糖尿病腎病患者血清人巨細(xì)胞病毒miR-US4-3p水平變化及價(jià)值*

王萍萍，王成，王靜，張明超，張春妮，張辰宇，汪俊軍（.南方醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院&東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院臨床檢驗(yàn)科，南京000；.東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院國(guó)家腎臟疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心全軍腎臟病研究所，南京000；.南京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南京0046）

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿?。╠iabetic mellitus，DM）晚期主要微血管并發(fā)癥，也是終末期腎病的主要病因［1］，但其發(fā)病機(jī)制尚不明確。人巨細(xì)胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）是一種具有囊膜包被的線性雙鏈DNA病毒，其基因組大小為220～240 kb，可在新生兒和免疫功能低下的個(gè)體中引起較高的發(fā)病率和死亡率，是目前發(fā)現(xiàn)的唯一可產(chǎn)生miRNA的β皰疹病毒，HCMV能夠編碼26個(gè)成熟miRNA［2］。越來越多的證據(jù)顯示，HCMV編碼的miRNA可調(diào)節(jié)各種生物過程，包括病毒復(fù)制、潛伏感染、免疫逃逸和宿主細(xì)胞周期［3-5］。有報(bào)道顯示，原發(fā)性高血壓患者血漿中hcmv-miR-UL112表達(dá)較健康對(duì)照者明顯上調(diào)，提示HCMV編碼miRNA可能是介導(dǎo)HCMV感染導(dǎo)致血管損傷和血壓升高的關(guān)鍵因子［6］。在2型糖尿?。═2DM）、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤及口腔扁平苔蘚患者外周血中也觀察到HCMV miRNA的高表達(dá)［7-8］，提示循環(huán)中HCMV編碼miRNA是一類潛在的新型疾病生物標(biāo)志物。研究證實(shí)，HCMV miR-US4-3p靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氨肽酶ERAP1，ERAP1功能的變化或喪失會(huì)改變組織相容性復(fù)合體（MHC）Ⅰ分子呈遞的抗原組成從而影響NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的激活，導(dǎo)致免疫應(yīng)答缺陷和疾病的發(fā)生［9-10］。DN的發(fā)生發(fā)展與炎癥和免疫反應(yīng)有關(guān)［11］，我們推測(cè)miR-US4-3p與DN之間可能存在關(guān)聯(lián)，目前關(guān)于miR-US4-3p在DN患者中的表達(dá)變化及其臨床價(jià)值研究未見報(bào)道。因此，本研究通過qRT-PCR方法檢測(cè)DN患者、單純DM患者和健康對(duì)照者中血清miR-US4-3p的表達(dá)，以探討其在DN中的潛在臨床價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2019年4月至2020年1月于中國(guó)人民解放軍東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院（原南京軍區(qū)總醫(yī)院）確診的T2DM患者128例，所有患者均符合T2DM診斷標(biāo)準(zhǔn)［12］。其中T2DM患者（DM組）64例，DN患者（DN組）64例。DM組男性48例，女性16例，年齡（55.92±17.46）歲，DM病程［3（0.08，7）］年；DN組男性42例，女性22例，年齡（55.78±11.88）歲，DM病程［10（5，16）］年。DN診斷標(biāo)準(zhǔn)患者符合下列任何一項(xiàng)者：①大量清蛋白尿；②糖尿病視網(wǎng)膜病變伴微量蛋白尿；③腎臟穿刺活檢符合DN病理表現(xiàn)，即診斷為DN［13］。選取同期健康體檢者64例作為對(duì)照組，男性42例，女性22例，平均年齡（53.20±10.74）歲。排除標(biāo)準(zhǔn)為：其他急慢性腎病、繼發(fā)性糖尿病、心臟與肝臟等全身疾病引發(fā)的腎臟疾病、創(chuàng)傷、急性感染、惡性腫瘤和自身免疫病者。各組性別、年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究獲中國(guó)人民解放軍東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)許可（批準(zhǔn)文號(hào)：2018NZGKJ-096），研究對(duì)象均簽署了知情同意書。

1.2 主要儀器與試劑 D10糖化血紅蛋白檢測(cè)儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；7600型全自動(dòng)生化分析儀（日本Hitachi公司）；Cobas e601型全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀（瑞士Roche公司）；5418型高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；SAS67120型超純水儀（美國(guó)Millipore公司）；2720型PCR儀（美國(guó)ABI公司）；LightCycler?96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（瑞士Roche公司）。

RNA提取試劑即酸性水飽和酚（北京索萊寶公司）；分析純級(jí)氯仿、異丙醇、無水乙醇（上海國(guó)藥集團(tuán)試劑公司）；人工合成的peu-MIR2911成熟體（上海Invitrogen公司）；miRNA逆轉(zhuǎn)錄引物及Taq-Man探針（美國(guó)ABI公司）（peu-miR2911貨號(hào)：242025_mat；hcmv-miR-US4-3p貨號(hào)：469699_mat）；逆轉(zhuǎn)錄體系和qRT-PCR體系所用試劑（大連TaKa-Ra公司）；總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）試劑及校準(zhǔn)品購(gòu)自英國(guó)Randox公司；低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoproteincholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）試劑及校準(zhǔn)品購(gòu)自日本第一化學(xué)株式會(huì)社；糖化血紅蛋白（Hemoglobin A1c，HbA1c）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；半胱氨酸蛋白酶抑制劑C（Cystatin C，Cys C）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自寧波普瑞柏生物技術(shù)公司；空腹血糖（FPG）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自富士膠片和光純耀（上海）化學(xué)公司；肌酐（creatinine，Cr）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自四川maccura生物公司；甲狀旁腺激素（parathyroid hormone，PTH）試劑及校準(zhǔn)品購(gòu)自瑞士Roche公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)本采集與處理 采集研究對(duì)象清晨空腹?fàn)顟B(tài)下靜脈血3～5 mL，離心后獲取上層血清液，于-80℃保存，用于miRNA和生化指標(biāo)的檢測(cè)。

1.3.2 血清HCMV miRNA表達(dá)的檢測(cè) 基于Taq-Man探針的qRT-PCR方法檢測(cè)血清miR-US4-3p（5′-UGACAGCCCGCUACACCUCU-3′）的 水 平。首先，取單個(gè)血清樣本100μL，總RNA提取采用酸性苯酚-氯仿一步法進(jìn)行抽提［14］，每個(gè)血清樣品在提取過程中均加入20μL人工合成的濃度為107fmol/L的植物MIR2911（5′-GGCCGGGGGACGGGC UGGGA-3′）成熟體作為外源性參照，用于校正RNA提取效率和誤差，提取后的總RNA溶于22μL DEPC水。

血清RNA逆轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)體系為10μL：DEPC水3.5μL、5×AMV緩沖液2μL、dNTPs 1 μL、逆轉(zhuǎn)錄引物1μL、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶0.5μL、RNA樣品2.0μL。反應(yīng)條件參數(shù)為：16℃30 min；42℃30 min；85℃5 min，每個(gè)反應(yīng)均為1個(gè)循環(huán)。逆轉(zhuǎn)錄所得cDNA凍存于-20℃。

qRT-PCR反應(yīng)體系為20μL：ddH2O 14.77μL、10×PCR緩沖液2μL、25 mmol/L MgCl21.2μL、dNTPs 0.4μL、Taq聚合酶0.3μL、miRNA檢測(cè)探針0.33μL、cDNA 1μL。反應(yīng)條件參數(shù)為：95℃5 min，1個(gè)循環(huán)；95℃15 s，60℃1 min，共40個(gè)循環(huán)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用2-ΔCt方式計(jì)算miR-US4-3p的相對(duì)表達(dá)量，ΔCt=Ct目的miRNA-CtMIR2911。每個(gè)Ct值為相應(yīng)樣品重復(fù)測(cè)定3次后所得均值，同時(shí)以不含RNA的模板的ddH2O水作為陰性對(duì)照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用單樣本Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)數(shù)據(jù)分布的正態(tài)性。正態(tài)分布資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，方差齊性時(shí)組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，方差非齊性時(shí)采用Tamhane′s T2檢驗(yàn)。非正態(tài)分布資料采用中位數(shù)（第25百分位數(shù)，第75百分位數(shù)）［M（P25，P75）］表示，兩組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)，多組間比較采用Kruskal-wallis H秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用百分比表示，兩組間比較采用χ2檢驗(yàn)。變量間相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析。采用ROC曲線和Logistic回歸分析血清miR-US4-3p水平對(duì)DN預(yù)測(cè)和區(qū)分價(jià)值。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象的一般資料 對(duì)DN、DM和對(duì)照組患者的一般資料進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果顯示，3組患者的DM病程、HbA1c、FPG、TG、LDL-C、HDL-C、Cr和Cys C差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。對(duì)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)進(jìn)行兩兩比較，結(jié)果顯示DN組和對(duì)照組間，HbA1c、FPG、TG、LDL-C、HDL-C和Cre差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。DN組與DM組相比，糖尿病病程、HbA1c、LDL-C、Cre和Cys C差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。DM組與對(duì)照組相比，HbA1c、FPG、TG、HDL-C差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。而各組研究對(duì)象性別、年齡等比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。見表1。

表1 3組研究對(duì)象臨床基本資料比較

2.2 各組血清miR-US4-3p表達(dá)水平比較 qRT- PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組及DM組相比，DN組患者血清miR-US4-3p的表達(dá)水平升高（P＜0.001），而DM組與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組血清miR-US4-3p表達(dá)水平比較

2.3 血清miR-US4-3p與DN患者臨床指標(biāo)之間的相關(guān)性分析 Spearman相關(guān)性分析顯示，DN患者血清miR-US4-3p與Cys C（r=0.288，P=0.023）、PTH（r=0.493，P=0.045）呈正相關(guān)，與eGFR呈負(fù)相關(guān)（r=-0.280，P=0.026），而與HbA1c（r=-0.127，P=0.342）、FPG（r=0.028，P=0.826）、TG（r=0.032，P=0.803）、TC（r=0.135，P=0.288）、LDL-C（r=0.062，P=0.629）、HDL-C（r=-0.103，P=0.468）、Cr（r=0.245，P=0.053）、糖尿病病程（r=-0.053，P=0.699）不相關(guān)。

2.4 血清miR-US4-3p對(duì)DN的預(yù)測(cè)及區(qū)分價(jià)值 ROC曲線分析顯示，miR-US4-3p能夠較好區(qū)分DN患者和健康對(duì)照者，其ROC曲線下面積（areas under the ROC curve，AUC）為0.792（95%CI：0.715～0.869），見圖1A。當(dāng)cut-off值為0.011時(shí)，miR-US4-3p診斷DN的敏感性為71.9%，特異性為73.4%。此外，miR-US4-3p在鑒別DM和DN的AUC為0.748（95%CI：0.664～0.832），見圖1B。在cut-off值為0.012時(shí)，其敏感性為71.9%，特異性為64.1%。

圖1 miR-US4-3p對(duì)DN預(yù)測(cè)和區(qū)分的ROC曲線

Logistic回歸單因素模型中僅納入血清miRUS4-3p分析，結(jié)果顯示：以對(duì)照組為參考類別，高血清miR-US4-3p水平與DN的發(fā)生相關(guān)（OR=7.065，95%CI=3.247～15.376，P＜0.001）；以DM組為參考類別，血清miR-US4-3p水平的升高還可區(qū)分DN和DM（OR=4.879，95%CI=2.304～10.332，P＜0.001）。多因素模型中除了納入血清miR-US4-3p外，還同時(shí)納入年齡、性別及血脂指標(biāo)（TG、TC、LDL-C、HDL-C），結(jié)果顯示，在校正年齡、性別及其他血脂水平影響后，血清miR-US4-3p水平的升高仍與DN的發(fā)生密切相關(guān)（OR=7.236，95%CI=2.633～19.889，P＜0.001），對(duì)DN和DM的區(qū)分仍具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（OR=6.466，95%CI=2.778～15.052，P＜0.001）。見表3。

表3 多因素Logistic回歸分析血清miR-US4-3p水平對(duì)DN的預(yù)測(cè)及區(qū)分價(jià)值

3 討論

DN約占DM患者的40%，但其發(fā)病機(jī)制尚未明確。既往研究已證實(shí)，多種miRNAs參與腎小管上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)、糖代謝紊亂、腎纖維化、系膜細(xì)胞肥大的病理過程［15］。病原微生物與人類疾病的關(guān)系日益受到重視，諸多證據(jù)表明HCMV感染與炎癥反應(yīng)激活、血管重塑相關(guān)，HCMV利用自身編碼的miRNAs調(diào)節(jié)自身及宿主細(xì)胞的基因差異表達(dá)可進(jìn)一步完成免疫逃避、細(xì)胞進(jìn)程調(diào)節(jié)、病毒DNA復(fù)制以及對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)功能。HCMV miRNAs的研究可為進(jìn)一步了解病毒致病機(jī)制和宿主防御機(jī)制提供線索。Pan等［16］研究表明，血清HCMV miR-US4-1可作為預(yù)測(cè)干擾素α治療慢性乙型肝炎患者療效新的生物標(biāo)志物，提示檢測(cè)HCMV miRNA的變化在疾病中具有重要意義。然而，HCMV miRNA與DN之間的聯(lián)系尚未得到闡明。本研究發(fā)現(xiàn)，DN患者血清HCMV miR-US4-3p的表達(dá)顯著高于健康人群和DM患者，而DM患者與健康人群間的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步多因素Logistic回歸分析顯示，在校正了年齡、性別、其他血脂指標(biāo)影響后，血清高miR-US4-3p是DN發(fā)生的危險(xiǎn)指標(biāo)，且對(duì)DN和DM患者的鑒別具有意義，提示血清miR-US4-3p有望成為DN發(fā)病的輔助診斷指標(biāo)及DN與DM間潛在的鑒別指標(biāo)。

研究顯示，免疫及炎癥反應(yīng)在DN發(fā)病機(jī)制中發(fā) 揮 重 要 作 用［11］。Kim 等［9］報(bào) 道，HCMV miR-US4-1可調(diào)控ERAP1 mRNA的翻譯水平，從而極大地降低抗原的呈遞，逃逸宿主對(duì)其的監(jiān)控和免疫。Huang等［5］研究表明，hcmv-miR-UL112通過下調(diào)Ⅰ型IFN信號(hào)傳導(dǎo)抑制NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性來破壞先天免疫，表明HCMV可以利用基于miRNA的免疫逃逸機(jī)制。既往研究證實(shí)，HCMV感染導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的激活［17］，而高血糖導(dǎo)致糖基化終產(chǎn)物增多，可通過NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞遷移并釋放炎癥細(xì)胞因子TNF-α及IL-1β，NF-κB活化可刺激趨化因子和黏附分子的轉(zhuǎn)錄。近年來研究證實(shí)內(nèi)皮功能障礙對(duì)腎小球疾病的發(fā)生、發(fā)展有著重要影響，腎小球內(nèi)皮細(xì)胞通過與系膜細(xì)胞及足細(xì)胞的交流可進(jìn)一步促進(jìn)DN發(fā)展。Shen等［18］研究發(fā)現(xiàn)，HCMV miR-UL112可通過絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路、細(xì)胞黏附分子、趨化因子信號(hào)通路、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用等途徑誘導(dǎo)血管細(xì)胞（如內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞）功能障礙，導(dǎo)致血管損傷；miR-UL112還可通過調(diào)控ACE2基因在腎臟中的表達(dá)，影響腎素血管緊張素系統(tǒng)從而調(diào)控機(jī)體血壓水平［19］。因此，我們推測(cè)miR-US4-3p可能參與調(diào)節(jié)DN的免疫逃避及炎癥反應(yīng)進(jìn)程，并通過誘導(dǎo)血管內(nèi)皮功能障礙，使足細(xì)胞、系膜細(xì)胞發(fā)生改變，進(jìn)一步加重DN發(fā)展。本研究中相關(guān)分析證實(shí)血清miR-US4-3p的表達(dá)與Cys C、PTH顯著正相關(guān)，Cys C不受性別、年齡等因素影響，并且腎臟是其唯一清除器官，能夠靈敏反映腎臟損傷程度［20］；DN時(shí)由于患者腎小球通透性增強(qiáng)，血鈣丟失刺激PTH分泌增多，因此PTH的檢測(cè)也可作為判定早期腎臟損傷的預(yù)警指標(biāo)之一。以上研究均提示miR-US4-3p參與DN發(fā)展進(jìn)程。

研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞外囊泡（EVs）中富含miRNA，并能保護(hù)其不被降解［21］。越來越多的證據(jù)表明，EVs通過細(xì)胞與細(xì)胞之間的交流在病毒感染中起著重要作用。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)病毒感染可以改變宿主細(xì)胞中EVs miRNA的表達(dá)，Zhang等［2］通過深度測(cè)序分析人類胚胎肺成纖維細(xì)胞（HELF）中EVs miRNA發(fā)現(xiàn)，EVs中miR-US25-1-5p和miR-UL112-3p在感染后6 h水平升高，HCMV感染嬰兒血清EVs miR-US25-1-5p和miR-UL112-3p的水平與肝損害密切相關(guān)。從Zhang等［2］結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，感染細(xì)胞可釋放更多的EVs，HCMV miRNA可以通過EVs轉(zhuǎn)運(yùn)至受體細(xì)胞發(fā)揮作用。Ding等［22］發(fā)現(xiàn)，在HCMV潛伏期，口腔扁平苔蘚病患者血漿樣本中hcmv-miR-UL59大多數(shù)以外泌體形式存在。因此，可以推測(cè)HCMV miRNA的變化也可能是由病毒感染或炎癥細(xì)胞分泌的EVs引起。但是，各種疾病中HCMV miRNA的存在形式仍需進(jìn)一步驗(yàn)證，HCMV感染與EVs miRNA之間的具體機(jī)制仍然未知。

綜上所述，血清HCMV miR-US4-3p在DN中高表達(dá)，其可能是DM患者腎臟損傷的重要生物學(xué)標(biāo)志物，但血清miR-US4-3p與微量尿蛋白指標(biāo)的比較以及其在DN發(fā)生發(fā)展過程中的具體病理生理機(jī)制仍需深入研究。鑒于本研究例數(shù)有限，仍需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量、開展前瞻性研究及臨床隨訪再次驗(yàn)證和確定血清HCMV miR-US4-3p對(duì)DN患者的臨床價(jià)值。