胎牛肺間充質(zhì)干細(xì)胞對脂多糖介導(dǎo)小鼠急性肺損傷治療的研究

殷佳輝，王 琪，孫宇辰，朱曉峰，喬 峰，鄒志田

（1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院心胸外科，黑龍江 佳木斯 154002；2.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154002；3.佳木斯傳染病醫(yī)院檢驗科，黑龍江 佳木斯 154002；4.佳木斯大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154002）

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一種具有自我更新能力和多向分化能力的多能干細(xì)胞[1-4]。病理狀態(tài)下，間充質(zhì)干細(xì)胞可以在炎癥介質(zhì)的刺激下，通過遷移和歸巢作用參與損傷部分的修復(fù)[5]，也可以通過靜脈或局部注射路徑遷移到損傷部位，進(jìn)而發(fā)揮一系列生物效應(yīng)[6]。因MSCs表面表達(dá)低水平Ⅰ型白細(xì)胞抗原（HLA），不表達(dá)Ⅱ型主要組織相容性抗原（MHC-Ⅱ）和T細(xì)胞共刺激分子，具有低免疫原性，可為異體MSCs治療提供理論依據(jù)[7]。急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是急性肺損傷（ALI）最嚴(yán)重的形式，病死率較高，目前尚無特異有效的治療措施[8]，因此研究的重點仍是尋找有效的治療方法。本研究對胎牛肺間充質(zhì)干細(xì)胞（lung-derived mesenchymal stem cells，LMSCs）進(jìn)行分離培養(yǎng)及鑒定，并通過腹腔注射LPS造小鼠急性肺損傷模型，然后將LMSCs移植到急性肺損傷的小鼠體內(nèi)，觀察LMSCs對急性肺損傷治療作用，為異源干細(xì)胞進(jìn)行臨床治療提供實驗理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來源 本實驗對象3個月齡胎牛購自中國農(nóng)科院家畜實驗基地，6周齡雄性小鼠購自北京華阜康生物有限公司。LPS購自北京索萊寶科技有限公司，α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、山羊血清、谷氨酰胺購自美國GIBCO公司；胰蛋白酶(Trypsin 1∶250)、Triton X-100IV型膠原酶、PI購自美國Sigma公司；多聚甲醛和青鏈霉素購自北京化工廠；小鼠抗牛抗體購自Abcam公司產(chǎn)品；FITC標(biāo)記兔抗小鼠二抗購自中杉金橋；RNA提取試劑盒TRI reagent、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和extap酶購自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 胎牛LMSCs的分離培養(yǎng) 取3月齡流產(chǎn)胎牛肺臟，在準(zhǔn)備間初步消毒后移至細(xì)胞間無菌操作臺內(nèi)，連同取樣工具一同紫外照射15 min，剖開胎牛胸腔，完整取出胎牛肺臟至培養(yǎng)皿內(nèi)，然后用無菌眼科鑷子、眼科剪緩慢剝離胸膜，將肺組織及支氣管用PBS反復(fù)沖洗10遍，去除血細(xì)胞等雜質(zhì)，將清洗干凈的肺組織及支氣管剪成約1～3 mm2織碎塊，轉(zhuǎn)移至新養(yǎng)皿中，加入10 ml 0.2%Ⅳ型膠原酶，移至37 ℃的5% CO2培養(yǎng)箱中酶消30 min～1 h，直至組織出現(xiàn)勻漿時取出，終止消化，過篩，離心，重懸，制單細(xì)胞懸液，接種到新皿，CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，標(biāo)記P0代，定期換液當(dāng)細(xì)胞達(dá)90%融合時可細(xì)胞傳代，傳代比例為1傳2。

1.2.2 胎牛肺LMSCs的生長曲線 選取P5、P10及P15代LMSCs，以1.0×104個/ml密度接種到24孔板培養(yǎng)，取對數(shù)生長期LMSCs用血球計數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。

1.2.3 RT-PCR鑒定 登錄NCBI網(wǎng)站，檢索獲取LMSCs基因序列并設(shè)計引物（表1），對LMSCs進(jìn)行基因?qū)W鑒定。

表1 LMSCs基因引物序列

1.2.4 免疫熒光鑒定 取P5代純化后的LMSCs，LMSCs生長達(dá)皿底70%左右時棄舊培養(yǎng)基，PBS反復(fù)沖洗，4%多聚甲醛固定20 min，0.25%Triton X-100通透10 min，PBS漂洗，10%山羊血清阻斷非特異性抗體，加一抗（鼠抗牛CD29、CD44、CD73、CD166）避光孵育1 h，PBS漂洗，滴加FITC標(biāo)記兔抗鼠IgG二抗30 min，PBS漂洗后DAPI染色1 h，加少量PBS移至共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.5 動物模型準(zhǔn)備 準(zhǔn)備72只雄性小鼠，隨機(jī)分為3組，標(biāo)記為對照組、損傷組（LPS組）及治療組（LPS+LMSCs組），小鼠需進(jìn)行2周適應(yīng)性飼養(yǎng)。對照組行腹腔注射生理鹽水，劑量為10 mg/kg，損傷組組行腹腔注射LPS（10 mg/kg），治療組先行腹腔注射LPS后立即給予移植LMSCs，移植密度1×106/皿。在每組中設(shè)置3個時間節(jié)點：6、24、48 h處理小鼠，每個時間節(jié)點設(shè)置3組平行組。

1.2.6 小鼠模型ELISA檢測 采血管收集小鼠血清，在2 ℃～8 ℃環(huán)境下靜置1～2 h，3000 r/min離心15 min，取上清液備ELISA檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 利用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并繪制圖表。計量資料以（）表示，組間比較采用Student’st檢驗，多組間比較采用Oneway ANOVA with Tukey’s post hoc檢驗。當(dāng)P＜0.05時表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胎牛LMSCs的形態(tài)觀察 利用倒置顯微鏡觀察，采用酶消法及貼壁法分離培養(yǎng)出的貼壁生長的LMSCs形態(tài)，可見原代初期細(xì)胞生長緩慢成團(tuán)生長，P3以后細(xì)胞形態(tài)整體穩(wěn)定，立體感減弱，細(xì)胞多呈長梭形或紡錘形，核質(zhì)比大，邊緣不規(guī)則。胎牛肺間充質(zhì)干細(xì)胞至少可傳至15代以上，P15以后生長速度減緩，細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)扁平不規(guī)則樣生長。研究證明體外分離、培養(yǎng)的胎牛肺間充質(zhì)干細(xì)胞在適宜的培養(yǎng)條件下可以增殖并維持干細(xì)胞生長特性，見圖1。

圖1 LMSCs的形態(tài)學(xué)觀察（×40）

2.2 生長曲線測定 利用血球計數(shù)板對P5、P10、P15的LMSCs進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，由生長曲線可見LMSCs增殖均依次經(jīng)歷潛伏期、對數(shù)生長期及平臺期。潛伏1～2 d后細(xì)胞增殖迅速，約7 d增殖減慢進(jìn)入平臺期。群體倍增時間隨代次增高而延長。考慮細(xì)胞增殖速度與細(xì)胞活力相關(guān)，本實驗后期選用純化后的P5代細(xì)胞進(jìn)行LMSCs的移植治療，以期最佳治療修復(fù)作用，見圖2。

圖2 LMSCs生長曲線

2.3 RT-PCR檢測表面標(biāo)記物 經(jīng)RT-PCR鑒定，細(xì)胞表達(dá)CD29、CD44、CD73、CD166，不表達(dá)CD31，證明分離培養(yǎng)的細(xì)胞確定是LMSCs，見圖3。

圖3 LMSCsd的RT-PCR檢測

2.4 免疫熒光檢測表面標(biāo)記物 LMSCs陽性表達(dá)CD29、CD44、CD73和CD166，證明所分離培養(yǎng)的細(xì)胞為LMSCs，見圖4。

圖4 LMSCs表面標(biāo)記熒光表達(dá)（×40）

2.5 病理學(xué)切片觀察 鏡下觀察對照組小鼠肺泡壁結(jié)構(gòu)完整，肺泡間質(zhì)無滲出大小相近，存在正常的肺泡結(jié)構(gòu)，無炎癥細(xì)胞出現(xiàn)在管壁及周圍，無膠原蛋白沉淀。損傷組小鼠肺組織出現(xiàn)大面積肺泡結(jié)構(gòu)受損，大多數(shù)正常肺泡結(jié)構(gòu)消失，肺泡腔改變可見變形閉塞，大量炎癥細(xì)胞浸潤，結(jié)構(gòu)變性和異常的膠原蛋白沉淀，損傷作用時間越長，損傷程度加重。治療組小鼠在LMSCs移植治療后觀察肺損傷病變面積和損傷程度較LPS組下降，可見炎癥細(xì)胞浸潤減少、間質(zhì)有所增厚及膠原少量沉積，肺切片更接近于正常肺組織肺泡形態(tài)，見圖5。

圖5 小鼠急性肺損傷模型HE染色病理學(xué)改變（×40）

2.6 ELISA血清檢查結(jié)果分析 損傷組6、24、48 h血清TNF-α、IL-4、IL-6水平高于治療組和對照組，且治療組高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖6。

圖6 小鼠模型ELISA血清學(xué)檢查結(jié)果

3 討論

目前MSCs已從骨髓、脂肪組、臍帶血織等組織中成功分離并用于相關(guān)動物實驗及臨床試驗當(dāng)中，但鮮有LMSCs用于ALI治療的研究報道，本實驗成功從3個月胎齡牛肺中分離出LMSCs，在體外環(huán)境培養(yǎng)過程中，當(dāng)細(xì)胞傳至第P5代，已經(jīng)基本獲得純化的LMSCs。低代次的間充質(zhì)干細(xì)胞生殖速度較快，隨著代次的增加，增殖速度逐漸降低。低代次的LMSCs細(xì)胞形態(tài)穩(wěn)定，多呈紡錘形或長梭形，隨著培養(yǎng)代次的逐漸升高，LMSCs的形態(tài)可見分叉樣等改變。在細(xì)胞傳至P15代以上時，生長速度逐漸放緩，高代次LMSCs生長活力下降。通過RT-PCR和免疫熒光化學(xué)鑒定手段對LMSCs進(jìn)行鑒定，LMSCs表達(dá)基因CD29、CD44、CD73、CD166，不表達(dá)CD31，證明本實驗通過體外分離培養(yǎng)技術(shù)得到的目的細(xì)胞是LMSCs，且其保持間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性。

急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）是急性肺損傷（ALI）最嚴(yán)重的形式，肺部的感染性疾病尤其是細(xì)菌性肺炎是ARDS最常見的病因。肺炎進(jìn)展過程中，TNF-α、IL-4及IL-6等因子釋放，促進(jìn)大量中性粒細(xì)胞滲出聚集在肺泡周圍，激活并釋放活性氧、蛋白酶、白三烯等介質(zhì)，進(jìn)一步加重?fù)p傷。本研究結(jié)果顯示，損傷組6、24、48 h血清TNF-α、IL-4、IL-6水平高于治療組和對照組，且治療組高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。有研究發(fā)現(xiàn)[9]，角質(zhì)細(xì)胞生長因子7（KGF-7）在內(nèi)皮細(xì)胞再生和損傷修復(fù)中具有重要作用，可減輕ALI動物模型的肺泡水腫。過表達(dá)KGF-7的MSCs改善了微血管通透性，抑制了TNF-α 等促炎因子的釋放，保護(hù)正常肺組織。IL-6可加劇肺部損傷，研究表明[10,11]，其作用機(jī)制是參與中性粒細(xì)胞在肺部的聚集，而TNF-α 具有促進(jìn)IL-6分泌的作用，LMSCs通過抑制TNF-α 促炎因子的釋放，間接抑制IL-6的分泌，從而達(dá)到降低肺部炎癥反應(yīng)的效果。IL-4可刺激肺內(nèi)成纖維細(xì)胞增生，引起肺纖維化[12]。本研究中治療組小鼠IL-4水平較損傷組降低，降低了肺纖維化程度，起到了保護(hù)肺組織的作用。目前已有3項已完成的MSCs治療ARDS的臨床試驗，一項干細(xì)胞來源是異體脂肪來源的MSCs[13]，其余兩項是骨髓來源的MSCs[14，15]，但MSCs的最佳來源、合理劑量、給藥時間及給予方式仍無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，如何進(jìn)一步優(yōu)化MSCs的療效仍是未來研究的重點。

總之，胎牛LMSCs在體外培養(yǎng)體系中可以穩(wěn)定的保持其生物學(xué)特性，低代次LMSCs具有良好的增殖活性及分泌細(xì)胞因子的能力，可以有效降低LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷血清中TNF-α 水平，參與調(diào)控IL-4、IL-6的分泌及免疫應(yīng)答作用，提示胎牛LMSCs對急性炎性反應(yīng)有一定治療作用。