精子線粒體功能檢測與男性不育相關(guān)性的研究進(jìn)展

李紅林，傅廣波，呂述彥（南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，江蘇淮安223300）

不孕不育癥指育齡夫婦未采取任何避孕措施，有規(guī)律性生活12個(gè)月內(nèi)女方未獲得臨床妊娠［1］。據(jù)WHO估計(jì)全球約有1.9億人患有不孕不育癥［2］，其中約50%是由男方因素導(dǎo)致的不育癥［3］。臨床工作中，男性不育癥的篩查和診斷主要是依據(jù)精液量、精子濃度、精子活力和精子形態(tài)等指標(biāo)的檢驗(yàn)結(jié)果［4-5］，但大約30%～50%的特發(fā)性男性不育癥患者的精液常規(guī)檢驗(yàn)指標(biāo)卻完全正常［6］。線粒體是唯一含有獨(dú)立基因組的細(xì)胞器，通過氧化磷酸化產(chǎn)生的適量活性氧（ROS）和三磷酸腺苷（ATP）維持精子活力、獲能、頂體反應(yīng)和DNA完整性［7］。精子線粒體損傷會引發(fā)能量合成障礙，導(dǎo)致精子質(zhì)量和功能下降、甚至消失。現(xiàn)對近年來應(yīng)用精子線粒體分子結(jié)構(gòu)和功能檢驗(yàn)指標(biāo)評估男性生育力的研究進(jìn)展作一綜述，為男性不育癥發(fā)病機(jī)制的研究以及精子線粒體功能檢測指標(biāo)的臨床應(yīng)用提供參考。

1 精子線粒體功能與ROS

精子細(xì)胞中線粒體數(shù)超過103個(gè)/細(xì)胞。精子發(fā)育成熟過程中，隨著其他細(xì)胞器和細(xì)胞質(zhì)的消失，線粒體的數(shù)量和結(jié)構(gòu)也發(fā)生顯著變化，當(dāng)精卵結(jié)合形成受精卵時(shí)，精子線粒體會通過自噬途徑被完全降解清除［8］。在成熟精子中僅有約80個(gè)線粒體［9］，首尾相連并螺旋形地纏繞在鞭毛周圍，形成厚的線粒體鞘，位于精子尾中部的外質(zhì)膜下方［10］，是精子內(nèi)能量轉(zhuǎn)換和新陳代謝的關(guān)鍵部位，與精子的發(fā)生發(fā)育、凋亡和受精過程密切相關(guān)，其功能主要有［11］：（1）通過氧化磷酸化合成ATP，為精子運(yùn)動提供主要的能量來源；（2）通過“固有”凋亡途徑調(diào)控精子凋亡，維持男性生育力；（3）產(chǎn)生ROS；（4）維持精子內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)；（5）參與類固醇激素的生物合成；（6）維持人類精子頂體酶活性、頂體反應(yīng)和染色質(zhì)完整性，直接影響精子的受精能力［7］。其中精子線粒體氧化磷酸化過程中產(chǎn)生的ROS是一把雙刃劍：適量的ROS是精子酪氨酸磷酸化-去磷酸化、膽固醇外排的必要條件，參與精子成熟、獲能和精卵結(jié)合過程；但精索精脈曲張［12］、環(huán)境污染［13］、藥物［14］、高溫、吸煙、肥胖等因素引起精子產(chǎn)生過多ROS而又無法及時(shí)清除時(shí)，會導(dǎo)致氧化應(yīng)激，引起脂質(zhì)過氧化、ATP生成減少，損傷精子DNA（包括線粒體DNA）和線粒體膜，導(dǎo)致線粒體膜電位（MMP）下降，破壞軸絲、鞭毛等結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)生殖細(xì)胞凋亡，降低精子濃度、活力，增加精子畸形率，從而影響男性生育力。輔酶Q10、維生素E等抗氧化劑則可降低ROS、改善精子質(zhì)量，提高男性生育力［15］。

2 精子線粒體膜電位（MMP）與男性不育

精子線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）是指在精子能量代謝過程中，電子經(jīng)呼吸鏈傳遞產(chǎn)生ATP，同時(shí)復(fù)合物Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ將質(zhì)子從線粒體內(nèi)膜基質(zhì)側(cè)泵至內(nèi)膜外所形成的跨膜電位差。在正常的線粒體中，跨膜電位差反映了電子傳輸和氧化磷酸化的過程，該過程驅(qū)動線粒體ATP的產(chǎn)生。因此，MMP是反映精子線粒體功能的關(guān)鍵指標(biāo)。

MMP可反映精子質(zhì)量與線粒體功能之間的密切關(guān)系。早在1982年，Evenson等［16］就發(fā)現(xiàn)弱精子癥患者精子MMP水平較低。研究進(jìn)一步證實(shí)MMP與精子活力、正常形態(tài)之間存在相關(guān)性［17］。楊穎等［18］報(bào)道弱精子組MMP低于對照組，且MMP與精子活動率、前向運(yùn)動精子百分率及正常形態(tài)精子百分率呈正相關(guān)。Zhang等［7］報(bào)道正常水平的精子MMP是維持精子頂體酶活性和染色質(zhì)完整性的生理基礎(chǔ)，MMP低的精子不易進(jìn)行頂體反應(yīng)。因此，國外學(xué)者建議對不明原因不育夫婦且男方精子MMP水平較低時(shí)，采用卵細(xì)胞質(zhì)內(nèi)單精子注射技術(shù)（ICSI）治療［19］。MMP和精子DNA碎片指數(shù)（DFI）聯(lián)合預(yù)測女性配偶自然受孕的能力優(yōu)于精液常規(guī)參數(shù)［20］，是臨床評估特發(fā)性男性不育的重要指標(biāo)［21］。

精子冷凍復(fù)蘇過程會導(dǎo)致線粒體超微結(jié)構(gòu)紊亂，ROS生成增加，ATP生成減少、MMP下降。在冷凍保護(hù)劑中補(bǔ)充抗氧化劑左卡尼汀［22］、白藜蘆醇［23］等則可明顯改善冷凍損傷后精子的MMP水平，從而提高精子活力和存活率。這可能是因?yàn)榭寡趸瘎┣宄司€粒體膜上過量的長鏈脂肪酰基，維持線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換，抑制線粒體電子傳遞鏈系統(tǒng)釋放電子，減少了ROS生成。

3 精子線粒體DNA（mtDNA）與男性不育

線粒體不同于其他細(xì)胞器的特征是其含有獨(dú)立的基因組，即線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA），含37個(gè)基因，可編碼13種多肽參與氧化磷酸化過程。mtDNA是無保護(hù)性組蛋白的環(huán)狀雙鏈結(jié)構(gòu)，可通過高速D環(huán)復(fù)制方法獨(dú)立于核DNA進(jìn)行復(fù)制，且無修復(fù)系統(tǒng)。因此，與核基因組相比，它更容易被氧化應(yīng)激破壞［24］。

3.1 mtDNA缺失 在氧化磷酸化缺陷患者的線粒體基因組中已鑒定出超過50個(gè)點(diǎn)突變和大量復(fù)雜的重排，如缺失和重復(fù)。mtDNA缺失（mtDNA deletion，mtDNAdel）主要發(fā)生在2個(gè)mtDNA復(fù)制叉之間的大弧中。4 977位點(diǎn)缺失是少精子癥和弱精子癥患者mtDNAdel發(fā)生率最高的位點(diǎn)，缺失頻率與8-羥基-2-脫氧鳥苷（氧化性DNA的生物標(biāo)志物）含量之間存在正相關(guān)，說明ROS引起的DNA氧化損傷可能被固定為精子線粒體中mtDNA的大規(guī)模缺失［25］。弱精子癥患者精子mtDNA較常見的缺失位點(diǎn)還有7 345、7 436、7 599、4 866位點(diǎn)等［26-31］，且常發(fā)生大規(guī)模的mtDNA多個(gè)位點(diǎn)缺失。由缺失mtDNA編碼的呼吸鏈蛋白質(zhì)多存在功能缺陷，會增強(qiáng)ROS或自由基產(chǎn)生，引發(fā)ATP生成障礙，進(jìn)一步損傷mtDNA，如此惡性循環(huán)導(dǎo)致精子陷入能量危機(jī)和活力下降，造成男性生育力低下。

3.2 mtDNA拷貝數(shù)變異 拷貝數(shù)是指某基因在某一生物基因組中的個(gè)數(shù)。mtDNA拷貝數(shù)（mitochondrial DNA copy number，mtDNAcn）是指每個(gè)精子中的mtDNA數(shù)。正常成熟精子總共約有1 000～1 500個(gè)mtDNAcn。mtDNAcn變異被認(rèn)為是導(dǎo)致男性不育的一個(gè)重要因素。Rosati等［30］從美國16個(gè)縣招募了384對夫妻，檢測了男方精液樣本的mtDNAcn和mtDNAdel，并用離散時(shí)間比例風(fēng)險(xiǎn)模型評估1年內(nèi)女性伴侶懷孕概率，結(jié)果表明mtDNAcn可能是男性生育力更準(zhǔn)確的預(yù)測指標(biāo)。Wu等［32］報(bào)道在實(shí)施人類輔助生殖技術(shù)的人群中，精子mtDNAcn變異和mtDNAdel與受精率均呈負(fù)相關(guān)，與受精后第3天的優(yōu)質(zhì)胚胎率呈正相關(guān)。但Tiegs等［33］報(bào)道精子mtDNAcn在接受ICSI治療的不育人群中，不能預(yù)測卵子受精率、可利用胚胎率和活產(chǎn)率。研究結(jié)論差異可能與研究所選人群不同有關(guān)，需進(jìn)一步擴(kuò)大研究人群樣本量和種族。

3.3 mtDNA點(diǎn)突變 除mtDNA缺失位點(diǎn)、頻率和拷貝數(shù)異常與男性不育密切相關(guān)外，mtDNA點(diǎn)突變也可能影響線粒體蛋白功能，導(dǎo)致精子ATP生成減少，影響精子活力。Baklouti-Gargouri等［34］研究發(fā)現(xiàn)所有弱精子癥患者精子mtDNA均發(fā)生了細(xì)胞色素氧化酶Ⅲm.9588G＞A的突變。Holyoake等［35］研究發(fā)現(xiàn)mtDNA ATPase6基因上T8821A位的點(diǎn)突變可能因影響精子成熟而引起男性不育。但也有文獻(xiàn)報(bào)道［36］，大多數(shù)與男性不育相關(guān)的mtDNA多態(tài)性在普通人群中更為普遍，兩者之間沒有關(guān)聯(lián)性。Mao等［37］最新報(bào)道顯示，在使用體外受精/卵細(xì)胞質(zhì)內(nèi)單精子注射（IVF/ICSI）受精失敗的人群中，精子線粒體還原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）脫氫酶亞基5（ND5）和NADH脫氫酶亞基6（ND6）基 因 中C12417T、C13650A、C13765A、T13769C、C13785A和C13845T等6個(gè)位點(diǎn)的基因變異率在受精失敗人群中高于正常受精組，提示這些mtDNA位點(diǎn)突變與精子的受精能力密切相關(guān)。未來需進(jìn)一步探索引起男性不育的特異性mtDNA突變位點(diǎn)，為男性不育的基因診斷和科學(xué)防治提供依據(jù)。

4 精子線粒體功能檢驗(yàn)

線粒體鞘由富含半胱氨酸和脯氨酸的硒蛋白組成，該結(jié)構(gòu)蛋白中含多個(gè)二硫鍵，在成熟的精子中無酶活性，導(dǎo)致精子線粒體特別難以分離，因此大多數(shù)對精子線粒體功能的測定都利用原位分析或去膜精子。目前，評估精子線粒體與男性生育力關(guān)系的檢驗(yàn)指標(biāo)有精子線粒體的超微結(jié)構(gòu)、mtDNA點(diǎn)突變、mtDNA重復(fù)或缺失、精子線粒體完整性、mtDNA拷貝數(shù)、ROS、MMP水平、線粒體活性和線粒體鈣離子水平［24］等。目前，使用較廣泛的指標(biāo)是精子MMP水平和mtDNA的分子生物學(xué)檢驗(yàn)。

4.1 MMP檢驗(yàn) MMP水平不僅反映精子線粒體的能量狀態(tài)，還與精子活力密切相關(guān)，因此，國外學(xué)者建議將精子MMP作為評估男性不育的常規(guī)指標(biāo)［17］。通常選用5，5′，6，6′-四氯-1，1′，3，3′-四乙基苯并咪唑羰花菁碘化物（JC-1）、四甲基羅丹明甲酯高氯酸鹽（TMRM）、羅丹明123（Rh123）等熒光探針染色線粒體，經(jīng)熒光顯微鏡或流式細(xì)胞術(shù)檢測MMP。人類精子MMP檢測常用熒光染料的比較見表1。其中JC-1作為熒光染料檢測精子MMP水平［4］，是評估精子線粒體功能的特異性高、可靠性強(qiáng)的最為常用的方法。該方法的原理是精子MMP水平正常時(shí)，JC-1因極性作用進(jìn)入線粒體內(nèi)，并隨著濃度增高而形成發(fā)射紅色熒光的多聚體，當(dāng)精子MMP水平降低時(shí)，線粒體內(nèi)JC-1濃度降低，并逆轉(zhuǎn)為發(fā)射綠色熒光的單體形式，因此可通過檢測熒光變化來檢測MMP水平。但該方法檢測抗氧化劑治療過的精子標(biāo)本時(shí)，MMP檢驗(yàn)結(jié)果與精子活力、ATP濃度多不一致，因此，Uribe等［38］推薦當(dāng)精液中存在抗氧化劑時(shí)，應(yīng)用TMRM作熒光探針檢測精子MMP的變化。TMRM進(jìn)入精子并積累在線粒體中，并隨著線粒體膜電位的增加發(fā)出紅色熒光。

表1 人類精子MMP檢測常用熒光染料比較

4.2 mtDNA分析 mtDNA突變包括缺失、點(diǎn)突變和重排突變。mtDNA的缺失型與野生型能共存于同一細(xì)胞，這種現(xiàn)象稱為mtDNA異質(zhì)性。mtDNA異質(zhì)性的存在增加了其檢測難度。目前多采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測其拷貝數(shù)或運(yùn)用長鏈PCR結(jié)合引物遷移技術(shù)檢測其完整性，線粒體全基因組測序技術(shù)通量大、覆蓋度廣，可檢測mtDNA未知變異，但因成本高昂、多用于科學(xué)研究。精子mtDNA檢驗(yàn)常用引物見表2。

表2 精子mtDNA檢驗(yàn)常用PCR引物

5 總結(jié)

精子線粒體具有不同于其他體細(xì)胞線粒體的獨(dú)特特征，影響著精子的活力、獲能、頂體反應(yīng)和最終受精能力等。MMP水平的變化、mtDNA突變或缺失均可引起精子能量合成障礙，導(dǎo)致男性不育。mtDNAcn是評估男性生殖健康及預(yù)測其女性配偶成功妊娠的生物標(biāo)志物。MMP的檢測通常使用JC-1探針，必要時(shí)應(yīng)選用TMRM，以避免抗氧化劑對檢測結(jié)果的干擾。