慢性阻塞性肺疾病患者Nrf2基因多態(tài)性與肺功能及臨床病情判斷的相關(guān)性研究

閆海燕，楊云秀，楊云華，宋曉偉，緱 劍

(1.咸陽市第一人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,陜西咸陽 712000；2.陜西唐華四棉醫(yī)院呼吸科，西安 710038；3.西安北車醫(yī)院內(nèi)科，西安 710085)

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是以持續(xù)氣流受限為特征的呼吸道疾病，呈進(jìn)行性發(fā)展，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，最終導(dǎo)致右心衰竭等嚴(yán)重后果[1-2]。報(bào)道發(fā)現(xiàn)COPD 已成為國內(nèi)第四大死因[3]。目前，肺功能檢查作為診斷COPD 的金標(biāo)準(zhǔn)已廣泛用于臨床，但研究顯示COPD 臨床病情還與全身效應(yīng)有關(guān)[4-6]。核因子相關(guān)因子2（Nuclear factor erythroid-2-related factor2，Nrf2）為轉(zhuǎn)錄因子家族成員，參與氧化應(yīng)激過程[7]。有動物實(shí)驗(yàn)顯示Nrf2介導(dǎo)的抗氧化作用可影響哮喘易感性[8]。但目前有關(guān)Nrf2 與COPD 的關(guān)系，臨床研究尚屬少見。本研究納入78 例COPD 患者作為研究對象，探討Nrf2 基因多態(tài)性在COPD 診療中的作用。報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象 納入2018年6月～2020年6月78例COPD 患者作為研究對象，其中男性48 例，女性30 例；年齡59.21±13.74 歲；體重指數(shù)20.18±2.32 kg/m2。納入標(biāo)準(zhǔn)：①COPD 診斷符合中華醫(yī)學(xué)會推薦指南標(biāo)準(zhǔn)[9]；②均在本院接受規(guī)范住院治療；③患者均對研究內(nèi)容知情同意，并簽署知情同意書。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①并發(fā)有肺結(jié)核、支氣管擴(kuò)張及肺源性心臟病者；②肝腎功能嚴(yán)重不全者；③并發(fā)有惡性腫瘤者；④對治療藥物過敏或未能順利完成治療者。

1.2 儀器和試劑 引物由美國Invitrogen 公司設(shè)計(jì)，PCR 酶由上海圣爾生物科技有限公司提供，illumina NovaSeq6000DNA 測序儀（上海士森視覺科技有限公司）。肺功能儀為Geratherm Spirostik Complete 型肺功能儀。

1.3 方法 采集清晨肘靜脈血5ml，以酚-氯仿法提取基因組DNA，冷凍保存?zhèn)溆?。參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)引物：上游：5’-CCTAAAGGGGCTTCTCGG-3’，下游：5’-CGTTGCAATATCA-3’，PCR 片段長度262bp。擴(kuò)增體系20μl，包括PCR Max 5.0μl，上下游引物各1.0μl，DNA 模板1.0μl，雙蒸水12μl。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性120s，90 ℃變性30s，50 ℃退火30s，72 ℃延伸45s，90 ℃變性45s，45℃退火30s，45 個循環(huán)。72℃延伸10min。PCR 擴(kuò)增后，以1.5g/dl 瓊脂糖凝膠確定是否擴(kuò)張成功。用測序儀進(jìn)行測序，并以直接測序法驗(yàn)證結(jié)果。

分別在治療前和治療后采用肺功能儀檢測用力肺活量（forced vital capacity，F(xiàn)VC），一秒鐘用力呼氣量（forced expiratory volume in one second，F(xiàn)EV1%）及最大通氣量（maximal ventilation volume，MVV）水平，計(jì)算FEV1/FVC。在治療1 個療程后評估療效[10]。顯效：臨床癥狀明顯好轉(zhuǎn)，意識清晰，肺功能分級降低2 級及以上，無低氧血癥；有效：臨床癥狀緩解，意識清楚，肺功能分級降低1 級；無效：臨床癥狀無明顯改善。以（顯效+有效）/總例數(shù)×100%計(jì)算總有效率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 選用SPSS24.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較行重復(fù)測量方差分析，兩兩比較行LSD-t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以（%）表示，組間行χ2檢驗(yàn)，預(yù)測價值采用受試者工作曲線（receiver operator characteristic，ROC）分析，結(jié)果以曲線下面積（area under curve，AUC）表示，以AUC＞0.75 為判斷價值高，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同Nrf2 基因型COPD 患者肺功能分級見表1。Nrf2 基因多態(tài)性檢測結(jié)果顯示CC 型20例，CA 型30 例，AA 型28 例。不同Nrf2 基因型COPD 患者肺功能分級比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=15.452，P＜0.001）。

表1 不同Nrf2 基因型COPD 患者肺功能分級[n（%）]

2.2 Nrf2 基因型與肺功能指標(biāo)關(guān)系 見表2。治療前和治療后不同Nrf2 基因型COPD 患者FVC，F(xiàn)EV1%，F(xiàn)EV1/FVC 及MVV 水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 Nrf2 基因型與肺功能指標(biāo)關(guān)系（x±s）

2.3 Nrf2 基因型判斷COPD 療效的ROC 分析 見圖1。ROC 分析顯示，Nrf2 基因多態(tài)性對判斷COPD 治療效果的AUC 為0.796（SE=0.056，95%CI=0.687～0.905，P=0.001），敏感度0.767，特異度為0.729。

圖1 Nrf2 基因型判斷COPD 療效的ROC 分析

2.4 不同療效患者Nrf2 基因型分布 見表3。78 例患者顯效48 例，有效17 例，無效13 例。有效率83.33%。不同療效COPD 患者Nrf2 基因型分布比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=10.959，P＜0.001，）。

表3 不同療效患者Nrf2 基因型分布[n(%)]

3 討論

隨著分子生物學(xué)研究深入，有關(guān)COPD 基因易感性問題逐漸引起臨床重視[11]。對COPD 基因易感性的研究可對高風(fēng)險人群進(jìn)行早期防治，降低COPD 發(fā)生率，并為COPD 臨床個體化治療提供依據(jù)，部分患者病情可在早期得到逆轉(zhuǎn)[12]。Nrf2 編碼基因位于2q31，通過與抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response elements，ARE）位點(diǎn)結(jié)合從而達(dá)到調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)作用。葉繁等[13]報(bào)道顯示Nrf2 可調(diào)節(jié)γ-谷氨酰半胱氨酸合酶水平，影響肺氧化劑谷胱甘肽表達(dá)，而ANO 等[14]的研究則說明Nrf2 對變態(tài)反應(yīng)和氣道高反應(yīng)性具有抑制作用，防止黏液細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞增生浸潤。上述機(jī)制提示Nrf2 在COPD 中可能起到保護(hù)防御作用。

Nrf2 與機(jī)體抗氧化應(yīng)激關(guān)系密切。當(dāng)機(jī)體受到吸煙、氣候變化等因素刺激時，Nrf2 便從Keap1-Nrf2 復(fù)合物中解離，通過穿梭運(yùn)動進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，再與ARE 啟動子區(qū)結(jié)合，發(fā)揮抑制氧化應(yīng)激損傷作用[15]。另外，有研究顯示Nrf2 可通過調(diào)控苯醌還原酶、磷酸肌醇-3-激酶等[16-17]，進(jìn)一步發(fā)揮保護(hù)肺功能作用。楊曼等[18]敲除COPD 小鼠模型Nrf2基因，結(jié)果顯示肺組織損傷加重，肺氣腫發(fā)生率明顯升高，這也說明Nrf2 參與COPD 病理進(jìn)程。本研究對比不同基因型患者肺功能，結(jié)果顯示不同基因型患者肺功能分級差異顯著，提示Nrf2 單核苷酸多態(tài)性可能與COPD 肺功能水平相關(guān)，而rs6721961位點(diǎn)基因突變則可能顯著增加COPD 風(fēng)險。

另外，本研究對比了不同療效患者Nrf2 基因型分布，結(jié)果顯示AA 型患者總有效率顯著低于其他兩種分型，提示Nrf2 基因多態(tài)性可能影響COPD治療效果，這也進(jìn)一步說明Nrf2 基因型與COPD相關(guān)。而這對指導(dǎo)臨床進(jìn)行個體化治療具有重要意義。本研究采用ROC 分析，結(jié)果也發(fā)現(xiàn)Nrf2 基因型對預(yù)測療效具有較高準(zhǔn)確性。因而，對于AA 基因型患者，臨床應(yīng)采取聯(lián)合治療，以保證療效。

綜上，Nrf2 基因多態(tài)性與COPD 病情相關(guān)，檢測Nrf2 基因多態(tài)性有助于預(yù)測療效，為臨床干預(yù)提供依據(jù)。