接受主動(dòng)免疫治療的習(xí)慣性流產(chǎn)患者M(jìn)THFR基因C677T及A1298C突變與妊娠結(jié)局的相關(guān)性分析

沈 娟，舒曉芳（綿陽(yáng)市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科,四川綿陽(yáng) 621000）

習(xí)慣性流產(chǎn)主要是指自然流產(chǎn)3 次及以上的患者[1]，流行病學(xué)調(diào)查顯示[2]，習(xí)慣性流產(chǎn)的發(fā)病率為1%～5%。研究認(rèn)為，習(xí)慣性流產(chǎn)主要是由于夫妻之間的白細(xì)胞抗原相容性增加，母體免疫識(shí)別功能異常，封閉性抗體功能不足，胚胎排異性增強(qiáng)，進(jìn)而造成患者的流產(chǎn)。針對(duì)患者的免疫功能的治療，其治療率為80%～90%，但是仍有部分患者的治療效果不夠理想，復(fù)發(fā)率較高。隨著精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的研究深入，有研究報(bào)道指出[3]，基因多態(tài)性是導(dǎo)致個(gè)體在臨床疾病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)以及治療效果差異的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。在基因的多態(tài)性研究中，5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶(5,10-methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)基因位點(diǎn)的多態(tài)性是造成患者習(xí)慣性流產(chǎn)的重要原因。臨床研究發(fā)現(xiàn)，MTHFR 是葉酸代謝過(guò)程中的關(guān)鍵限速酶，而MTHFR 基因的突變會(huì)造成機(jī)體的葉酸代謝障礙，有研究指出，葉酸代謝障礙是早期流產(chǎn)的重要危險(xiǎn)因素[4]，本研究主要通過(guò)主動(dòng)免疫治療習(xí)慣性流產(chǎn)女性的妊娠結(jié)局和MTHFR基因C677T及A1298C突變相關(guān)性分析，為臨床治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 本研究采取前瞻性研究，選取2017年1月～2019年2月我院收治的120 例習(xí)慣性流產(chǎn)患者作為觀察組，年齡20～35 歲，平均年齡26.33±2.33 歲；流產(chǎn)次數(shù)3～5 次，平均3.55±1.06次 ；孕次3～5 次，孕次平均為4.11±1.26 次。另選取正常妊娠人群120 例作為對(duì)照組，其年齡在21～36歲，平均年齡26.41±2.27 歲，孕次1～3 次，孕次平均為1.39±0.45次。所有研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)，并經(jīng)倫理委員會(huì)論證通過(guò)。

患者入選標(biāo)準(zhǔn)：①符合習(xí)慣性流產(chǎn)診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；②夫妻雙方染色體正常；③宮頸分泌物檢查排除生殖道感染；④連續(xù)流產(chǎn)次數(shù)在3 次以上；⑤超聲顯示器排卵正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：①3 個(gè)月內(nèi)使用過(guò)內(nèi)分泌激素或維生素D；②配偶精液異常；③月經(jīng)周期異常；④自身免疫性疾病。

1.2 儀器與試劑 噪音影響程度采用噪聲測(cè)試儀（恒升電子，SMART）進(jìn)行測(cè)定，半巢式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)采用邁瑞Nested-PCR 儀器。

1.3 方法 觀察組患者經(jīng)過(guò)主動(dòng)免疫治療，治療周期為3 周1 次，共治療4 次。在整個(gè)治療過(guò)程中患者均進(jìn)行避孕，治療完成后患者再次妊娠。

MTHFR 基因C677T，A1298C 突變情況檢測(cè)：分別對(duì)兩組患者采集血樣，純化血漿DNA。根據(jù)Genebank 發(fā)布的人C677T 和A1298C 突變基因序列采用Primer 5.0 軟件分別對(duì)相關(guān)位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物。C677T上游引物設(shè)定為：5’-CAAAGGCCACCCCGGAGC-3’，下游引物設(shè)定為：5’-AGGAGCTGCGGTGAGAG-3’，A1298C 上游引物設(shè)定為：5’-CTTTGGGAGCTAAG GACTACTACTAC-3’，下游引物設(shè)定為：5’-CACT TTGTGACCATTCCGGTTG-3’進(jìn)行擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系為25μl，其中含10×buffer2.5μl、dNTPS 1μl、Taq DNA 聚合酶0.4μl、DNA 模板1μl、引物1μl、ddH2O 補(bǔ)足。擴(kuò)增方法：95℃條件下預(yù)變性5 min，94℃變性0.5 min，50～60℃退火時(shí)間30s，72℃延伸10 min，一共35 個(gè)循環(huán)。通過(guò)試劑盒對(duì)目標(biāo)片段回收，處理后通過(guò)DNA 測(cè)序儀完成測(cè)定?；虻姆中筒捎冒氤彩骄酆厦告?zhǔn)椒磻?yīng)，樣本的基因進(jìn)行多態(tài)性分型。記錄兩組研究對(duì)象MTHFR 基因C677T,A1298C 位點(diǎn)基因型。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料以（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用logistic 回歸分析研究習(xí)慣性流產(chǎn)發(fā)生的危險(xiǎn)因素及主動(dòng)免疫治療失敗的危險(xiǎn)因素，基因頻率的觀察值以及預(yù)測(cè)值的比較采用Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)，以P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn) 通過(guò)對(duì)患者的Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)分析，患者的MTHFR 基因C677T 位點(diǎn)基因多態(tài)性分布符合hHardy-Weinberg 平衡（χ2=0.062，P=0.776），數(shù)據(jù)來(lái)自同一個(gè)樣本群體。

2.2 習(xí)慣性流產(chǎn)發(fā)生的單因素及l(fā)ogistic 回歸分析 見(jiàn)表1。觀察組與對(duì)照組的文化程度（χ2=5.002，P=0.025）、孕次（χ2=138.947，P=0.000）、丈夫飲酒（χ2=12.343，P=0.000）、生殖道感染（χ2=60.828，P=0.000）、孕期被動(dòng)吸煙（χ2=5.822，P=0.025）、噪音影響（χ2=7.680，P=0.006）、噪音影響程度（χ2=8.848，P=0.003）、C677T 位點(diǎn)基因型（χ2=7.651，P=0.022）及等位基因（χ2=8.861，P=0.003）之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 習(xí)慣性流產(chǎn)發(fā)生的單因素分析[n(%)]

2.3 習(xí)慣性流產(chǎn)發(fā)生的多因素logistic 回歸分析 見(jiàn)表2。通過(guò)多因素分析，文化程度為初中及以下（OR=1.131，95%CI 1.021～1.252）、丈夫飲酒（OR=1.119，95%CI 1.030～1.214）、孕次≥4 次（OR=1.571，95%CI 1.144～2.159）、生殖道感染（OR=3.766，95%CI 1.381～10.273）、孕期被動(dòng)吸煙（OR= 3.010，95%CI 1.504～6.025）、噪音影響（OR=15.014，95%CI 1.477～152.579） 以及噪音影響程度在6 h/day 以上（OR=22.466，95%CI 3.109～162.331）、C677T 位點(diǎn)基因型為T(mén)T（OR=21.977，95%CI 2.055～235.013）、CT（OR=20.328，95%CI 1.828～226.069），C677T 位點(diǎn)等位基因?yàn)門(mén)（OR =55.202，95%CI 9.385～324.680）均是造成患者習(xí)慣性流產(chǎn)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

表2 習(xí)慣性流產(chǎn)發(fā)生的多因素logistic 回歸分析

2.4 觀察組妊娠結(jié)局 經(jīng)過(guò)免疫治療后，隨訪1年，隨訪率為100%，無(wú)失訪患者。所有患者均順利妊娠，其中79 例成功妊娠，41 例再次流產(chǎn)。

2.5 主動(dòng)免疫治療后再次流產(chǎn)單因素分析 見(jiàn)表3。再次流產(chǎn)組以及成功妊娠組患者的文化程度（χ2=33.812，P=0.000）、丈夫飲酒（χ2=4.081，P=0.043）、生殖道感染（χ2=7.667，P=0.006）、孕期被動(dòng)吸煙（χ2=10.142，P=0.001）、噪音影響（χ2=4.321，P=0.038）、噪音影響程度（χ2=6.421，P=0.011）、C677T 位 點(diǎn) 基 因 型（χ2=37.591，P=0.000）及等位基因（χ2=8.032，P=0.005）之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 再次流產(chǎn)單因素分析

2.6 主動(dòng)免疫治療后再次流產(chǎn)多因素分析 見(jiàn)表4。通過(guò)多因素分析，文化程度為初中及以下（OR=4.415，95%CI 1.647～11.833）、丈 夫 飲酒（OR=6.801，95%CI1.382～33.464）、生殖道感染（OR=5.371，95%CI0.915～31.528）、孕期被動(dòng)吸煙（OR=6.001，95%CI1.682～21.414）、噪音影響（OR=6.966，95%CI1.844～26.308） 以及噪音影響程度在6 h/day 以上（OR=6.322，95%CI1.846～21.647）、C677T 位點(diǎn)基因型為T(mén)T（OR=4.280，95%CI 1.536～11.93）、CT（OR=6.699，95%CI1.596～28.127），C677T 位點(diǎn)等位基因?yàn)門(mén)（OR=5.468，95%CI 2.228～13.419）均是造成患者主動(dòng)免疫治療后再次流產(chǎn)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

3 討論

人類的MTHFR 基因主要位于染色體Iq36.3，主要包含10 個(gè)內(nèi)含子以及11 個(gè)外顯子。在MTHFR基因C677T 突變過(guò)程中，堿基C 逐步變異為T(mén)，造成患者的丙氨酸與纈氨酸之間的轉(zhuǎn)換，葉酸代謝過(guò)程中的酶類物質(zhì)的活性下降，同時(shí)也會(huì)造成酶類物質(zhì)對(duì)熱的反應(yīng)性發(fā)生改變，是MTHFR 基因重要的不耐熱錯(cuò)義突變之一[7]。同時(shí)，隨著患者的MTHFR 基因突變，在一定程度上還可造成患者的同型半胱氨酸的升高，在臨床治療中，同型半胱氨酸是腦梗死患者的重要危險(xiǎn)因素，隨著機(jī)體的同型半胱氨酸水平的升高，患者的子宮以及卵巢的內(nèi)皮功能嚴(yán)重受損，同時(shí)凝血以及抗凝系統(tǒng)異常，血栓形成風(fēng)險(xiǎn)升高，胎盤(pán)栓塞風(fēng)險(xiǎn)升高，終引發(fā)復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)的頻率升高[8]。在MTHFR 基因的代謝過(guò)程中，甲基供體生成以及核苷酸重新合成具有重要的作用。而在此過(guò)程中，由于MTHFR 基因的突變?cè)斐傻娜~酸代謝異常，在一定程度上可誘導(dǎo)DNA的甲基化的畸形，進(jìn)一步降低了DNA 復(fù)制以及修復(fù)效率的降低[9]，而隨著胎盤(pán)組織的MTHFR 活性成分的降低，進(jìn)一步導(dǎo)致孕婦體內(nèi)葉酸水平的下降，導(dǎo)致DNA 甲基化以及修復(fù)能力的失衡，導(dǎo)致流產(chǎn)的發(fā)生[10]。本研究中，在對(duì)MTHFR 基因C677T位點(diǎn)基因型以及等位基因的研究中，隨著患者的T等位基因的升高，患者習(xí)慣性流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)升高，王勉勉等[11]在對(duì)MTHFR 基因的多態(tài)性分析中也提出，隨著患者的MTHFR 基因C677T 位點(diǎn)基因型以及等位基因的改變，均會(huì)造成患者自然流產(chǎn)率的升高。徐佳佳等[12]通過(guò)對(duì)患者的MTHFR 基因C677T 位點(diǎn)基因型以及等位基因的改變與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的研究中指出，隨著堿基T 的替代，患者復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)升高，與本研究一致。另外本研究通過(guò)多因素分析顯示，文化程度為初中及以下、丈夫飲酒、生殖道感染、孕期被動(dòng)吸煙、噪音影響以及噪音影響程度在6 h/day 以上也是造成患者反復(fù)性流產(chǎn)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。提示，外界的負(fù)面刺激也可能通過(guò)對(duì)MTHFR 基因C677T 位點(diǎn)基因突變的促進(jìn)性作用，進(jìn)一步造成患者的疾病發(fā)生。

在習(xí)慣性流產(chǎn)的研究中，目前主要認(rèn)為其病因與機(jī)體的免疫機(jī)制相關(guān)。人類白細(xì)胞抗原的相容性、封閉抗體的缺乏、T 淋巴細(xì)胞的失衡以及滋養(yǎng)層細(xì)胞的抗原水平異常均是造成患者復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的原因。而在針對(duì)以上病因的治療中，主要采取主動(dòng)免疫治療。通過(guò)采取供體的淋巴細(xì)胞對(duì)習(xí)慣性流產(chǎn)患者的治療，90%的習(xí)慣性流產(chǎn)患者會(huì)產(chǎn)生有效的封閉抗體，進(jìn)而會(huì)對(duì)胎兒產(chǎn)生保護(hù)性作用。但是，隨著MTHFR 基因突變，通過(guò)對(duì)患者的主動(dòng)免疫治療，其治療效果受到葉酸代謝障礙的影響，其封閉性抗體水平的效率下降，最終造成不良妊娠結(jié)局的產(chǎn)生。有研究顯示[14]，在對(duì)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者進(jìn)行主動(dòng)免疫治療時(shí)，患者淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞具有調(diào)節(jié)作用，能提高患者的封閉抗體以及混合淋巴細(xì)胞反映封閉因子水平。同時(shí)，通過(guò)對(duì)患者的T 細(xì)胞水平進(jìn)行調(diào)節(jié)能夠促進(jìn)抗體的分泌。在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者中，由于患者的免疫耐受機(jī)制的失衡，導(dǎo)致母體對(duì)胎兒產(chǎn)生的排異作用，進(jìn)一步促進(jìn)了流產(chǎn)的發(fā)生。而MTHFR 基因C677T 位點(diǎn)基因型以及等位基因的改變則在一定程度上會(huì)造成患者的局部免疫細(xì)胞代謝發(fā)生改變，嚴(yán)重影響患者的治療預(yù)后。

在本研究中，通過(guò)對(duì)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者的主動(dòng)免疫治療，患者成功妊娠率在100%，妊娠后再次流產(chǎn)的患者發(fā)病率為65.83%。王燕等[15]通過(guò)對(duì)反復(fù)自然流產(chǎn)患者的主動(dòng)免疫治療，患者的成功妊娠率為67.12%，與本研究相互印證。

而在對(duì)主動(dòng)免疫治療后的患者的臨床效果與MTHFR 基因C677T 位點(diǎn)基因突變情況的相關(guān)性分析顯示，患者的MTHFR 基因C677T 位點(diǎn)突變也是影響患者治療效果的重要因素。文化程度為初中及以下、丈夫飲酒、生殖道感染、孕期被動(dòng)吸煙、噪音影響以及噪音影響程度在6 h/day 以上也可通過(guò)對(duì)MTHFR 基因C677T 位點(diǎn)突變的影響，進(jìn)而影響患者的主動(dòng)免疫治療效果。分析認(rèn)為，隨著患者的MTHFR 基因C677T 位點(diǎn)突變，患者的胎盤(pán)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，特發(fā)性抗磷脂抗體下降，進(jìn)一步造成胎盤(pán)早期的丟失，對(duì)于患者的主動(dòng)免疫治療效果具有負(fù)面影響。

但是本研究存在一定的局限性，基因多態(tài)性的研究多存在一定的地域局限性，關(guān)于MTHFR 基因C677T 位點(diǎn)的突變與習(xí)慣性流產(chǎn)患者的深入研究有待在日后的研究中進(jìn)行大樣本研究。

綜上所述，MTHFR 基因C677T 位點(diǎn)的等位基因以及基因型的突變對(duì)習(xí)慣性流產(chǎn)以及主動(dòng)免疫治療后的不良妊娠結(jié)局具有促進(jìn)作用，建議對(duì)此類患者進(jìn)行治療中加強(qiáng)干預(yù)。