乳腺癌患者血清長鏈非編碼RNA mir4435-2HG表達(dá)水平與臨床病理特征的相關(guān)性研究

呂美玲，馬婕群，陳海艷

(1.長安大學(xué)醫(yī)院內(nèi)科，西安 710064；2.陜西省腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，西安 710061；3.西安國際醫(yī)學(xué)中心醫(yī)院腫瘤科，西安 710100）

乳腺癌(breast cancer,BC)是嚴(yán)重威脅全球女性生命健康最常見的惡性腫瘤，目前高居女性癌癥之首，平均每年以4%的速度持續(xù)上升且呈年輕化趨勢[1-3]，其發(fā)病隱匿、致死率高、診斷相對(duì)延遲仍是臨床存在的重大問題。因此，尋找一種新型且有效的腫瘤標(biāo)志物為BC 的診斷提供更為準(zhǔn)確和及時(shí)的信息尤為重要。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lnc RNA)可通過參與轉(zhuǎn)錄激活、基因沉默和染色體修飾等影響惡性腫瘤的生物學(xué)行為[4]，近年來研究發(fā)現(xiàn)lnc RNA mir4435-2HG 具有促進(jìn)胃癌增殖、遷移和侵襲的作用[5]，其還可用作口腔鱗狀細(xì)胞癌的預(yù)后標(biāo)志物。目前關(guān)于lnc RNA mir4435-2HG 與BC 的關(guān)聯(lián)研究尚未見，因此本研究通過比較BC 組和乳腺良性疾病組血清中l(wèi)nc RNA mir4435-2HG 相對(duì)表達(dá)量的差異，分析lnc RNA mir4435-2HG 與BC 患者各臨床病理特征的關(guān)系，旨在為BC 的診斷和預(yù)后判斷提供新的參考。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2016年8月～2017年7月長安大學(xué)醫(yī)院收治的52 例BC 患者為BC 組，選擇同期49 例乳腺良性疾病患者為乳腺良性疾病組，其中乳腺纖維腺瘤18 例、乳腺囊性增生14 例和漿細(xì)胞性乳腺炎17 例，另隨機(jī)納入同期45 例體檢健康的志愿者為健康對(duì)照組。根據(jù)TNM 分期BC 組患者包含I 期8 例、II 期21 例、III 期18 例、IV 期5例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移17 例，淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移35 例；孕激素受體(progesterone receptor,PR)陽性31 例，陰性21 例；雌激素受體(estrogen receptor,ER)陽性38 例，陰性14 例；人表皮生長因子受體2（Her2）陽性40 例，陰性12 例，本研究經(jīng)由我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，三組的一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①BC 組納入患者術(shù)后均經(jīng)病理學(xué)檢查確診；②臨床資料完整者；③自愿參加且均簽署知情同意書。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①其他腫瘤史者；②伴有嚴(yán)重器質(zhì)性疾病和慢性疾病者；③遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移者。

1.2 儀器與試劑 Trizol 試劑購自Invitrogen 公司，SYBR Green Realtime PCR Master Mix 擴(kuò)增試劑盒購自日本ToYoBo 公司，TakaRa Prime-Script RT reagent kit 購自大連寶生物工程有限公司，血清RNA 提取試劑盒購自北京天根公司，ABI 7500 Fast 熒光定量PCR 儀(美國ABI 公司)，lnc RNA mir4435-2HG 及內(nèi)參引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 方法 術(shù)前空腹抽取受試者靜脈血2 ml，于4℃條件下12 000 r/min 離心10 min 分離血清，采用血清RNA 提取試劑盒提取血清總RNA，采用TakaRa Prime-Script RT reagent kit 將血清總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)檢測血清lnc RNA mir4435-2HG 和內(nèi)參基因GAPDH 的水平，lnc RNA mir4435-2HG 引物序列為：F:5’-AGACAAGCCGT GCCTGAG-3’，R:5’-ATCTTTCAGCTGCATTCC GG-3’；GAPDH 引物序列為：F:5’-CGGAGTCAAC GGATTTGGTCGTAT-3’，R:5’-AGCCTTCTCCATG GTGGTGAAGAC-3’。反應(yīng)條件依次為：95℃預(yù)變性2 min，95℃ 5s，60℃25s 共40 個(gè)循環(huán)，用2－ΔΔCt表示lnc RNA mir4435-2HG 的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，滿足正態(tài)性分布及方差齊性的計(jì)量資料以(x±s)表示，采用t檢驗(yàn)，呈非正態(tài)分布，用M(P25，P75)表示，多組間比較采用Kruskal-Wallis H 檢驗(yàn)，兩組間比較采用非參Mann-WhineyU檢驗(yàn)，lnc RNA mir4435-2HG 的診斷價(jià)值分析采用ROC 曲線。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組lnc RNA mir4435-2HG 相對(duì)表達(dá)量的比較 血清lnc RNA mir4435-2HG 在BC 組[2.04(1.41，3.96)]，乳腺良性疾病組[1.21(1.00，1.39)]和健康對(duì)照組[0.99(0.84，1.15)]的相對(duì)表達(dá)量比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=28.73，P=0.00)，BC 組血清lnc RNA mir4435-2HG 的相對(duì)表達(dá)量高于乳腺良性疾病組(U=89.23，P=0.01)和健康對(duì)照組(U=91.46，P=0.02)。

2.2 血清lnc RNA mir4435-2HG 與患者臨床病理特征的關(guān)系 見表1。BC 患者血清lnc RNA mir4435-2HG 與年齡和腫瘤大小無顯著的相關(guān)性(P＞0.05)，而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期、ER，PR 和Her2 有顯著的相關(guān)性(P＜0.05)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 血清lnc RNA mir4435-2HG 與患者臨床病理特征的關(guān)系[M(P25,P75)]

2.3 lnc RNA mir4435-2HG 診斷BC 的ROC 曲線 見圖1。繪制lnc RNA mir4435-2HG 診斷BC 的ROC曲線，曲線下面積(area under the curve,AUC)為0.84(95%CI:0.72～0.91，P＜0.01)，參考約登指數(shù)的最大值確定lnc RNA mir4435-2HG 診斷BC 的最佳截?cái)嘀禐?.69，該截?cái)嘀祵?duì)應(yīng)的靈敏度和特異度分別為80.25%和70.91%。

圖1 lnc RNA mir4435-2HG 診斷BC 的ROC 曲線

3 討論

BC 位居女性惡性腫瘤的首位，約占全身惡性腫瘤的10%，每年約以4%的速度持續(xù)上升[6-7]。其致死率高且起病較隱匿，嚴(yán)重危害女性的身體健康。目前，臨床上使用的CA153 被指靈敏度和特異度均不高[8-10]?；诖?，尋找一種新型且有效的腫瘤標(biāo)志物為BC 的診斷提供更為準(zhǔn)確、及時(shí)的信息意義重大。Lnc RNA 可通過表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控等在腫瘤中發(fā)揮多種生物學(xué)功能。早期lnc RNA mir4435-2HG 研究主要是在色素性視網(wǎng)膜炎作用方面，MIAO 等[11]近期指出lnc RNA mir4435-2HG 促進(jìn)胃癌的增殖、轉(zhuǎn)移和遷移，早期有文獻(xiàn)報(bào)道指出血清lnc RNA mir4435-2HG 在口腔鱗狀細(xì)胞癌中呈異常低表達(dá)且其具有較好的預(yù)測預(yù)后的價(jià)值。倪文昌等[12]指出lnc RNA mir4435-2HG 可通過靶向miR-873-5p 調(diào)控神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲。QIAN 等[13]指出lnc RNA mir4435-2HG 在肺癌組織中呈高表達(dá)，高表達(dá)的mir4435-2HG 可促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖與侵襲作用。

目前在臨床診療中BC 通用的腫瘤標(biāo)志物為ER，PR 和Her2。ER 和PR 是女性重要的激素受體，同時(shí)也是激素依賴性BC 患者較直觀的腫瘤標(biāo)記物。ER 和PR 與激素反應(yīng)生成的復(fù)合物對(duì)癌組織分化、增殖發(fā)揮重要作用。Her2 是內(nèi)源性的跨膜受體糖蛋白，其具有較強(qiáng)的酪氨酸激酶(tyrosine kinase,TK)活性，可顯著提升癌組織的增殖活性，因此Her2常與癌組織分化程度相關(guān)聯(lián)。本研究結(jié)果提示lnc RNA mir4435-2HG 與ER，PR 和Her2 呈顯著相關(guān)關(guān)系，提示高表達(dá)的lnc RNA mir4435-2HG 可能成為ER，PR 和Her2 BC 的靶點(diǎn)。

本研究結(jié)果顯示，血清lnc RNA mir4435-2HG在BC 中呈高表達(dá)，這可能是由于lnc RNA mir4435-2HG 扮演癌基因的角色，表達(dá)于BC 患者循環(huán)外周血液中，其可為BC 的診斷提供參考和依據(jù)。血清lnc RNA mir4435-2HG 與BC 患者的某些病理特征有關(guān)，比如淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，提示lnc RNA mir4435-2HG 可能參與了BC 的侵襲遷移過程；TNM 分期，提示lnc RNA mir4435-2HG 可能參與了BC 的惡性轉(zhuǎn)化。ROC 曲線結(jié)果顯示，lnc RNA mir4435-2HG診斷BC 的最佳截?cái)嘀禐?.69，靈敏度和特異度分別為80.25%和70.91%。

綜上所述，lnc RNA mir4435-2HG 在BC 血清中高表達(dá)，可作為BC 的潛在生物學(xué)標(biāo)志物。但由于本研究選取的樣本數(shù)量有限，且缺少預(yù)后和療效觀察的相關(guān)研究。在后續(xù)工作中，將加大樣本研究數(shù)量、進(jìn)行隨訪和功能研究，以進(jìn)一步驗(yàn)證lnc RNA mir4435-2HG 在BC 中的診斷和應(yīng)用價(jià)值。