外陰陰道念珠菌病患者白念珠菌分離情況及ERG5基因位點(diǎn)突變分析

金蕾，史偉峰（.無(wú)錫市婦幼保健院檢驗(yàn)科，江蘇無(wú)錫4000；.蘇州大學(xué)附屬第三醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇常州3000）

外陰陰道念珠菌?。╲ulvovaginal candidiasis，VVC）是一種臨床常見婦科疾病，感染率僅次于細(xì)菌性陰道炎，極大地影響婦女生殖健康［1］。白念珠菌是該病常見的致病菌，感染率約為80%［2］。唑類藥物是目前臨床治療VVC的首選藥［3］，但隨著唑類藥物的廣泛使用，耐藥菌株日益增多。減少以及預(yù)防耐藥株的出現(xiàn)，已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。唑類藥物通過(guò)抑制14-α去甲基酶，從而抑制麥角甾醇合成，破壞真菌細(xì)胞膜，從而發(fā)揮抗真菌作用［4］。目前，麥角甾醇合成通路中活性藥物靶酶基因Ergosterol（簡(jiǎn)稱ERG）的突變或者高表達(dá)，被認(rèn)為是白念珠菌耐唑類藥物的主要機(jī)制之一［5］。本研究旨在了解VVC患者白念珠菌的檢出情況，并探究唑類藥物耐藥率及ERG5基因突變情況，為臨床抗真菌藥物的選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象及菌株 收集無(wú)錫市婦幼保健院2018年6—12月婦產(chǎn)科門診VVC患者陰道分泌物共500例，患者年齡25～49歲?；颊吲R床癥狀為外陰紅腫瘙癢，分泌物增多，并且呈白色豆腐渣樣。白念珠菌ATCC 10231購(gòu)自于鄭州安圖生物公司。

1.2 主要儀器與試劑 PCR儀（美國(guó)ABI公司）；凝膠成像儀（上海復(fù)日科技公司）；電泳儀、電泳槽（北京六一儀器廠）；質(zhì)譜儀（德國(guó)布魯克公司）；真菌快速培養(yǎng)鑒定藥敏試劑盒（鄭州安圖生物公司）；dNTP、10×PCR Buffer（含Mg2+）、Taq Plus DNA聚合酶、Ezup柱式基因組DNA抽取試劑盒、B600090 PCR擴(kuò)增試劑盒（上海生工生物工程公司）。

1.3 真菌鏡檢及培養(yǎng) 將采集的陰道分泌物標(biāo)本均勻涂抹于載玻片上，滴加50μL 10%KOH溶液，蓋上蓋玻片，加熱固定，冷卻后在顯微鏡下觀察標(biāo)本有無(wú)菌絲或者孢子。將鏡下見菌絲或孢子的樣本接種沙保弱瓊脂平板，35℃培養(yǎng)24～48 h，若平板上呈現(xiàn)乳白色或者淡黃色、表面光滑濕潤(rùn)呈奶油狀菌落，可以初步判斷為念珠菌屬。

1.4 真菌鑒定及藥敏試驗(yàn) 挑取念珠菌屬單個(gè)菌落，轉(zhuǎn)種于科瑪嘉顯色培養(yǎng)基，35℃培養(yǎng)24～48 h，進(jìn)行初步鑒定。對(duì)于翠綠色菌落采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）鑒定：滴加70%甲酸溶液1μL至靶板，取少量待測(cè)菌均勻涂抹，干燥后滴加1μL基質(zhì)溶液，采用Microflex質(zhì)譜儀進(jìn)行鑒定。依據(jù)儀器說(shuō)明書進(jìn)行結(jié)果判讀。采用真菌快速培養(yǎng)鑒定藥敏試劑盒進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，依據(jù)說(shuō)明書進(jìn)行操作及藥敏結(jié)果判讀。

1.5 基因擴(kuò)增及測(cè)序 采用Ezup柱式基因組DNA抽取試劑盒從目的菌株中提取DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增試劑盒對(duì)ERG5基因進(jìn)行擴(kuò)增。用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列F：5′-ATGAATT CAACAGAGGTCGATAA-3′；R：5′-CTATAAACTCT TTAATGGGTCTCT-3′，由上海生工生物公司合成。PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體積50μL，包括模板DNA 2μL，上、下游引物（10μmol/L）各2μL，dNTP 2μL，Taq酶1μL，10×PCR Buffer 5μL，ddH2O 36μL。擴(kuò)增反應(yīng)參數(shù)：95℃5 min；94℃30 s，60℃30 s，72℃50 s，35個(gè)循環(huán)；72℃5 min。取PCR產(chǎn)物5μL經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳觀察，目的條帶切膠回收后送至上海生工生物工程公司進(jìn)行雙向測(cè)序。PCR測(cè)序反應(yīng)總體積20μL：純化的PCR產(chǎn)物（10 ng/μL）1μL，2.5×BigDye 4μL，5×BigDye Seq Buffer 2μL，3.2 pmol/μL測(cè)序引物1μL，滅菌去離子水12μL。在美國(guó)ABI公司3730XL測(cè)序儀上按以下條件反應(yīng)：96℃1 min；96℃10 s，50℃5 s，60℃4 min，25個(gè)循環(huán)；4℃5 min。所得DNA片段測(cè)序長(zhǎng)度512 bp。將序列與GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中的標(biāo)準(zhǔn)序列比對(duì)，通過(guò)BLAST軟件分析，尋找突變位點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1 菌種分布 500例VVC患者陰道分泌物中313例鏡下可見菌絲或孢子，其中285例檢出念珠菌菌屬，經(jīng)顯色培養(yǎng)基鑒定，白念珠菌占比最高，為54.7%（156株），其次為光滑念珠菌22.5%（64株），熱帶念珠菌16.5%（47株），克柔念珠菌4.2%（12株），其他真菌2.1%（6株）。156株經(jīng)顯色培養(yǎng)鑒定為白念珠菌的菌株經(jīng)質(zhì)譜鑒定為白念珠菌（評(píng)分＞1.8）155株，余1株評(píng)分1.685分。

2.2 藥敏結(jié)果 155株白念珠菌菌株對(duì)5-氟尿嘧啶均敏感，2株菌株對(duì)制霉菌素耐藥（耐藥率1.2%），67株對(duì)酮康唑耐藥（耐藥率43.2%），97株對(duì)氟康唑耐藥（耐藥率62.5%），80株對(duì)酮康唑耐藥（耐藥率51.6%）。

2.3 測(cè)序分析 選取3株對(duì)多種唑類藥物（氟康唑、酮康唑、咪康唑）耐藥菌株（編號(hào)分別為CA21、CA73、CA81）、3株對(duì)唑類藥物均敏感菌株（編號(hào)分別為CA17、CA33、CA90）以及1株質(zhì)控菌株ATCC 10231進(jìn)行ERG5擴(kuò)增后測(cè)序。將測(cè)序序列與已知基因序列（NC_032095.1）進(jìn)行比對(duì)和分析，在敏感菌株CA33檢出1個(gè)同義突變位點(diǎn)G528A（176位氨基酸谷氨酸無(wú)變化），在耐藥菌株CA81檢出1個(gè)錯(cuò)義突變位點(diǎn)G528C（176位氨基酸谷氨酸突變?yōu)樘於彼幔?。見圖1。

圖1 CA81菌株堿基突變位點(diǎn)

3 討論

本研究500例VVC患者陰道分泌物中313例鏡下可見菌絲或孢子，其中285例檢出念珠菌菌屬，其余28例檢出酵母菌類菌屬，從285例標(biāo)本中分離出菌種分布以白念珠菌為主（54.7%），其次為光滑念珠菌（22.5%）、熱帶念珠菌（16.5%）、克柔念珠菌（4.2%）和其他真菌（2.1%）。非白念珠菌比例為45.3%，稍低于國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道的46.8%～68.9%［6］，可能與菌種地域性差異有關(guān)［7］。經(jīng)涂片鏡檢結(jié)合顯色培養(yǎng)基可實(shí)現(xiàn)常見念珠菌的快速鑒定，本文采用該模式實(shí)現(xiàn)285例樣本的檢測(cè)，而對(duì)于白念珠菌的顯色鑒定亦經(jīng)過(guò)質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行復(fù)核，雖然存在1株質(zhì)譜鑒定低分值菌株，但仍具有較高的鑒定一致率。

Martel等［8］發(fā)現(xiàn)1株耐唑類抗真菌藥物白念珠菌菌株同時(shí)存在ERG5和ERG11基因雙重突變。有研究提出ERG5基因突變可能導(dǎo)致了麥角甾醇合成途徑受阻，使白念珠菌菌株對(duì)唑類抗真菌藥物產(chǎn)生耐藥性［9］。本研究結(jié)果顯示白念珠菌臨床敏感株和耐藥株的ERG5基因均存在突變，其中編號(hào)為CA33的敏感株，發(fā)生了1個(gè)同義點(diǎn)突變，位點(diǎn)為528 bp，突變前堿基所在的密碼子為GAG，編碼的氨基酸為谷氨酸（Glu），突變后未引起氨基酸的變化；編號(hào)為CA81的耐藥株，發(fā)生了1個(gè)錯(cuò)義點(diǎn)突變，使其第528位堿基由G突變?yōu)镃，發(fā)生了氨基酸置換，導(dǎo)致第176位氨基酸由谷氨酸（Glu）變成了天冬氨酸（Asp）。第528號(hào)位點(diǎn)是較容易突變的位點(diǎn)，耐藥菌株在該位點(diǎn)發(fā)生了錯(cuò)義突變，引起了氨基酸的置換，提示與耐藥的產(chǎn)生有關(guān)［10］。

但白念珠菌對(duì)唑類抗真菌藥物的耐藥機(jī)制比較復(fù)雜，有可能是某種關(guān)鍵基因突變或者高表達(dá)導(dǎo)致菌株產(chǎn)生耐藥性，也可能是多種機(jī)制共同作用的結(jié)果。本研究進(jìn)行測(cè)序的菌株有限，因此后期將增加測(cè)序的菌株，深入研究ERG5基因突變與真菌藥物關(guān)系，為治療白念珠菌珠菌感染提供一定的理論依據(jù)。