深圳地區(qū)類風濕關節(jié)炎患者IL-17A基因rs2275913位點多態(tài)性與血清中IL-17A，IL-38水平表達的相關性研究

雷明玲，彭常基，張肄鵬，楊海珊

（1.深圳市龍華區(qū)中心醫(yī)院檢驗科，廣東深圳 518110；2.深圳市龍崗區(qū)南灣預防保健所，廣東深圳 518114）

類風濕關節(jié)炎（rheumatic arthritis，RA）是以侵蝕性關節(jié)炎為主要病變的一種全身慢性自身免疫性疾病，主要表現為關節(jié)炎癥、滑膜T 細胞浸潤及滑膜增生，并伴有軟骨和骨的侵蝕及漸進性關節(jié)破壞，其致畸和致殘率高，嚴重影響人們健康和生活質量[1-2]。但RA 發(fā)病機制至今不明，有研究表明，RA 發(fā)病可能與炎性細胞因子產生有關，其中白介素-17（IL-17）是輔助性T 細胞17（Th17）分泌的一種主要效應因子，能誘發(fā)并促進炎癥發(fā)生，與RA 發(fā)生和發(fā)展有關[3-5]。IL-38 是最近新發(fā)現的一種抑炎因子，與IL-36 受體結合，能抑制Th17 相關細胞因子如IL-17，IL-22 等的合成，在自身免疫性關節(jié)炎中發(fā)揮抗炎作用[6-8]。同時研究表明，IL-17基因單核苷酸多態(tài)性可影響IL-17 的產生而與多種自身免疫性疾病有關，其中IL-17F 基因多態(tài)性與RA 發(fā)病相關性已見報道[9]，但IL-17A 基因多態(tài)性與RA 發(fā)病相關性未見報道，且基因多態(tài)性分布具有區(qū)域和種族性差異。為此，本研究對深圳地區(qū)103 例RA 患者和116 例非RA 健康人群IL-17A基因rs2275913位點多態(tài)性與血清中IL-17A，IL-38水平表達的相關性進行了對比分析，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選擇2019年2月～2020年10月在深圳市龍華區(qū)中心醫(yī)院確診的RA 患者103 例，其中男性27 例，女性76 例，男∶女為1∶2.81，年齡35～72 歲，平均年齡49.63±12.75 歲。所有患者均符合RA 診斷標準，并根據RA 疾病活動度評分標準（DSA280）[10]進行分期，其中輕度活動組29 例（DSA28＜3.2），中度活動組56 例（3.2＜DSA28＜5.1），高度活動組18 例（DSA28＞5.1）。納入標準：①符合RA 診斷標準；②初確診者；③未使用抗風濕藥；④醫(yī)院倫理委員會同意批準；⑤患者及家屬知情同意。排除標準：①伴有其他自身免疫性疾病者；②病情加重者；③伴有腫瘤、糖尿病及血液等疾病者；④伴有嚴重器質性病變者；⑤需采取非常規(guī)治療者；⑥懷孕及哺乳期婦女。選擇同期非RA 疾病的健康人群116 例，其中男性31 例，女性85 例，男∶女為1∶2.74，年齡33～74 歲，平均年齡50.27±13.52 歲，均無自身免疫性疾病、骨及關節(jié)相關性疾病。確保兩組的年齡、性別及男女比例等一般性資料差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 儀器與試劑 DXI800 全自動化學發(fā)光免疫分析儀由美國Bankman 公司提供；DNA 提取試劑盒由深圳亞能生物技術有限公司提供；ABI7500 PCR基因擴增儀由美國ABI 公司提供。

1.3 方法

1.3.1 標本采集：于清晨空腹采集5 ～6ml 靜脈血，其中2～3ml 加入乙二胺四乙酸二鉀（EDTA-K2）抗凝管內上下充分顛倒混勻用于全血DNA 提取，剩余的加入無抗凝劑的一次性干燥管內，30min 后分離血清用于IL-17A，IL-38 及RF 水平檢測。

1.3.2 IL-17A，IL-38 及RF 水平測定：采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測血清中IL-17A 和IL-38水平，RF 水平采用免疫比濁法進行檢測，所有操作均嚴格按照儀器和試劑盒說明書進行，并由專人成批次檢測，確保結果的準確性和可比性。

1.3.3 全血DNA 提?。翰捎肈NA 提取試劑盒（深圳亞能生物技術有限公司提供）提取外周血中單個核細胞的基因組DNA，對合格的DNA 提取標本用雙蒸水稀釋至100ng/L，于-20℃冰箱內備用。

1.3.4 多態(tài)性分析：采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）法對IL-17A基因rs2275913位點多態(tài)性進行分析，具體操作參照文獻[11]。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用GraphPad Prism 5 軟件，計量資料以均值±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數資料以率（%）表示，兩組間比較采用χ2檢驗，多組間比較采用方差檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組IL-17A，IL-38 及RF 水平比較 見表1。RA 組IL-17A 和RF 水平比對照組明顯升高，而IL-38 水平比對照組明顯降低，兩組比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。

表1 兩組IL-17A，IL-38 及RF 水平比較（x±s）

2.2 RA 組不同活動度患者IL-17A，IL-38 及RF 水平比較 見表2。RA 組隨著病情活動度的加重IL-17A 和RF 水平明顯升高，而IL-38 水平明顯降低，不同活動度間差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。

表2 RA 組不同活動度患者IL-17A，IL-38 及RF 水平比較（x±s）

2.3 兩組IL-17A基因rs2275913位點基因型和等位基因檢出率比較 見表3。RA 組IL-17A基因rs2275913位點AA 基因型和A 等位基因檢出率比對照組明顯升高，兩組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表3 兩組IL-17A基因rs2275913位點基因型和等位基因檢出率比較[n(%)]

2.4 RA 組不同基因型患者IL-17A，IL-38 及RF水平比較 見表4。RA 組AA 基因型IL-17A 水平比AG 和GG 基因型明顯升高，而IL-38 水平明顯降低，不同基因型之間差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），但不同基因型RF 水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表4 RA 組不同基因型患者IL-17A，IL-38 及RF 水平比較（x±s）

2.5 RA 組IL-17A 與IL-38，RF 水平相關性分析 RA組IL-17A 和RF 水平明顯升高，而IL-38 水平明顯降低，經Spearman 相關性分析，結果顯示RA 組血清中IL-17A 與RF 水平呈正相關（r=0.5012，P＜0.05），而與IL-38 水平呈負相關（r=-0.6924，P＜0.05）。

3 討論

IL-17 主要由活化的T 細胞產生誘導炎癥反應的一種早期啟動因子，與受體結合后，可通過絲裂原活化蛋白（MAP）激酶和核轉錄因子kB（nuclearfactor kB，NF-kB）途徑促進T 細胞激活和刺激上皮細胞、內皮細胞、成纖維細胞產生IL-6，IL-8，粒細胞-巨噬細胞刺激因子（GM-CSF）、化學增活素及細胞黏附分子1（cellular adhesion molecule 1，CAM-1）等多種細胞因子，從而導致炎癥產生。另外，IL-17 還可通過促進釋放前炎性細胞因子來放大炎癥反應。有研究表明，IL-17 與RA 的發(fā)生和發(fā)展有密切關系，甚至發(fā)揮了至關重要的作用[4-5,12]。RF 是一種抗人或動物IgG 分子Fc 片段抗原決定簇的自身抗體，與體內變性結合形成免疫復合物是導致自身免疫病骨關節(jié)損傷的主要病理基礎，與關節(jié)、骨侵蝕及關節(jié)外表現發(fā)病有一定關系，可作為評價RA 病情與預后的一個重要指標，是診斷RA 最早的血清學指標[13]。IL-38 是IL-1 家族成員之一，可與IL-1R1，IL-36R及類IL-1R 輔助蛋白1（IL-1RAPL1）結合，可通過抑制NF-kB，絲裂原激活蛋白激酶（MAPK）及磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）等下游信號通路，抑制許多炎癥因子產生而發(fā)揮抑炎作用。同時IL-38 可調節(jié)巨噬細胞和樹突狀細胞，繼而抑制Th17 細胞反應。此外，IL-38 還可調控滑膜成纖維細胞，抑制骨質破壞與血管生成。有研究表明，IL-38 在RA 的發(fā)生和發(fā)展過程中具有重要的抑炎作用[14-15]。本研究結果顯示，RA 組IL-17A 和RF水平明顯升高，且隨著病情活動度加重而明顯上升，與有關文獻[3-4,13]報道基本一致，這表明IL-17A 在RA 的發(fā)生和發(fā)展過程中扮演著重要的促炎角色，可能是促進RA 炎癥反應的重要觸發(fā)因子，從而引起RF 水平升高。而IL-38 水平明顯降低，與張繼云等[7]報導的基本一致，而與肖盼盼等[4]報導的不同，這可能與不同機構所收集的RA 患者病情嚴重程度不同有關，但IL-38 水平隨病情活動度加重而明顯下降的結論基本一致，這表明了在RA 發(fā)生和發(fā)展過程中IL-38 水平降低會導致其對炎癥的抑制作用減弱，從而導致促炎因子大量產生，加速疾病的進程。此外，結果還顯示，RA 組IL-17A 與RF 水平呈正相關，而與IL-38 水平呈負相關，這可能與IL-17A 的促炎和IL-38 的抑炎互相作用有關。

RA 病因與發(fā)病機制目前尚不完全清楚，多數研究者認為RA 發(fā)病是遺傳與環(huán)境因素共同作用的結果。隨著分子生物學技術不斷深入研究發(fā)現，多種細胞因子基因多態(tài)性可增加RA 發(fā)病風險，與RA 的發(fā)生和發(fā)展有密切關系[16-17]。IL-17A 位于一個與RA 相關的基因組區(qū)域的染色體6p12 上，其基因多個位點存在多態(tài)性。有研究表明，IL-17A 基因位點多態(tài)性與RA 發(fā)病有關，且存在區(qū)域和種族性差異，如LEE 等[18]研究發(fā)現高加索人RA 患者與健康人群IL-17A基因rs2275913位點基因型及等位基因頻率存在明顯差異，與RA 發(fā)病有密切關系，而DHAOUADI 等[19]研究發(fā)現與突尼斯地區(qū)RA 易感性缺乏相關性。本研究結果顯示，深圳地區(qū)RA患者IL-17A基因rs2275913位點AA 基因型和A等位基因檢出率比健康人群明顯升高，這表明IL-17A基因rs2275913位點多態(tài)性與深圳地區(qū)RA 發(fā)病有一定相關性。同時AA 基因型RA 患者IL-17A水平明顯升高，而IL-38 水平明顯降低，這可能與IL-17A基因rs2275913位點多態(tài)性能提高IL-17，其他促炎細胞因子及趨化因子表達水平，進而抑制抑炎因子水平及功能等有關。

綜上所述，RA患者IL-17A和RF水平明顯升高，而IL-38 水平明顯降低，且與病情的活動度有密切關系，加強IL-17A，RF 和IL-38 水平檢測對RA 的診斷及嚴重程度的判別診斷具有重要的參考價值。同時IL-17A基因rs2275913位點多態(tài)性與深圳地區(qū)RA 發(fā)病易感性具有相關性，其中AA 基因型可能是該地區(qū)RA 發(fā)病的易感危險基因之一。