廣東省深圳地區(qū)類風濕關節(jié)炎患者血清25-（OH）VitD3水平及其受體基因rs2228570 T/C位點多態(tài)性的相關性研究

高柳冰，郭玲玲，郭燕妳，楊榮志，王興煌，林 奎

[1.深圳市中西醫(yī)結合醫(yī)院檢驗科，廣東深圳 518104；2.中國科學院大學深圳醫(yī)院（光明）西院區(qū)檢驗科，廣東深圳 518106]

類風濕關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是以關節(jié)、骨及滑膜慢性炎癥為主的一種自身免疫性疾病，其病因和發(fā)病機制至今尚未十分闡明，多數(shù)學者認為RA 由遺傳、環(huán)境、激素及感染等多種因素共同作用所致的，其中遺傳因素在RA 發(fā)病過程中發(fā)揮了重要的作用，約53%～60%RA 發(fā)病是由遺傳因素所引起的[1-3]。隨著全基因組研究發(fā)現(xiàn)，RA 是一種多基因遺傳性疾病，與多基因突變有關。有研究表明，維生素D（vitamin D，VitD）受體（vitamin Dreceptor，VDR）基因多個位點突變與RA發(fā)病有關，且VDR 基因突變可能影響25-（OH）VitD3 水平表達或改變其結構，且不同地區(qū)人群因遺傳背景、環(huán)境、生活條件及習慣等因素不同而造成25-（OH）VitD3 水平及VDR 基因多個位點突變分布具有地域和種族性差異[4-7]，雖然國內(nèi)一些地區(qū)已有相關研究報道，但至今未見深圳地區(qū)相關報道。本研究對深圳地區(qū)RA 患者和健康人群血清中25-（OH）VitD3 水平及VDR 基因rs2228570 T/C 位點多態(tài)性進行了對比研究分析，探討其與RA 發(fā)病之間的相關性，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2019年6 ～12月期間來深圳市中西醫(yī)結合醫(yī)院和中國科學院大學深圳醫(yī)院（光明）西院區(qū)門診和住院就診并確診為RA 患者126 例為RA 組，其中男性35 例，女性91 例，年齡26～57 歲，平均年齡32.85±8.73 歲。所有患者均符合RA 診斷標準，排除其他自身免疫性疾病，并根據(jù)RA 疾病活動度評分（DSA28）對患者進行分期[8]，其中輕度活動組47 例（DSA28＜3.2），中度活動組52 例（3.2＜DSA28＜5.1），高度活動組30 例（DSA28＞5.1）。納入標準：①符合《類風濕關節(jié)炎診斷治療指南》[8]中的診斷標準；②初診病例；③未使用抗風濕藥；④醫(yī)院倫理委員會同意批準；⑤患者及家屬簽署知情同意書。排除標準：①長期臥床或長期未接受陽光照射者；②飲食不能正常進行者；③伴發(fā)腫瘤、肝、腎及糖尿病者；④RA 病情加重或并發(fā)嚴重并發(fā)癥或疾病需采取非常規(guī)治療者；⑤近期服用維生素D 類似物者；⑥不配合者。并選取同期來院體檢的健康非RA 人群120 例，其中男性30 例，女性90 例，年齡24～55 歲，平均年齡31.45±6.62 歲。確保兩組性別、年齡及種族比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 儀器與試劑 c8000 全自動化學發(fā)光免疫分析儀由羅氏公司提供；DNA 提取試劑盒由深圳亞能生物技術有限公司提供；Cobasz-480 PCR 分析儀由瑞士羅氏公司提供；25-（OH）-VitD3 試劑盒由廣州菲康生物技術有限公司提供。

1.3 方法

1.3.1 標本采集：采集清晨空腹2 ～3ml 靜脈血于EDTA-K2抗凝管內(nèi)，混勻用作DNA 提取，另采集2～3ml 靜脈血于無抗凝劑的干燥管內(nèi)，分離血清用作25-(OH)VitD3 水平測定。

1.3.2 25-（OH）VitD3 水平測定：運用化學發(fā)光免疫法對血清中25-（OH）VitD3 水平進行檢測，嚴格按照儀器、試劑說明書進行，由同一專業(yè)人員成批檢測。

1.3.3 DNA 提?。河肈NA 提取試劑盒提取血漿中的基因組DNA，并采用分光光度計定量，瓊脂糖凝膠電泳質檢，合格后的DNA 將濃度調(diào)整到50ng/μl，于-20℃C 儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 VDR 基因rs2228570 位點多態(tài)性分析：采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性（PCRRFLP）法對IL-17 rs763780 基因多態(tài)性進行檢測，具體操作參照有關文獻[9]。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用GraphPad Prism 5 軟件，計量資料以平均值±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以百分率（%）表示，兩組比較采用χ2檢驗，多組間比較采用方差檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組25-（OH）VitD3 水平比較 RA 組血清25-（OH）VitD3 水平（31.57±9.36nmol/L）明顯低于對照組（65.92±14.57nmol/L），兩者差異有統(tǒng)計學意義（t=9.1542，P=0.0137），其中RA 組男性（42.16±11.75nmol/L）明顯高于女性（27.50±8.12nmol/L），兩者差異有統(tǒng)計學意義（t=6.1374，P= 0.0209），而對照組男性（63.95±13.80nmol/L）略低于女性（66.58±15.09nmol/L），兩者差異無統(tǒng)計學意義（t=0.9452，P=0.1295）。

2.2 不同嚴重程度RA 患者25-（OH）VitD3 水平比較高度活動組25-（OH）VitD3 水平（19.37±5.82nmol/L）明顯低于中度活動組（30.69±8.63nmol/L），而中度活動組明顯低于低活動組（38.32±10.78nmol/L），不同嚴重程度間差異有統(tǒng)計學意義（F=17.9351，P=0.0082）。

2.3 兩組VDR 基因rs2228570 T/C 位點基因型和等位基因檢出率比較 見表1。RA 組VDR 基因rs2228570 T/C 位點CC 基因型和C 等位基因檢出率明顯高于對照組，兩組差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。

表1 兩組VDR 基因rs2228570 T/C 位點基因型和等位基因檢出率比較[n(%)]

2.4 RA 組不同性別VDR 基因rs2228570 T/C 位點基因型和等位基因檢出率比較 見表2。RA 組VDR 基因rs2228570 T/C 位點CC 基因型和C 等位基因檢出率男性明顯低于女性，兩者差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。

表2 RA 組不同性別VDR 基因rs2228570 T/C 位點基因型和等位基因檢出率比較[n(%)]

2.5 RA 組不同基因型25-（OH）VitD3 水平比較 CC基因型血清25-（OH）VitD3 水平（18.95±4.59nmol/L）明顯低于TC 和TT 基因型（38.62±11.03nmol/L 和41.98±11.92nmol/L），差異有統(tǒng)計學意義（t=5.016 4,5.812 6，P=0.025 9，0.023 6），而TC 和TT 基因型之間差異無統(tǒng)計學意義（t=1.206 8，P=0.117 8）。

3 討論

RA 是以炎性滑膜炎為主要特征的一種最為常見的自身免疫性疾病，主要病理變化為滑膜細胞增生、間質大量炎性細胞浸潤、微血管新生及血管翳形成，當累及關節(jié)軟骨和骨質時，導致關節(jié)畸形和強直，引起關節(jié)功能喪失，致殘率高達15%，是引起喪失勞動力和致殘的主要原因之一。全球RA 發(fā)病率約為0.5%～2%，而我國約為3%～5%，且呈逐年上升趨勢，好發(fā)于女性，約為男性的2～3 倍，任何年齡均可發(fā)病，好發(fā)于25～50 歲。RA 病因及發(fā)病機制目前尚未完全明確，且無有效的治療方法，為全球最難治的病種之一[10-12]。因此，探索新的RA診斷標記物及發(fā)病機制對RA 的診斷、治療及預防具有重要意義。

VitD 是一類具有生物活性的脂溶性類固醇衍生物，其除了能夠增強巨噬細胞趨化和吞噬能力，強化單核細胞、中性粒細胞及其它細胞的抗菌肽活性，提高RA 患者對病原微生物的抵御能力外，還可調(diào)控巨噬細胞、樹突狀細胞、T 和B 淋巴細胞等的生長和分化，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)和抗炎活性[13-15]。而25-（OH）VitD3 是VitD 在血液循環(huán)中的主要存在形式，是評價VitD 營養(yǎng)和功能狀態(tài)的最好指標。有研究表明，RA 患者25-（OH）VitD3 水平明顯降低，可能在RA 發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用[16-17]。本研究結果顯示，深圳地區(qū)RA 血清25-（OH）VitD3 水平明顯低于對照組（P＜0.05），與有關文獻研究的結論一致[5，11，14，16-17]，但不同機構研究結果存在一定差異，有些相差甚遠，這可能與不同地區(qū)人群的生活環(huán)境、習慣、礦物及陽光照射等諸多因素不同有關。同時結果還顯示，RA 女性患者25-（OH）VitD3水平降低較男性患者更加明顯（P＜0.05），這說明了女性RA 的發(fā)病率為什么比男性高的原因。此外，25-（OH）VitD3 水平隨RA 患者病情嚴重程度的加重而出現(xiàn)明顯降低（P＜0.05），這表明了25-（OH）VitD3 表達水平可能與RA 的發(fā)生以及病情的發(fā)展有關。因此，加強不同地區(qū)人群血清中25-（OH）VitD3 水平監(jiān)測，對RA 診斷、治療及預防具有一定參考價值。

RA 患者因關節(jié)長期存在炎癥和遭受破壞，有較高的發(fā)病率和高致殘率，嚴重影響患者的生活質量和勞動能力。RA 病因和發(fā)病機制十分復雜，隨著遺傳基因位點突變檢測技術的不斷深入研究發(fā)現(xiàn)，RA 發(fā)病與多種基因多個位點突變存在密切關系，且不同地區(qū)人群同種基因同一個位點突變分布存在區(qū)域性和種族性差異[4-5，7，9，18-19]。本研究結果顯示，深圳地區(qū)RA 組VDR 基因rs2228570 T/C 位點CC 基因型和C 等位基因檢出率明顯高于對照組（P＜0.05），與SONG 等[9，19-20]研究的結論基本一致，這表明VDR 基因rs2228570 T/C 位點突變可能與RA 發(fā)病有密切關系，其中CC 基因型可能是深圳地區(qū)RA 發(fā)病的易感危險基因，但與TIZAOUI 等[21]研究的結論不一致，這表明了VDR 基因rs2228570 T/C 位點突變多態(tài)性分布存在地域性和種族性差異。同時結果還顯示，RA 組女性CC 基因型和C 等位基因檢出率明顯高于男性（P＜0.05），這表明了女性體內(nèi)VDR 基因rs2228570 T/C 位點可能更容易發(fā)生突變，這也可能是女性RA 患病率為什么比男性高的一個原因。此外，結果顯示RA 組CC 基因型25-（OH）VitD3 水平明顯低于其它基因型（P＜0.05），這可能與VDR 基因rs2228570 T/C 位點突變可能影響25-（OH）VitD3 水平表達或改變其結構等有關，這為進一步研究RA 發(fā)病機制、RA 靶向治療藥物的研發(fā)提供了新的方向，具體作用機制有待深入研究。綜上所述，深圳地區(qū)RA 患者25-（OH）VitD3水平明顯降低，女性尤為明顯，且與RA 患者病情嚴重程度有關。同時RA 患者VDR 基因rs2228570 T/C 位點突變呈多態(tài)性分布，其中CC 基因型可能是本地區(qū)RA 發(fā)病的危險易感基因之一。因此，加強不同地區(qū)25-（OH）VitD3 水平及其受體基因rs2228570 T/C位點突變分析，為RA診斷、病情判斷、治療及預防提供更為科學的參考依據(jù)。