血清microRNA-337表達(dá)水平對(duì)自擬強(qiáng)腎健脾通絡(luò)湯方劑治療早期糖尿病腎病獲益的診斷價(jià)值研究

劉紅梅，張?jiān)?，劉曉曼，安致穩(wěn)，王 倩（唐山市中醫(yī)醫(yī)院，河北唐山 063000）

糖尿病腎病（diabetic nephropathy,DN）可進(jìn)展為終末期腎臟病，嚴(yán)重威脅著人們的生命安全[1-3]，及早治療可在一定程度上抑制其進(jìn)展[4]。目前，臨床主要應(yīng)用降糖、降壓、降脂等藥物延緩糖尿病腎病進(jìn)展，但對(duì)于降低微量蛋白尿的效果有限[5-6]。中醫(yī)對(duì)糖尿病腎病的治療有獨(dú)到見解，可控制患者病情，并改善相關(guān)指標(biāo)水平[7-9]。本研究用自擬強(qiáng)腎健脾通絡(luò)湯治療早期糖尿病腎病，效果顯著，但仍有部分患者對(duì)治療不敏感，因此，及早評(píng)價(jià)治療獲益尤為重要。微RNA-377（microRNA-377，miR-377）可通過調(diào)控炎癥因子水平損傷糖尿病腎病大鼠腎臟足細(xì)胞[10]，其水平與腎臟損傷有關(guān)，或可反映治療獲益情況。目前，鮮有研究分析miR-337 對(duì)糖尿病腎病治療獲益的診斷價(jià)值。本研究主要分析miR-337 評(píng)價(jià)自擬強(qiáng)腎健脾通絡(luò)湯方劑治療早期糖尿病腎病獲益的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2017年4月～2018年11月在唐山市中醫(yī)醫(yī)院就診的136 例早期糖尿病腎病患者作為研究對(duì)象，年齡33～69（46.80±7.14）歲，男性75 例，女性61 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：診斷符合《糖尿病腎病防治專家共識(shí)（2014年版）》[11]和《糖尿病腎病中醫(yī)防治指南》[12]，臨床分期為Ⅲ期，簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：認(rèn)知功能障礙或伴精神疾病，嚴(yán)重心、肝、肺等臟器功能異常，伴感染性疾病，妊娠期或哺乳期婦女，對(duì)本研究藥物過敏或退出研究。根據(jù)治療獲益分為預(yù)后良好組（n=84）和預(yù)后不良組（n=52）。兩組的年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）、病程和吸煙史比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。本研究經(jīng)唐山市中醫(yī)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

表1 兩組基線資料比較（±s）

表1 兩組基線資料比較（±s）

類別預(yù)后良好組（n=84）預(yù)后不良組（n=52）t/χ2P年齡（歲）47.35±6.8145.92±7.621.1310.260男性46290.0130.909 BMI（kg/m2）25.76±3.8125.74±4.450.0320.974病程（年）7.08±1.276.96±1.200.5540.581吸煙41270.1250.724

1.2 試劑與儀器 TAKARA 9108 RNAiso Plus 9108 trizol RNA，6011A PrimeScript? 1st Strand cDNA Synthesis Kit（日本TAKARA 公司）；紫外分光光度計(jì)（上海光學(xué)儀器五廠有限公司）；PCR 儀（美國Bio-Rad 公司），miR-337 及內(nèi)參U6 引物（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 治療方案：給予常規(guī)治療，包括飲食、運(yùn)動(dòng)干預(yù)，降糖、降壓和降脂治療等。在常規(guī)治療基礎(chǔ)上給予自擬強(qiáng)腎健脾通絡(luò)湯治療。自擬強(qiáng)腎健脾通絡(luò)湯組方：黃芪15 g，黨參10 g，白術(shù)10 g，益智仁15 g，芡實(shí)10 g，金櫻子10 g，菟絲子10 g，水蛭3 g，桃仁10 g，甘草6 g。上述藥物煎服，每天早、晚各服用1 次，12 周為1 療程。

1.3.2 治療獲益評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：隨訪2年，每3 個(gè)月隨訪1 次，末次隨訪時(shí)間為2020年11月28日，將臨床分期進(jìn)展為Ⅳ期、血肌酐水平翻倍、接受腎臟替代治療或全因死亡定義為預(yù)后不良。

1.3.3 信息收集：收集年齡、性別、BMI，吸煙史、糖尿病病程、估算的腎小球?yàn)V過率（estimated glomerular filtration rate，eGFR）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、血肌酐（serum creatinine，Scr）、尿酸（uric acid，UA）和尿清蛋白/肌酐比值（urine albumin/creatinine ratio，UACR）等信息。

1.3.4 miR-337 水平檢測(cè)：用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法（RT-qPCR）[13]檢測(cè)血清miR-337 水平。抽取受試者治療前、治療后肘部靜脈血10 ml，離心后取上清，將其保存在-80℃冰箱中保存，待驗(yàn)。用TRIzol 提取血清中總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后用PCR 儀擴(kuò)增cDNA，擴(kuò)增條件為95 ℃ 10 min，95 ℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)，63 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s。miR-337 序列F：5’-CTCAACTGGTGTCGTCCAGTCGGCA-3’，R：5’-ATTCAGTTGAGGAAGAAAGG-3’；內(nèi)參序列U6 F：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，R：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。用2-ΔΔCt計(jì)算miR -337 相對(duì)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，兩組治療前、后的miR-337 水平比較用重復(fù)測(cè)量方差分析，率的比較用χ2檢驗(yàn)，用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）評(píng)估m(xù)iR-337 診斷治療獲益的價(jià)值，用Logistic 回歸分析治療獲益的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素，用限制性立方樣條擬合Logistic 回歸分析miR-337 與治療獲益的劑量-效應(yīng)關(guān)系。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組腎功能指標(biāo)比較 見表2。兩組的UA 水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.287，P＞0.05），預(yù)后良好組的eGFR 水平高于預(yù)后不良組，BUN，Scr和UACR 水平低于預(yù)后不良組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.119，5.798，3.704，5.506，均P＜0.05）。

表2 兩組腎功能指標(biāo)比較（x±s）

2.2 兩組miR-337 水平比較 見表3。兩組的miR-337 水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=24.876，P=0.000），預(yù)后良好組治療后miR-337 水平低于預(yù)后不良組（P=0.000）；治療前、后的miR-337 水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=339.737，P=0.000），兩組治療后的miR-337 水平均降低；預(yù)后和時(shí)間之間存在交互效應(yīng)（F=22.794，P=0.000），治療后，兩組的miR-337 水平降低程度不同，預(yù)后良好組的miR-337 水平降低程度高于預(yù)后不良組（P=0.000）。

表3 兩組miR-337 水平比較（x±s）

2.3 miR-337 評(píng)價(jià)早期糖尿病腎病治療獲益的效能見圖1。治療前miR-337 評(píng)價(jià)治療獲益的ROC 曲線下面積（AUC）、最佳截?cái)帱c(diǎn)、靈敏度和特異度分別為0.568（95% CI：0.470～0.667），1.64，86.54%和28.57%；治療后miR-337 評(píng)價(jià)治療獲益的ROC AUC，最佳截?cái)帱c(diǎn)、靈敏度和特異度分別為0.837（95% CI：0.764～0.910），1.57，65.38%和90.48%；差值miR-337 評(píng)價(jià)治療獲益的ROC AUC，最佳截?cái)帱c(diǎn)、靈敏度和特異度分別為0.722（95% CI：0.638～0.806），0.44，88.46%和46.43%。治療后miR-337 評(píng)價(jià)治療獲益的ROC AUC 高于治療前miR-337和差值miR-337，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=6.039，P=0.000；Z=2.288，P=0.022）。

圖1 miR-337 評(píng)價(jià)治療獲益的ROC 曲線

2.4 早期糖尿病腎病治療獲益的Logistic 回歸分析 見表4。將治療獲益作為因變量，將eGFR，BUN，Scr，UACR 和miR-337（治療后）作為自變量，多因素Logistic 回歸分析結(jié)果顯示，高水平的eGFR是治療獲益的獨(dú)立保護(hù)因素（P=0.000），高水平的Scr，UACR 和miR-337 是治療獲益的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P=0.019，0.005，0.000）。

表4 早期糖尿病腎病治療獲益的Logistic 回歸分析

2.5 miR-337 與早期糖尿病腎病治療獲益的劑量-效應(yīng)關(guān)系 見圖2。用限制性立方樣條擬合Logistic 回歸分析miR-337 與治療獲益的劑量-效應(yīng)關(guān)系，當(dāng)節(jié)點(diǎn)個(gè)數(shù)為3 時(shí)，AIC 值最小（AIC=136.065），結(jié)果顯示miR-337 與治療獲益有關(guān)（χ2=32.89，P=0.000），呈線性關(guān)系（非線性檢驗(yàn)χ2=0.76，P=0.382）。以miR-337 評(píng)價(jià)治療獲益的最佳截?cái)帱c(diǎn)作為參考點(diǎn)，當(dāng)miR-377 ＜1.57時(shí)，治療獲益率增加；當(dāng)miR-337 ＞1.57 時(shí)，治療獲益率降低。

圖2 miR-337 與治療獲益的限制性立方樣條圖

3 討論

抑制早期糖尿病腎病進(jìn)展可有效改善患者預(yù)后[14-15]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為腎是人體的先天之本，主藏精，需水谷精微補(bǔ)充與化生；脾是人體的后天之本，主運(yùn)化，需腎中陽氣溫煦。本研究在“脾病及腎”、“脾胰同源”理論下用自擬強(qiáng)腎健脾通絡(luò)湯治療早期糖尿病腎病，經(jīng)臨床觀察，效果明顯，但仍有部分早期糖尿病腎病患者經(jīng)自擬強(qiáng)腎健脾通絡(luò)湯治療后遠(yuǎn)期獲益甚微。miR-337 已被報(bào)道參與了黑色素瘤[16]和胰腺導(dǎo)管腺癌[17]的發(fā)病和進(jìn)展過程，并可反映患者預(yù)后。本研究認(rèn)為miR-337 可能是早期糖尿病腎病治療獲益的潛在生物標(biāo)志物，因此，開展本研究，分析miR-337 診斷早期糖尿病腎病治療獲益的價(jià)值。

本研究結(jié)果顯示預(yù)后良好組的治療后miR-337水平低于預(yù)后不良組，且預(yù)后良好組治療后的miR-337 水平降低程度高于預(yù)后不良組，上述結(jié)果提示miR-337 與治療獲益有關(guān)，可能是評(píng)價(jià)治療獲益的潛在生物標(biāo)志物。遂構(gòu)建了miR-337 評(píng)價(jià)治療獲益的ROC 曲線，結(jié)果顯示治療后miR-337 對(duì)治療獲益有一定診斷價(jià)值。

進(jìn)一步用Logistic 回歸分析自擬強(qiáng)腎健脾通絡(luò)湯治療早期糖尿病腎病獲益的風(fēng)險(xiǎn)因素，結(jié)果顯示，miR-337 是治療獲益的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，此外，限制性立方樣條擬合Logistic 回歸分析結(jié)果顯示miR-337 與治療獲益呈線性關(guān)系，當(dāng)miR-377 ＜1.57 時(shí)，治療獲益率增加；當(dāng)miR-337 ＞1.57 時(shí)，治療獲益率降低。推測(cè)其原因是自擬強(qiáng)腎健脾通絡(luò)湯方劑可調(diào)節(jié)miR-337，miR-337 可靶向調(diào)控白細(xì)胞介素-6 和白細(xì)胞介素-18 水平加重腎臟損傷[10]，其水平可反映治療獲益。本研究結(jié)果還顯示高水平的eGFR 是治療獲益的獨(dú)立保護(hù)因素，高水平的Scr和UACR 是治療獲益的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，與已報(bào)道文獻(xiàn)[18-20]結(jié)果一致。

綜上所述，血清miR-337表達(dá)水平對(duì)自擬強(qiáng)腎健脾通絡(luò)湯方劑治療早期糖尿病腎病獲益有一定診斷價(jià)值。