Glut 1基因沉默對(duì)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞株增殖、分化及凋亡的影響及機(jī)制研究

郭圣超，武雪亮，薛 軍，韓 磊，孫光源，楊東東，屈 明

葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在向代謝活性細(xì)胞提供能量的過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1(glucose transporter-1，

Glut

1)在真核生物和原核生物中均有發(fā)現(xiàn)，其表達(dá)升高或激活已被證明是諸多惡性腫瘤發(fā)生的主要原因。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor，TGF)-β是與腫瘤發(fā)生、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移調(diào)控密切相關(guān)的分泌型配體。TGF-β信號(hào)通路在控制細(xì)胞增殖和結(jié)腸直腸癌的分化中具有重要作用?，F(xiàn)已證實(shí)磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶標(biāo)(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B/mammalian target of rapamycin,PI3K-AKTmTOR)信號(hào)通路與細(xì)胞凋亡、增殖、血管生成和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，也是導(dǎo)致結(jié)直腸癌變的重要機(jī)制。因此，該研究旨在探討

Glut

1基因沉默介導(dǎo)的TGF-β/PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路對(duì)結(jié)腸直腸癌細(xì)胞的作用，為結(jié)直腸癌的靶向診療提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與主要試劑

人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29細(xì)胞(上海生物工程研究所);10%胎牛血清RPMI 1640、DMEM(美國(guó)Gibco公司);siRNA干擾序列(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司),載體pSIREN(北京華奧正生科技有限公司),Lipofectamine 2000(美國(guó)Invitrogen公司),DAPI(上海碧云天生物技術(shù)有限公司),TRIzol試劑 (美國(guó)Invitrogen公司),PrimeScriptTM RT reagent Kit (北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司),引物(北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司),BCA檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司),酶抑制劑(北京嘉美紐諾生物科技有限公司),MTT溶液(美國(guó)Sigma-aldrich公司)、PI染液(上海前塵生物科技有限公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將H-29細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，以1×10個(gè)/孔的密度將細(xì)胞分種于6孔培養(yǎng)板，并置于37 ℃、5% CO及飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)。

1.3 構(gòu)建質(zhì)粒

siRNA序列設(shè)計(jì)根據(jù)Genbank中的Glut 1的mRNA全序列(005983)從Glut 1編碼區(qū)中尋找符合設(shè)計(jì)原則的靶序列，通過BLAST軟件確定與其他非相關(guān)基因無同源性，按照Pg-PU 6/Neo載體的要求設(shè)計(jì)能編碼siRNA的寡核苷酸鏈 (正：5′-CACCGGGAGTGACAAAGACTTTGTTCAAG CA-3′；反：5′-GATCCAAAAAAGGGAGTGACAAAGA CTTCTC-3′)，對(duì)所有的寡核苷酸片段進(jìn)行合成。

1.4 細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染

選對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種于6孔板，每孔5×10個(gè)細(xì)胞，給予新鮮完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至細(xì)胞融合度接近50%～80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。依據(jù)Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染，將細(xì)胞分為3組：Blank組(人結(jié)腸癌HT 29細(xì)胞)、NC組(轉(zhuǎn)染非干擾序列的HT-29細(xì)胞)和shGlut 1組(轉(zhuǎn)染siRNA序列的HT-29細(xì)胞)組。lipo溶液：240 μl無血清培養(yǎng)基+10 μl lipo溶液，總體積250 μl，溫育5 min。質(zhì)粒溶液：20 μl無血清培養(yǎng)基+4 μg質(zhì)粒總體積24 μl。分別將lipo溶液和質(zhì)粒溶液混合，室溫下放置20 min，混合液逐滴加入孔中，搖動(dòng)培養(yǎng)板，輕輕混勻。在37 ℃，5%CO中保溫，5～6 h后，換完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 免疫熒光法

將細(xì)胞接種于6孔板中，加入2 ml完全培養(yǎng)基，置CO孵箱中37 ℃培養(yǎng)過夜。待細(xì)胞長(zhǎng)到50%～ 80%時(shí)，在滅菌的離心管中配制如下溶液。溶液A：將4 μg待轉(zhuǎn)染的純DNA稀釋到250 ml無血清培養(yǎng)基中，靜置5 min；溶液B：將2～25 ml LipofectAMINE稀釋到250 ml無血清培養(yǎng)基中，靜置5 min?；旌先芤篈和B，室溫放置15～45 min。用2 ml無血清培養(yǎng)基洗凈細(xì)胞，加入0.8 ml無血清培養(yǎng)基/孔，將脂質(zhì)體復(fù)合物滴加在孔中混勻，置CO孵箱中37 ℃孵育20～24 h。DAPI避光孵育30 min。用完全培養(yǎng)基替換轉(zhuǎn)染液，繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后在熒光顯微鏡下觀察蛋白表達(dá)情況，取2個(gè)表達(dá)區(qū)域保存，取均值，轉(zhuǎn)染效率=轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)目/總細(xì)胞數(shù)目。

1.6 qRT-PCR法

取結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織各30 mg，加入1 ml的TRIzol試劑，在冰浴中粉碎，提取組織中總RNA，采用紫外分光光度法檢測(cè)RNA的純度及濃度，將純度為A260/280=1.8～2.0的所有樣品濃度調(diào)整為0.1 ng/μl，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptRT reagent Ki將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA (50 ng/μl)，逆轉(zhuǎn)錄體系10 μl，參照說明書進(jìn)行，設(shè)定反應(yīng)條件為：37 ℃、15 min × 3次 (逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng))、85 ℃、5 s (逆轉(zhuǎn)錄酶失活反應(yīng))、-80 ℃凍存、備用。通過Premier 5.0 軟件自行設(shè)計(jì)引物，按兩步法在ABI 7900 HT實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行，以GAPDH為內(nèi)參照。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s；58 ℃退火30 s；72 ℃延伸15 s；40個(gè)循環(huán)。采用2法計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)水平，每個(gè)樣品的每個(gè)基因設(shè)3個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 Western blot法

取組織樣品30 g，檢測(cè)總蛋白濃度。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以3 000 r/min、4 ℃離心20 min，棄上清液，估計(jì)細(xì)胞壓積(packed cell volume，PCV)，按每20 μl細(xì)胞壓積加入裂解液100 μl和酶抑制劑1 μl的比例冰上裂解30 min，低溫12 000 r/min離心10 min，取上清液蛋白定量檢測(cè)。取50 μg蛋白溶于2×SDS上樣緩沖液中，將樣本100 ℃煮沸5 min后，將上述各樣品經(jīng)質(zhì)量濃度10% SDS-PAGE凝膠，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用質(zhì)量濃度5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，孵育兔抗人一抗 (

Glut

1：1 ∶1 000、TGF-β 1：1 ∶1 000、PI3K：1 ∶2 000、AKT：1 ∶500、p-PI3K：1 ∶800、p-S 308-AKT：1 ∶1 000、p-S 473-AKT：1 ∶1 000、p-T 389-S6K1：1 ∶500、p-T 70-4 EBP1：1 ∶500、PTEN：1 ∶600、mTOR：1 ∶500、Bax：1 ∶800、Bcl-2：1 ∶1 000、Cleaved Caspase-3：1 ∶1 000、Cleaved-PARP：1 ∶1 000)，用TBST洗3遍后將膜與1 ∶5 000稀釋的HRP標(biāo)記二抗羊抗孵育1 h。TBST漂洗后，ECL顯色，X片曝光、照相。使用凝膠成像分析系統(tǒng)對(duì)顯色條帶進(jìn)行吸光度分析。樣本蛋白的相對(duì)含量=樣本的平均吸光度/內(nèi)參照的平均吸光度，并做統(tǒng)計(jì)分析圖。重復(fù)3次。

1.8 MTT法

轉(zhuǎn)染24 h后，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基制備成2.5×10個(gè)/ml 的細(xì)胞懸液，接種到96孔培養(yǎng)板，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組，每組各設(shè)8孔，每孔100 μl，置于37 ℃、5% CO細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)取出培養(yǎng)板，每孔加入5 mg/ml MTT溶液10 μl繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)后，棄上清液，每孔加150 μl DMSO，充分溶解，自動(dòng)酶標(biāo)讀數(shù)儀490 nm處測(cè)定各孔吸光度(optical density，OD)值。重復(fù)3次。

1.9 流式細(xì)胞術(shù)

細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，0.25%胰蛋白酶消化，使細(xì)胞數(shù)調(diào)整為1×10/ml，取1 ml細(xì)胞1 500 r/min離心10 min，棄上清液，加2 ml PBS，離心棄上清液，加入預(yù)冷的70%乙醇固定細(xì)胞，4 ℃過夜。用PBS洗滌細(xì)胞2遍，取100 μl細(xì)胞懸液，加入50 μg含RNAase的PI染液，避光30 min后用100目的尼龍網(wǎng)過濾，流式細(xì)胞儀記錄激發(fā)波長(zhǎng)在488 nm處紅色熒光檢測(cè)細(xì)胞周期。Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡，將處理好的細(xì)胞置于37 ℃、5% CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，PBS洗滌2遍后離心將細(xì)胞重懸于200 μl結(jié)合緩沖液中，加入10 μl Annexin V-FITC和5 μl PI混勻，避光室溫反應(yīng)15 min，加入300 μl結(jié)合緩沖液，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，重復(fù)3次。

1.10 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)

用胰蛋白酶消化各組細(xì)胞，血清終止后重懸并計(jì)數(shù)，按照每孔1 000個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，37 ℃、5% CO培養(yǎng)于半固培養(yǎng)基中，2周后用結(jié)晶紫染色，觀察細(xì)胞集落數(shù)量和大小的變化。重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 癌組織及癌旁正常組織中TGF-β、PI 3 K-AKT-mTOR信號(hào)通路及凋亡蛋白的表達(dá)

qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，和癌旁正常組織比較，結(jié)直腸癌組織中Glut 1、TGF-β 1、AKT、mTOR、Bcl-2 mRNA和蛋白的表達(dá)上調(diào)(

t

=19.91、42.55、28.96、26.63、17.39，

P

均<0.05)；PTEN、Bax的mRNA和蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)(

t

=54.01、28.21)，p-PI3K、p-S 473-AKT、p-S 389-S6K1和p-T 70-4 EBP1蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)(

t

=23.17、34.81、31.25、27.84)，Cleaved Caspase-3、Cleaved-PARP蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)(

t

=27.62、16.61，

P

均<0.05)，p-T 308-AKT蛋白則差異無顯著意義，見圖1。

2.2 轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)

細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h后，在熒光顯微鏡下可見明顯熒光。計(jì)算視野中NC組的平均轉(zhuǎn)染效率為 (75.2±3.1) %，shGlut 1組的平均轉(zhuǎn)染效率為 (92.5±4.2) %，符合實(shí)驗(yàn)要求，見圖2。

2.3 各組細(xì)胞中中TGF-β、PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路及凋亡蛋白的表達(dá)

qRT-PCR與Western blot結(jié)果顯示，與Control組比較，其余各組細(xì)胞

Glut

1、TGF-β 1、AKT、mTOR、Bcl-2 mRNA(

F

=26.00、26.41、20.57、31.18、27.96)和蛋白(

F

=21.29、22.76、23.97、26.15、37.64)的表達(dá)明顯上調(diào)(

P

均<0.05)，PTEN、Bax的mRNA(

F

=84.94、96.18)和蛋白(

F

=26.87、22.01)的表達(dá)明顯下調(diào)，p-PI3K、p-S 473-AKT、p-S 389-S6K1和p-T 70-4 EBP1蛋白(

F

=62.52、87.08、37.73、34.31)的表達(dá)明顯上調(diào)，Cleaved caspase-3、Cleaved-PARP蛋白(

F

=74.98、104.8)的表達(dá)明顯下調(diào)(

P

均<0.05)，與Blank組和NC組比較，shGlut1-1組Glut 1、TGF-β 1、AKT、mTOR、Bcl-2 mRNA和蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)(

P

均<0.05)，PTEN、Bax的mRNA和蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)，p-PI3K、p-S 473-AKT、p-S 389-S6K1和p-T 70-4 EBP1蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)，Cleaved Caspase-3、Cleaved-PARP蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)(

P

均<0.05)，各組p-T 308 -AKT蛋白則差異無顯著意義，見圖3。

圖1 癌組織和癌旁正常組織相關(guān)mRNA和蛋白表達(dá)水平比較

圖2 熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率 ×200 A:明場(chǎng);B:暗場(chǎng)

圖3 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞中mRNA和蛋白表達(dá)水平比較

2.4 各組細(xì)胞增殖能力變化

MTT結(jié)果表明，與24 h(

F

=0.65)比較，各組細(xì)胞在48、72 h (

F

=24.87、36.66)后細(xì)胞OD值升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

均<0.05)，和Control組比較，其余各組細(xì)胞OD值較高(

P

均<0.05)，與Blank組和NC組比較，shGlut 1組OD值較低(

P

均<0.05)，見圖4。

圖4 各組細(xì)胞增殖能力變化

2.5 各組細(xì)胞周期及凋亡情況

PI單染法顯示：和Control組比較，其余各組細(xì)胞G/G期較少而S期較多(

F

=18.82，

P

均<0.05)；與Blank組和NC組比較，shGlut1組G/G期較多而S期較少，凋亡率較高(

F

=798.8，

P

均<0.05)；各組細(xì)胞G/M期差異無顯著意義，見圖5。和Control組比較，其余各組凋亡率較低 (

P

均<0.05)，與Blank組和NC組比較，shGlut 1組凋亡率較高(

F

=49.39，

P

均<0.05)，見圖6。

圖5 各組細(xì)胞周期檢測(cè)

2.6 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果

和Control組比較其余各組細(xì)胞克隆細(xì)胞形成數(shù)顯著較多(

F

=77.91，

P

均<0.05)，Blank組和NC組克隆細(xì)胞形成數(shù)差異無顯著意義；與Blank組和NC組比較，shGlut 1組克隆形成數(shù)明顯小于Blank組和NC組，腫瘤增長(zhǎng)速度最慢，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

均<0.05)，見圖7。

3 討論

惡性腫瘤的高消耗、高代謝病理特征客觀上要求攝取較普通細(xì)胞成倍的能量，但在正常情況下，葡萄糖無法獨(dú)立通過細(xì)胞膜的雙分子層結(jié)構(gòu)，必須依賴跨膜分布的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白作為載體，因而這類載體的活性及表達(dá)量對(duì)腫瘤細(xì)胞的惡性增殖具有非常重要的意義。

Glut

1是葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白最重要的成員，內(nèi)含492個(gè)氨基酸，由12個(gè)疏水性的跨膜α螺旋結(jié)構(gòu)域、2個(gè)電荷的膜內(nèi)區(qū)及膜外區(qū)構(gòu)成，這即是其轉(zhuǎn)運(yùn)的基礎(chǔ)框架。Zhao et al通過臨床薈萃分析證實(shí)高表達(dá)

Glut

1可作為諸多癌癥一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)，可用于監(jiān)測(cè)癌患者的生存預(yù)后情況；Kurahara et al證實(shí)在胰腺導(dǎo)管癌組織中

Glut

1表達(dá)明顯上調(diào)，且

Glut

1表達(dá)水平越高的患者預(yù)后越差；Seleit et al報(bào)道

Glut

1在非黑色素瘤皮膚癌中高表達(dá)，考慮為該病變的潛在風(fēng)險(xiǎn)因子。但

Glut

1在結(jié)直腸癌中的研究較少，其致癌機(jī)制尚不明確，基于此，本研究通過TGF-β/PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路探究

Glut

1基因?qū)Y(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行徑的影響。

圖6 各組細(xì)胞凋亡率檢測(cè)

圖7 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)

本研究通過qRT-PCR法和Western blot法檢測(cè)表明，與Control組比較，結(jié)直腸癌組織中Glut1、TGF-β1、PI3K、AKT、mTOR、Bcl- 2 mRNA和蛋白的表達(dá)上調(diào)，差異顯著，因而證實(shí)

Glut

1表達(dá)升高滿足了結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)能量的大幅度需求，促進(jìn)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。Yang et al納入2 077例結(jié)直腸癌患者行Meta分析證實(shí)

Glut

1的表達(dá)與結(jié)直腸癌的總生存期和無病生存期相關(guān)，同時(shí)也是結(jié)直腸癌的侵襲性臨床特征的指標(biāo)，本研究結(jié)果與之一致。

既往研究表明PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。由于上游致癌基因(PI3K，AKT)的激活和(或)腫瘤抑制因子(PTEN，LKB1)的失活，諸多惡性腫瘤中均檢測(cè)到mTORC 1活性升高，而作為PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的下游效應(yīng)因子，mTOR調(diào)節(jié)結(jié)腸直腸癌的腫瘤發(fā)生，因而考慮抑制PI3K-AKT-mTOR信號(hào)傳導(dǎo)過程可能拮抗結(jié)直腸癌的進(jìn)一步發(fā)展。TGF-β隨著多細(xì)胞生物體的進(jìn)化而出現(xiàn)，在胚胎發(fā)生中起關(guān)鍵作用，對(duì)于組織穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。據(jù)報(bào)道，TGF-β可通過激活PI 3K-Akt-mTOR信號(hào)通路介導(dǎo)對(duì)葡萄糖的反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示shGlut 1組較NC組和Blank組Glut 1-AKT-mTOR和TGF-β 1的mRNA和蛋白表達(dá)均明顯下降；且shGlut 1組結(jié)腸直腸癌細(xì)胞增殖能力顯著下降，而細(xì)胞凋亡增加，從而證實(shí)Glut 1表達(dá)降低/沉默通過抑制TGF-β-PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路來抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。