肺腺癌細胞中長鏈非編碼RNA-ARAP1-AS1表達模式及其生物學特征

劉 欣，張歡歡，關(guān) 平，鄧 瑾

（1.廣州市胸科醫(yī)院檢驗科，廣州 510095;2.廣州醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院放療科,廣州 510095)

肺癌是全球最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率及死亡率在各類惡性腫瘤中居于首位[1]。肺腺癌是具有腺樣分化或黏液分泌的惡性上皮腫瘤，是肺癌中最常見的病理類型。相關(guān)研究指出，肺腺癌患者接受治療后仍有相當部分發(fā)生轉(zhuǎn)移，且患者 5年生存率較低[2-3]。目前，肺腺癌發(fā)生發(fā)展的機制尚未完全闡明。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,LncRNA)是一類長度大于200nt 的非編碼RNA。lncRNA 主要在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后等層面調(diào)控基因表達，從而在體內(nèi)發(fā)揮廣泛且復雜的生物學作用[4-5]。部分lncRNAs（HOTAIR，H19，ANRIL，MALAT1，MEG3 和GAS5 等）在肺腺癌中的作用已被揭示，但仍有更多的未知lncRNAs 及其作用機制有待進一步的研究[5-10]。

LncRNA ARAP1-AS1 轉(zhuǎn)錄本ID 是ENST0000054 2022.1，位于11 號染色體，其轉(zhuǎn)錄本全長388 nt，由2 個外顯子組成。本研究通過探究ARAP1-AS1在肺腺癌中的表達及其相關(guān)生物學特征，初步探討其在肺腺癌中的作用。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集2017年5月～2018年9月廣州醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院23 對肺腺癌及癌旁正常組織標本。人正常肺上皮細胞BEAS-2B 和人肺腺癌細胞株A549，H1299，H1975 和HCC827 均由課題組自主保存。

1.2 儀器與試劑 PCR 擴增儀購自美國Bio-RAD公司。Lipofectamine 2000 試劑盒及 Trizol 試劑購自美國 Invitrogen 公司。cDNA First Strand Reversing kit 及qRT-PCR SYBR Master Mix 試劑盒購自加拿大Fermentas 公司。多功能酶標儀購自美國Bio TEK 公司。10g/dl 胎牛血清的1640 購自美國Gibco公司。PARISTMKit 試劑盒購自thermofisher 公司。6 孔板、96 孔板購自美國Corning 公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞及培養(yǎng)：將人正常肺上皮細胞BEAS-2B 和人肺腺癌細胞株A549，H1299，H1975 和HCC827 接種于含10g/dl 胎牛血清的1 640 培養(yǎng)液中，在37 ℃，5ml/dl CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞融合度達到80% 以上，用于后續(xù)實驗。

1.3.2 qRT-PCR:用TRIZol 提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。按說明書配置的反應(yīng)體系及運行條件。根據(jù)2-ΔΔCt值計算相對表達量。其引物序列設(shè)計：GAPDH：5’-ATTCCATGGCACCGTCAAGGCTGA-3’，5’-ATTCCATGGCACCGTCAAGGCTGA-3’；ARAP1-AS1：5’-GCACCCGCTTTCTGCTGTT'-3’，5’-'TCCTTGTGGGGCTGGAGAGAT-3’，均由天一輝遠公司合成。

1.3.3 亞細胞定位實驗：收集目標細胞并用PBS洗滌，加入裂解液Cell Fractionation Buffer，離心收集上清至新的EP 管，此為細胞質(zhì)組分；給上述沉淀中加入Cell Disruption Buffer，離心收集上清至新的EP 管，此為細胞核組分。分別提取細胞質(zhì)/ 核的RNAs，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，qRT-PCR檢測ARAP1-AS1 在各細胞組分中的表達。

1.3.4 MTS 細胞增殖實驗：將細胞以1 000 個細胞/孔的密度接種96 孔板，待貼壁后0，1，2，3，4，5 和6 天，每孔加入20 μl MTS，3h 后使用多功能酶標儀在490 nm 處測絕對吸光值，計算各孔細胞的增殖活力。

1.3.5 平板克隆實驗：用胰酶消化處于增殖期的細胞，離心后重懸，作梯度倍數(shù)稀釋，每組細胞分別以每孔100，200 個細胞的梯度分別均勻接種于六孔板中。置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 周，待細胞形成克隆，染色，拍照。

1.4 統(tǒng)計學分析 所有的實驗重復3 次以確保結(jié)果的可靠性。所有的數(shù)據(jù)均采用均值± 標準差（x±s）表示。SPSS 19.0 軟件包用于統(tǒng)計分析，兩組間數(shù)據(jù)比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 ARAP1-AS1 在肺腺癌中高表達 見圖1A 所示，在線數(shù)據(jù)庫GEPIA 分析ARAP1-AS1 在483例肺腺癌組織和347 例正常組織中的表達量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ARAP1-AS1 在肺腺癌組織中的表達量顯著高于癌旁組織。qRT-PCR 結(jié)果顯示：與正常肺上皮細胞相比，ARAP1-AS1 在肺腺癌細胞中普遍高表達，其在A549 和H1975 細胞中的表達量分別是其在BEAS-2B 細胞中的1.6 倍和3.26 倍（見圖1B），差異有統(tǒng)計學意義（t=6.798,11.38，均P＜0.05）。在23 對肺腺癌組織及配對癌旁組織中進行qPCR 驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ARAP1-AS1 在78%（18/23）肺腺癌組織中顯著高表達，差異有統(tǒng)計學意義（t=2.641，P＜0.05），見圖1C。

圖1 ARAP1-AS1 在肺腺癌中的表達模式（ ** P＜0.05）

2.2 ARAP1-AS1 的生物學特征 見圖2A 所示，生物信息學網(wǎng)站CPC 預測ARAP1-AS1 的編碼蛋白評分為-1.027 43，而CPAT 預測ARAP1-AS1的編碼可能性為0.043 4，均說明ARAP1-AS1 不編碼蛋白質(zhì)。在線網(wǎng)站lncLocater 預測ARAP1-AS1 可能定位于細胞質(zhì)中，見圖2B。采用胞質(zhì)核酸分離法提取細胞核與細胞質(zhì)，qRT-PCR 結(jié)果證實ARAP1-AS1 在H1975 細胞質(zhì)的表達量與在細胞核的表達量分別是0.743 和 0.248 倍，提示ARAP1-AS1 主要定位于細胞質(zhì)中，見圖2C。

圖2 ARAP1-AS1 的生物學特性

2.3 ARAP1-AS1 促進肺腺癌細胞增殖 將過表達的ARAP1-AS1 質(zhì)粒和對照載體分別轉(zhuǎn)染到A549細胞中，qRT-PCR 檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染該過表達質(zhì)粒后，ARAP1-AS1 在過表達組的表達量是對照組的14.36 倍，差異有統(tǒng)計學意義（t=23.23，P＜0.05），提示過表達模型建立成功。將靶向ARAP1-AS1的sh-RNAs 轉(zhuǎn)染H1975 細胞，qRT-PCR 法檢測ARAP1-AS1 的表達量，sh-1＃干擾片段沉默效果最好，差異有統(tǒng)計學意義（t=12.73，P＜0.05），用于后續(xù)研究（圖3A）。如圖3B 所示，ARAP1-AS1 可顯著促進肺腺癌細胞A549 的增殖能力,差異有統(tǒng)計學意義（t=2.632，P＜0.05）。同樣，在H1975 細胞中，敲低ARAP1-AS1 后發(fā)現(xiàn)，該細胞的增殖能力明顯較對照組降低，差異有統(tǒng)計學意義（t=2.621，P＜0.05）。圖3C 為平板克隆實驗檢測ARAP1-AS1 對肺癌細胞增殖能力的影響，在A549 細胞中過表達ARAP1-AS1 細胞平板克隆形成能力顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義（t=30.39，P＜0.05）；在H1975 細胞中，敲低ARAP1-AS1細胞平板克隆形成能力明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（t=6.596，P＜0.05）。

圖3 ARAP1-AS1 促進肺腺癌細胞的增殖（ ** P＜0.05）

3 討論

越來越多的研究表明，lncRNA 正在成為腫瘤發(fā)生和侵襲性進展的關(guān)鍵調(diào)控因子，被廣泛報道參與腫瘤細胞生長、轉(zhuǎn)移和耐藥[11]。LncRNA 可以通過多種機制參與疾病的發(fā)生、發(fā)展，它可以通過ceRNA 活性發(fā)揮 miRNA 海綿作用調(diào)控關(guān)鍵通路上的基因表達，也可以直接調(diào)控鄰近的編碼基因發(fā)揮生物學作用。比如LncRNA PVT1 作為 miR-199a-5p 的 ceRNA 而促進非小細胞肺癌中 HIF-1α 的表達[12-13]。而Lnc-EPIC1 可能通過靶向MYC 促進肺癌細胞生長[14]。LncRNA TUG1 在甲狀腺癌組織及細胞中高表達，促進甲狀腺癌細胞增殖和遷移，可能通過促進 EMT 的形成進而促進甲狀腺癌細胞的生物學行為[15]。

相關(guān)文獻報道ARAP1-AS1 參與胃癌、乳腺癌、宮頸癌、結(jié)直腸癌、膀胱癌等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，并可能參與糖尿病和糖尿病腎病的發(fā)病機制。ARAP1-AS1 在宮頸癌組織、細胞系和血清中顯著上調(diào)，被認為是一種有效的診斷和預后的宮頸癌的生物標志物，且過表達ARAP1-AS1 促進了宮頸癌細胞的生長和擴散，c-Myc 通過直接與位于ARAP1-AS1 啟動子上的E-box motif 結(jié)合，能夠轉(zhuǎn)錄激活ARAP1-AS1[16]。研究發(fā)現(xiàn)，ARAP1-AS1 在乳腺癌組織高表達，它的下調(diào)可抑制乳腺癌細胞的增殖，增強細胞凋亡，阻斷細胞遷移，通過調(diào)節(jié)miR-2110/HDAC2/PLIN1 信號，在乳腺癌的發(fā)展中起到腫瘤啟動子的作用[17]。TENG 等[18]認為，ARAP1-AS1 通過作為ceRNA 調(diào)控miR-4735-3p/NOTCH2 軸在膀胱癌中的表達。相關(guān)研究表明，大部分lncRNA 定位于細胞核中，但仍有部分位于細胞質(zhì)中的lncRNA 發(fā)揮著重要功能，且lncRNA 獨特的亞細胞定位模式是IncRNA 作用機制多樣性的前提[19]。

與此相一致的是，本文通過GEPIA 數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，ARAP1-AS1 在肺腺癌組織中高表達，并與23 對肺癌組織及癌旁組織進行驗證的結(jié)果相符。生物信息學預測結(jié)合亞細胞定位實驗探索其生物學特征，結(jié)果證實ARAP1-AS1 無蛋白編碼能力且主要定位于細胞質(zhì)。在肺腺癌細胞中過表達ARAP1-AS1 將促進該細胞增殖及平板克隆形成能力，反之亦然。但ARAP1-AS1 促進肺腺癌細胞增殖的具體機制仍尚未明確，后續(xù)將進一步進行深入研究。