低抗苗勒管激素水平與卵巢儲(chǔ)備功能下降不孕患者凍胚移植臨床結(jié)局的相關(guān)性*

羅榮，楊芳，明琪，王佳慧，沈濤，招霞，梁元姣（.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，南京0009；.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，南京0009）

抗苗勒管激素（anti-müllerian hormone，AMH）是一種屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β家族的糖蛋白，在人體內(nèi)主要由直徑約2～10 mm的小竇卵泡和竇前卵泡產(chǎn)生，在卵泡整個(gè)形成過(guò)程中表達(dá)，對(duì)卵泡的募集和生長(zhǎng)起抑制作用［1-2］。卵巢儲(chǔ)備是指卵巢內(nèi)產(chǎn)生卵子數(shù)量和質(zhì)量的能力，卵巢儲(chǔ)備功能下降（diminished ovarian reserve，DOR）是指卵巢內(nèi)可募集卵泡數(shù)目減少，卵母細(xì)胞質(zhì)量下降，可出現(xiàn)于任何年齡的女性［3］。研究表明，血清AMH是評(píng)估女性卵巢儲(chǔ)備的一個(gè)可靠指標(biāo)［4-5］，AMH與卵巢基礎(chǔ)竇卵泡數(shù)量（antral follicle count，AFC）呈正相關(guān)，并隨著女性年齡增長(zhǎng)而下降［6-7］。國(guó)內(nèi)外探索AMH與卵巢儲(chǔ)備不良患者新鮮胚胎移植臨床妊娠結(jié)局是否有關(guān)的研究較多，而關(guān)注AMH與凍融胚胎（凍胚）復(fù)蘇移植（frozen embryo transfer，F(xiàn)ET）后臨床結(jié)局關(guān)系的研究較少。本研究通過(guò)回顧性分析觀(guān)察低AMH水平與DOR患者FET臨床結(jié)局的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 2018年1月至2019年6月于東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科取卵后行第1～3次FET周期的256例DOR患者，累計(jì)386個(gè)周期。其中取卵后第1次行FET的周期為230個(gè)，第2次行FET的周期為135個(gè)，第3次行FET的周期為21個(gè)。納入標(biāo)準(zhǔn)：基礎(chǔ)AFC＜5～7枚或2次基礎(chǔ)卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）＞10 IU/L［8］，且AMH≤1.50 ng/mL。排除標(biāo)準(zhǔn)：已知子宮畸形、宮腔粘連、子宮內(nèi)膜病理性改變（如子宮內(nèi)膜息肉、子宮內(nèi)膜不典型增生）、自身免疫病、高凝狀態(tài)等。研究對(duì)象對(duì)相關(guān)醫(yī)療程序均知情同意。

1.2 主要儀器與試劑 DXI 800 Access免疫分析系統(tǒng)及配套AMH、FSH、雌二醇（E2）化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑（美國(guó)貝克曼公司）。AMH最低檢測(cè)濃度為0.10 ng/mL，總變異系數(shù)≤10.0%；血清FSH最低檢測(cè)濃度為0.2 IU/L，總變異系數(shù)＜10%；血清E2最低檢測(cè)濃度為65 pmol/mL，總變異系數(shù)≤15.0%。

1.3 標(biāo)本采集與檢測(cè) 月經(jīng)期第2～4天上午8：00—12：00采集靜脈血3 mL，離心分離血清，1 h內(nèi)送檢，按試劑盒說(shuō)明書(shū)完成AMH、FSH、E2檢測(cè)。

1.4 觀(guān)察指標(biāo) 觀(guān)察患者一般指標(biāo)，包括年齡、身體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）、不孕年限。實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，包括FSH、E2、AMH。觀(guān)察移植相關(guān)指標(biāo)，包括移植日子宮內(nèi)膜厚度、移植胚胎類(lèi)型（卵裂胚/囊胚）、移植胚胎數(shù)。觀(guān)察臨床結(jié)局指標(biāo)，臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/胚胎移植總周期數(shù)×100%，流產(chǎn)率=流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%，活產(chǎn)率=活產(chǎn)周期數(shù)/胚胎移植總周期數(shù)×100%。將臨床妊娠率、流產(chǎn)率和活產(chǎn)率作為臨床結(jié)局的主要觀(guān)察目標(biāo)，分析患者AMH水平、年齡、基礎(chǔ)FSH、移植胚胎類(lèi)型、移植胚胎數(shù)、移植日子宮內(nèi)膜厚度與復(fù)蘇周期臨床結(jié)局的相關(guān)性。

1.5 凍胚移植

1.5.1 DOR患者取卵周期卵巢刺激方案 以自然周期方案、黃體期促排卵方案、微刺激方案、高孕激素促排卵方案為主［9］。取卵后采取全胚冷凍策略［10］。獲得凍胚后在下一次月經(jīng)周期擬定復(fù)蘇周期內(nèi)膜準(zhǔn)備方案。

1.5.2 內(nèi)膜準(zhǔn)備方案 自然周期：月經(jīng)周期第11天開(kāi)始行經(jīng)陰道B超監(jiān)測(cè)卵泡及子宮內(nèi)膜厚度，于排卵日予口服地屈孕酮10 mg，每日2次，肌注黃體酮40 mg/d，排卵日+3 d移植卵裂胚，排卵日+5 d移植囊胚。促排周期：月經(jīng)第3～5天開(kāi)始口服來(lái)曲唑2.5 mg/d，周期第11天監(jiān)測(cè)卵泡及子宮內(nèi)膜厚度，優(yōu)勢(shì)卵泡直徑達(dá)18～20 mm時(shí)注射HCG 5 000～10 000單位，HCG日+5 d移植卵裂胚，HCG日+7 d移植囊胚。激素替代周期（hormone replace treatment，HRT）：月經(jīng)第3天開(kāi)始服用戊酸雌二醇2 mg，每日2次，每隔5 d監(jiān)測(cè)子宮內(nèi)膜厚度，并據(jù)此靈活調(diào)整戊酸雌二醇用量，當(dāng)子宮內(nèi)膜厚度≥8 mm時(shí)，予口服地屈孕酮20 mg，每日2次，肌注黃體酮40 mg/d行內(nèi)膜轉(zhuǎn)化，內(nèi)膜轉(zhuǎn)化日用P表示，P+3 d移植卵裂胚，P+5 d移植囊胚。

1.5.3 移植后臨床結(jié)局隨訪(fǎng) 移植后14 d測(cè)血HCG，陽(yáng)性者為生化妊娠；移植后28～35 d行經(jīng)陰道B超見(jiàn)宮內(nèi)孕囊及胎心搏動(dòng)為臨床妊娠。電話(huà)隨訪(fǎng)妊娠結(jié)局，其中，流產(chǎn)為孕28周內(nèi)的妊娠丟失，活產(chǎn)為孕滿(mǎn)28周并分娩存活嬰兒。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料用±s表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)；二分類(lèi)變量用二元Logistic回歸分析多種因素對(duì)臨床結(jié)局的影響；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象的一般資料 本研究共納入386個(gè)周期，臨床妊娠130個(gè)周期，未妊娠256個(gè)周期（其中生化妊娠10個(gè)周期），臨床妊娠率為33.68%（130/386）；臨床妊娠周期中，流產(chǎn)34例，宮頸內(nèi)異位妊娠1例，宮內(nèi)妊娠合并異位妊娠1例，疤痕妊娠1例，流產(chǎn)率為26.15%（34/130），繼續(xù)妊娠率為24.09%（93/386）；活產(chǎn)56例，活產(chǎn)率為16.05%（56/349，除外隨訪(fǎng)暫未完成的37例）。

入組患者年齡（37.4±6.2）歲，BMI（23.15±3.21）kg/m2，不孕年限（4.81±4.06）年，基礎(chǔ)FSH（10.79±8.13）IU/L，基礎(chǔ)E2（277.65±394.97）pmol/L，AMH（0.67±0.38）ng/mL，移植日子宮內(nèi)膜厚度（9.63±1.86）mm，移植卵裂胚297個(gè)周期，移植囊胚89個(gè)周期，平均每周期移植胚胎個(gè)數(shù)（1.74±0.55）個(gè)。

2.2 臨床妊娠組和未妊娠組一般情況比較 臨床妊娠組年齡小于未妊娠組（P＜0.05），基礎(chǔ)FSH低于未妊娠組（P＜0.05）；臨床妊娠組AMH、移植日子宮內(nèi)膜厚度均高于未妊娠組（P均＜0.05）；且囊胚移植的比例高于未妊娠組（P＜0.05）。臨床妊娠組和未妊娠組BMI、不孕年限、基礎(chǔ)E2、移植胚胎個(gè)數(shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 臨床妊娠組和未妊娠組一般情況比較

2.3 流產(chǎn)組與活產(chǎn)組一般情況比較 獲得臨床妊娠的患者根據(jù)臨床結(jié)局分為流產(chǎn)組和活產(chǎn)組?；町a(chǎn)組年齡小于流產(chǎn)組（P＜0.05），BMI低于流產(chǎn)組（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 流產(chǎn)組與活產(chǎn)組一般情況比較

2.4 AMH分組的一般情況和臨床結(jié)局比較 根據(jù)AMH值分為AMH極低（0.01～0.50 ng/mL）、中低（0.51～1.00 ng/mL）、低（1.01～1.50 ng/mL）3組。AMH中低、低組間一般情況差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。AMH極低組和中低、低組年齡、基礎(chǔ)FSH、移植胚胎類(lèi)型差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。AMH極低組臨床妊娠率低于中低、低組（P＜0.05）；AMH極低組活產(chǎn)率低于中低、低組（P＜0.05）；AMH極低、中低、低組流產(chǎn)率逐漸降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表3。

表3 不同AMH分組一般情況比較

2.5 臨床結(jié)局的多因素Logistic回歸分析 根據(jù)一般情況分析，納入可能的影響因素，選擇P＜0.1，以及可能對(duì)目標(biāo)結(jié)局產(chǎn)生影響的因素，包括年齡、基礎(chǔ)FSH、AMH分組、移植日子宮內(nèi)膜厚度、移植胚胎類(lèi)型進(jìn)行多因素回歸分析顯示，矯正可能存在的混雜因素后，臨床妊娠率（OR=0.902，95%CI：0.864～0.941，P＜0.05）、活產(chǎn)率（OR=0.861，95%CI：0.811～0.915，P＜0.05）均與年齡呈負(fù)相關(guān)，流產(chǎn)率與年齡呈正相關(guān)（OR=1.158，95%CI：1.056～1.270，P＜0.05）；移植囊胚可提高臨床妊娠率（OR=1.781，95%CI：1.027～3.085，P＜0.05）。根據(jù)移植胚胎類(lèi)型的不同，進(jìn)一步分析復(fù)蘇周期臨床妊娠率發(fā)現(xiàn)，在A(yíng)MH中低組和低組人群中，囊胚移植組臨床妊娠率高于卵裂胚移植組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；在A(yíng)MH極低組中，移植囊胚或卵裂胚的臨床妊娠率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。不同AMH水平組間，移植卵裂胚（或囊胚）獲得的臨床妊娠率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表4。

表4 不同AMH分組移植不同胚胎類(lèi)型臨床妊娠率的比較

3 討論

DOR意味著卵巢產(chǎn)生的卵子數(shù)量及質(zhì)量下降，是女性不孕的重要原因之一。研究表明，血清AMH可用于評(píng)估卵巢儲(chǔ)備及預(yù)測(cè)卵巢對(duì)促排卵藥物的反應(yīng)［11-12］，是評(píng)估卵巢儲(chǔ)備可靠的獨(dú)立因素之一［1，13］，低AMH水平常代表卵巢儲(chǔ)備不良。但是低AMH水平與胚胎移植臨床結(jié)局的相關(guān)性尚有待研究。在新鮮胚胎移植周期的相關(guān)研究中，有研究表明，AMH與臨床妊娠結(jié)局及活產(chǎn)結(jié)局無(wú)相關(guān)性或相關(guān)性極弱［14-16］。但也有研究認(rèn)為，AMH可以提示臨床妊娠及活產(chǎn)的幾率，在非多囊卵巢綜合征患者中，AMH值越高，臨床妊娠率及活產(chǎn)率越高［17-18］。

DOR人群主要屬于低預(yù)后波塞冬分類(lèi)［20］中的3、4類(lèi)人群，由于卵巢竇卵泡數(shù)量少，常采用自然周期、微刺激、黃體期促排卵及高孕促排卵方案，因?yàn)閮?nèi)膜與胚胎發(fā)育不同步，往往采取全胚冷凍策略［9-10］。已知影響胚胎移植后臨床結(jié)局有很多因素，最關(guān)鍵的是胚胎質(zhì)量和子宮內(nèi)膜容受性。目前，對(duì)血清AMH是否與復(fù)蘇周期結(jié)局有關(guān)尚未得出統(tǒng)一結(jié)論。

既往的兩項(xiàng)研究認(rèn)為AMH與FET臨床結(jié)局有一定的相關(guān)性［19-20］。Li等［19］觀(guān)察500名患者第一個(gè)FET周期和同一刺激周期后所有FET的活產(chǎn)及累計(jì)活產(chǎn)情況，發(fā)現(xiàn)AMH和AFC較高者，其第一周期活產(chǎn)率及累計(jì)活產(chǎn)率均高于A(yíng)MH及AFC相對(duì)較低者，但是AMH預(yù)測(cè)累計(jì)活產(chǎn)的ROC曲線(xiàn)下面積僅有0.654，僅用AMH預(yù)測(cè)累計(jì)活產(chǎn)的能力相對(duì)有限。Li等［20］回顧性分析828個(gè)第一次行FET的周期，根據(jù)AMH值將患者分為＜1.4 ng/mL、1.4～5.8 ng/mL、＞5.8 ng/mL組并比較發(fā)現(xiàn)，AMH水平較低時(shí)臨床妊娠和活產(chǎn)的機(jī)會(huì)降低，即使在35歲以下的患者中也是如此。但是上述研究針對(duì)的人群均非DOR，所以結(jié)論能否推廣至DOR人群還有待商榷。

本研究初步分析結(jié)果顯示，在DOR患者FET周期影響臨床妊娠的因素包括年齡、基礎(chǔ)FSH、AMH值、移植胚胎類(lèi)型、移植日子宮內(nèi)膜厚度。多因素分析顯示，預(yù)測(cè)臨床結(jié)局的共同獨(dú)立因素是年齡，年齡越大，臨床妊娠率和活產(chǎn)率越低，流產(chǎn)率越高；同時(shí)預(yù)測(cè)臨床妊娠的獨(dú)立因素還包括移植胚胎類(lèi)型，AMH中低組（或低組）患者可通過(guò)移植囊胚改善臨床妊娠率，但對(duì)最終活產(chǎn)率的改善無(wú)明顯作用。移植卵裂胚（或囊胚）的不同AMH水平組間，臨床妊娠率無(wú)明顯差異。因此，DOR患者的低AMH水平對(duì)FET臨床結(jié)局不具備獨(dú)立預(yù)測(cè)作用，年齡是影響結(jié)局的獨(dú)立因素。

雖然AMH水平與年齡呈負(fù)相關(guān)，DOR人群的年齡與臨床結(jié)局有獨(dú)立相關(guān)性，但AMH仍無(wú)法作為預(yù)測(cè)結(jié)局的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素，這可能是由于年齡與獲得臨床妊娠后的母體產(chǎn)生的一系列反應(yīng)（如心血管功能、肝腎功能等）有更重要的關(guān)系，這些反應(yīng)與未來(lái)該人群能否順利妊娠至分娩息息相關(guān)。同時(shí)，研究也表明即使患者處于極低的AMH水平，使用取卵和凍胚移植的輔助生殖技術(shù)后仍能獲得和普通低值A(chǔ)MH水平患者類(lèi)似的臨床結(jié)局，尤其是在年齡相對(duì)較小的女性中。