑制碳青霉烯酶A 類和C 類，對(duì)B 類無抗菌活性。臨床上目前對(duì)于治療CRKP 菌感染只有少數(shù)的抗生素，其中替加環(huán)素、多黏菌素和美羅培南經(jīng)常用于聯(lián)合治療抗感染[21]。然而，最推薦的治療方案以及應(yīng)該使用哪種抗生素聯(lián)合治療CR-HvKP 至今也沒有共識(shí)[22]。替加環(huán)素在中國(guó)已被批準(zhǔn)用于臨床，被認(rèn)為是用于難以治療的碳青霉烯耐藥菌感染的最后手段[23]。然而，近幾年來，替加環(huán)素出現(xiàn)了耐藥性。DU等[24]報(bào)道替加環(huán)素耐藥由tetA 突變基因通過質(zhì)粒介導(dǎo)產(chǎn)生的。LIU 等[25]報(bào)道了多黏菌素也出現(xiàn)了mcr 突變基因通過質(zhì)粒介導(dǎo)產(chǎn)生耐藥。文獻(xiàn)報(bào)道多黏菌素聯(lián)合用藥可以減少耐藥性發(fā)展，這已在體外研究中得到證實(shí)，但未得到臨床研究的支持[26]。因此，替加環(huán)素聯(lián)合多黏菌素抗CR-HvKP 菌感染表現(xiàn)出最大的體外協(xié)同殺菌作用，本研究結(jié)果與其基本相似，該方案可作為治療CR-HvKP 菌感染的最后手段。

CR-HvKP 具有高侵襲性、強(qiáng)致病力以及高耐藥限制了臨床有效藥物治療，使臨床面對(duì)治療CRHvKP 感染相當(dāng)?shù)睦щy，造成CR-HvKP 感染的高死亡率。本研究結(jié)果顯示替加環(huán)素與多黏菌素體外聯(lián)合有較大的協(xié)同作用，雖然這不能完全說明臨床治療使用時(shí)出現(xiàn)同樣的效果，但可能為臨床治療CR-HvKP 感染提供新的治療思路。