• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    Glut 1基因沉默對(duì)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞株增殖、分化及凋亡的影響及機(jī)制研究

    2021-06-02 08:54:44郭圣超武雪亮孫光源楊東東
    關(guān)鍵詞:直腸癌培養(yǎng)基通路

    郭圣超,武雪亮,薛 軍,韓 磊,孫光源,楊東東,屈 明

    葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在向代謝活性細(xì)胞提供能量的過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用,葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1(glucose transporter-1,

    Glut

    1)在真核生物和原核生物中均有發(fā)現(xiàn),其表達(dá)升高或激活已被證明是諸多惡性腫瘤發(fā)生的主要原因。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor,TGF)-β是與腫瘤發(fā)生、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移調(diào)控密切相關(guān)的分泌型配體。TGF-β信號(hào)通路在控制細(xì)胞增殖和結(jié)腸直腸癌的分化中具有重要作用?,F(xiàn)已證實(shí)磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶標(biāo)(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B/mammalian target of rapamycin,PI3K-AKTmTOR)信號(hào)通路與細(xì)胞凋亡、增殖、血管生成和轉(zhuǎn)移密切相關(guān),也是導(dǎo)致結(jié)直腸癌變的重要機(jī)制。因此,該研究旨在探討

    Glut

    1基因沉默介導(dǎo)的TGF-β/PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路對(duì)結(jié)腸直腸癌細(xì)胞的作用,為結(jié)直腸癌的靶向診療提供科學(xué)參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與主要試劑

    人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29細(xì)胞(上海生物工程研究所);10%胎牛血清RPMI 1640、DMEM(美國(guó)Gibco公司);siRNA干擾序列(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司),載體pSIREN(北京華奧正生科技有限公司),Lipofectamine 2000(美國(guó)Invitrogen公司),DAPI(上海碧云天生物技術(shù)有限公司),TRIzol試劑 (美國(guó)Invitrogen公司),PrimeScriptTM RT reagent Kit (北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司),引物(北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司),BCA檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司),酶抑制劑(北京嘉美紐諾生物科技有限公司),MTT溶液(美國(guó)Sigma-aldrich公司)、PI染液(上海前塵生物科技有限公司)。

    1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

    將H-29細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中,以1×10個(gè)/孔的密度將細(xì)胞分種于6孔培養(yǎng)板,并置于37 ℃、5% CO及飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)。

    1.3 構(gòu)建質(zhì)粒

    siRNA序列設(shè)計(jì)根據(jù)Genbank中的Glut 1的mRNA全序列(005983)從Glut 1編碼區(qū)中尋找符合設(shè)計(jì)原則的靶序列,通過BLAST軟件確定與其他非相關(guān)基因無同源性,按照Pg-PU 6/Neo載體的要求設(shè)計(jì)能編碼siRNA的寡核苷酸鏈 (正:5′-CACCGGGAGTGACAAAGACTTTGTTCAAG CA-3′;反:5′-GATCCAAAAAAGGGAGTGACAAAGA CTTCTC-3′),對(duì)所有的寡核苷酸片段進(jìn)行合成。

    1.4 細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染

    選對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,接種于6孔板,每孔5×10個(gè)細(xì)胞,給予新鮮完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至細(xì)胞融合度接近50%~80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。依據(jù)Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染,將細(xì)胞分為3組:Blank組(人結(jié)腸癌HT 29細(xì)胞)、NC組(轉(zhuǎn)染非干擾序列的HT-29細(xì)胞)和shGlut 1組(轉(zhuǎn)染siRNA序列的HT-29細(xì)胞)組。lipo溶液:240 μl無血清培養(yǎng)基+10 μl lipo溶液,總體積250 μl,溫育5 min。質(zhì)粒溶液:20 μl無血清培養(yǎng)基+4 μg質(zhì)粒總體積24 μl。分別將lipo溶液和質(zhì)粒溶液混合,室溫下放置20 min,混合液逐滴加入孔中,搖動(dòng)培養(yǎng)板,輕輕混勻。在37 ℃,5%CO中保溫,5~6 h后,換完全培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24~48 h,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    1.5 免疫熒光法

    將細(xì)胞接種于6孔板中,加入2 ml完全培養(yǎng)基,置CO孵箱中37 ℃培養(yǎng)過夜。待細(xì)胞長(zhǎng)到50%~ 80%時(shí),在滅菌的離心管中配制如下溶液。溶液A:將4 μg待轉(zhuǎn)染的純DNA稀釋到250 ml無血清培養(yǎng)基中,靜置5 min;溶液B:將2~25 ml LipofectAMINE稀釋到250 ml無血清培養(yǎng)基中,靜置5 min?;旌先芤篈和B,室溫放置15~45 min。用2 ml無血清培養(yǎng)基洗凈細(xì)胞,加入0.8 ml無血清培養(yǎng)基/孔,將脂質(zhì)體復(fù)合物滴加在孔中混勻,置CO孵箱中37 ℃孵育20~24 h。DAPI避光孵育30 min。用完全培養(yǎng)基替換轉(zhuǎn)染液,繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后在熒光顯微鏡下觀察蛋白表達(dá)情況,取2個(gè)表達(dá)區(qū)域保存,取均值,轉(zhuǎn)染效率=轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)目/總細(xì)胞數(shù)目。

    1.6 qRT-PCR法

    取結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織各30 mg,加入1 ml的TRIzol試劑,在冰浴中粉碎,提取組織中總RNA,采用紫外分光光度法檢測(cè)RNA的純度及濃度,將純度為A260/280=1.8~2.0的所有樣品濃度調(diào)整為0.1 ng/μl,用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptRT reagent Ki將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA (50 ng/μl),逆轉(zhuǎn)錄體系10 μl,參照說明書進(jìn)行,設(shè)定反應(yīng)條件為:37 ℃、15 min × 3次 (逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng))、85 ℃、5 s (逆轉(zhuǎn)錄酶失活反應(yīng))、-80 ℃凍存、備用。通過Premier 5.0 軟件自行設(shè)計(jì)引物,按兩步法在ABI 7900 HT實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行,以GAPDH為內(nèi)參照。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性5 s;58 ℃退火30 s;72 ℃延伸15 s;40個(gè)循環(huán)。采用2法計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)水平,每個(gè)樣品的每個(gè)基因設(shè)3個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.7 Western blot法

    取組織樣品30 g,檢測(cè)總蛋白濃度。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,以3 000 r/min、4 ℃離心20 min,棄上清液,估計(jì)細(xì)胞壓積(packed cell volume,PCV),按每20 μl細(xì)胞壓積加入裂解液100 μl和酶抑制劑1 μl的比例冰上裂解30 min,低溫12 000 r/min離心10 min,取上清液蛋白定量檢測(cè)。取50 μg蛋白溶于2×SDS上樣緩沖液中,將樣本100 ℃煮沸5 min后,將上述各樣品經(jīng)質(zhì)量濃度10% SDS-PAGE凝膠,轉(zhuǎn)移至PVDF膜,用質(zhì)量濃度5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,孵育兔抗人一抗 (

    Glut

    1:1 ∶1 000、TGF-β 1:1 ∶1 000、PI3K:1 ∶2 000、AKT:1 ∶500、p-PI3K:1 ∶800、p-S 308-AKT:1 ∶1 000、p-S 473-AKT:1 ∶1 000、p-T 389-S6K1:1 ∶500、p-T 70-4 EBP1:1 ∶500、PTEN:1 ∶600、mTOR:1 ∶500、Bax:1 ∶800、Bcl-2:1 ∶1 000、Cleaved Caspase-3:1 ∶1 000、Cleaved-PARP:1 ∶1 000),用TBST洗3遍后將膜與1 ∶5 000稀釋的HRP標(biāo)記二抗羊抗孵育1 h。TBST漂洗后,ECL顯色,X片曝光、照相。使用凝膠成像分析系統(tǒng)對(duì)顯色條帶進(jìn)行吸光度分析。樣本蛋白的相對(duì)含量=樣本的平均吸光度/內(nèi)參照的平均吸光度,并做統(tǒng)計(jì)分析圖。重復(fù)3次。

    1.8 MTT法

    轉(zhuǎn)染24 h后,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基制備成2.5×10個(gè)/ml 的細(xì)胞懸液,接種到96孔培養(yǎng)板,根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組,每組各設(shè)8孔,每孔100 μl,置于37 ℃、5% CO細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),分別于培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)取出培養(yǎng)板,每孔加入5 mg/ml MTT溶液10 μl繼續(xù)培養(yǎng)4 h,終止培養(yǎng)后,棄上清液,每孔加150 μl DMSO,充分溶解,自動(dòng)酶標(biāo)讀數(shù)儀490 nm處測(cè)定各孔吸光度(optical density,OD)值。重復(fù)3次。

    1.9 流式細(xì)胞術(shù)

    細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后,0.25%胰蛋白酶消化,使細(xì)胞數(shù)調(diào)整為1×10/ml,取1 ml細(xì)胞1 500 r/min離心10 min,棄上清液,加2 ml PBS,離心棄上清液,加入預(yù)冷的70%乙醇固定細(xì)胞,4 ℃過夜。用PBS洗滌細(xì)胞2遍,取100 μl細(xì)胞懸液,加入50 μg含RNAase的PI染液,避光30 min后用100目的尼龍網(wǎng)過濾,流式細(xì)胞儀記錄激發(fā)波長(zhǎng)在488 nm處紅色熒光檢測(cè)細(xì)胞周期。Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡,將處理好的細(xì)胞置于37 ℃、5% CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,收集細(xì)胞,PBS洗滌2遍后離心將細(xì)胞重懸于200 μl結(jié)合緩沖液中,加入10 μl Annexin V-FITC和5 μl PI混勻,避光室溫反應(yīng)15 min,加入300 μl結(jié)合緩沖液,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況,重復(fù)3次。

    1.10 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)

    用胰蛋白酶消化各組細(xì)胞,血清終止后重懸并計(jì)數(shù),按照每孔1 000個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中,37 ℃、5% CO培養(yǎng)于半固培養(yǎng)基中,2周后用結(jié)晶紫染色,觀察細(xì)胞集落數(shù)量和大小的變化。重復(fù)3次。

    2 結(jié)果

    2.1 癌組織及癌旁正常組織中TGF-β、PI 3 K-AKT-mTOR信號(hào)通路及凋亡蛋白的表達(dá)

    qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示,和癌旁正常組織比較,結(jié)直腸癌組織中Glut 1、TGF-β 1、AKT、mTOR、Bcl-2 mRNA和蛋白的表達(dá)上調(diào)(

    t

    =19.91、42.55、28.96、26.63、17.39,

    P

    均<0.05);PTEN、Bax的mRNA和蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)(

    t

    =54.01、28.21),p-PI3K、p-S 473-AKT、p-S 389-S6K1和p-T 70-4 EBP1蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)(

    t

    =23.17、34.81、31.25、27.84),Cleaved Caspase-3、Cleaved-PARP蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)(

    t

    =27.62、16.61,

    P

    均<0.05),p-T 308-AKT蛋白則差異無顯著意義,見圖1。

    2.2 轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)

    細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h后,在熒光顯微鏡下可見明顯熒光。計(jì)算視野中NC組的平均轉(zhuǎn)染效率為 (75.2±3.1) %,shGlut 1組的平均轉(zhuǎn)染效率為 (92.5±4.2) %,符合實(shí)驗(yàn)要求,見圖2。

    2.3 各組細(xì)胞中中TGF-β、PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路及凋亡蛋白的表達(dá)

    qRT-PCR與Western blot結(jié)果顯示,與Control組比較,其余各組細(xì)胞

    Glut

    1、TGF-β 1、AKT、mTOR、Bcl-2 mRNA(

    F

    =26.00、26.41、20.57、31.18、27.96)和蛋白(

    F

    =21.29、22.76、23.97、26.15、37.64)的表達(dá)明顯上調(diào)(

    P

    均<0.05),PTEN、Bax的mRNA(

    F

    =84.94、96.18)和蛋白(

    F

    =26.87、22.01)的表達(dá)明顯下調(diào),p-PI3K、p-S 473-AKT、p-S 389-S6K1和p-T 70-4 EBP1蛋白(

    F

    =62.52、87.08、37.73、34.31)的表達(dá)明顯上調(diào),Cleaved caspase-3、Cleaved-PARP蛋白(

    F

    =74.98、104.8)的表達(dá)明顯下調(diào)(

    P

    均<0.05),與Blank組和NC組比較,shGlut1-1組Glut 1、TGF-β 1、AKT、mTOR、Bcl-2 mRNA和蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)(

    P

    均<0.05),PTEN、Bax的mRNA和蛋白的表達(dá)明顯上調(diào),p-PI3K、p-S 473-AKT、p-S 389-S6K1和p-T 70-4 EBP1蛋白的表達(dá)明顯下調(diào),Cleaved Caspase-3、Cleaved-PARP蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)(

    P

    均<0.05),各組p-T 308 -AKT蛋白則差異無顯著意義,見圖3。

    圖1 癌組織和癌旁正常組織相關(guān)mRNA和蛋白表達(dá)水平比較

    圖2 熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率 ×200 A:明場(chǎng);B:暗場(chǎng)

    圖3 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞中mRNA和蛋白表達(dá)水平比較

    2.4 各組細(xì)胞增殖能力變化

    MTT結(jié)果表明,與24 h(

    F

    =0.65)比較,各組細(xì)胞在48、72 h (

    F

    =24.87、36.66)后細(xì)胞OD值升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

    P

    均<0.05),和Control組比較,其余各組細(xì)胞OD值較高(

    P

    均<0.05),與Blank組和NC組比較,shGlut 1組OD值較低(

    P

    均<0.05),見圖4。

    圖4 各組細(xì)胞增殖能力變化

    2.5 各組細(xì)胞周期及凋亡情況

    PI單染法顯示:和Control組比較,其余各組細(xì)胞G/G期較少而S期較多(

    F

    =18.82,

    P

    均<0.05);與Blank組和NC組比較,shGlut1組G/G期較多而S期較少,凋亡率較高(

    F

    =798.8,

    P

    均<0.05);各組細(xì)胞G/M期差異無顯著意義,見圖5。和Control組比較,其余各組凋亡率較低 (

    P

    均<0.05),與Blank組和NC組比較,shGlut 1組凋亡率較高(

    F

    =49.39,

    P

    均<0.05),見圖6。

    圖5 各組細(xì)胞周期檢測(cè)

    2.6 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    和Control組比較其余各組細(xì)胞克隆細(xì)胞形成數(shù)顯著較多(

    F

    =77.91,

    P

    均<0.05),Blank組和NC組克隆細(xì)胞形成數(shù)差異無顯著意義;與Blank組和NC組比較,shGlut 1組克隆形成數(shù)明顯小于Blank組和NC組,腫瘤增長(zhǎng)速度最慢,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

    P

    均<0.05),見圖7。

    3 討論

    惡性腫瘤的高消耗、高代謝病理特征客觀上要求攝取較普通細(xì)胞成倍的能量,但在正常情況下,葡萄糖無法獨(dú)立通過細(xì)胞膜的雙分子層結(jié)構(gòu),必須依賴跨膜分布的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白作為載體,因而這類載體的活性及表達(dá)量對(duì)腫瘤細(xì)胞的惡性增殖具有非常重要的意義。

    Glut

    1是葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白最重要的成員,內(nèi)含492個(gè)氨基酸,由12個(gè)疏水性的跨膜α螺旋結(jié)構(gòu)域、2個(gè)電荷的膜內(nèi)區(qū)及膜外區(qū)構(gòu)成,這即是其轉(zhuǎn)運(yùn)的基礎(chǔ)框架。Zhao et al通過臨床薈萃分析證實(shí)高表達(dá)

    Glut

    1可作為諸多癌癥一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo),可用于監(jiān)測(cè)癌患者的生存預(yù)后情況;Kurahara et al證實(shí)在胰腺導(dǎo)管癌組織中

    Glut

    1表達(dá)明顯上調(diào),且

    Glut

    1表達(dá)水平越高的患者預(yù)后越差;Seleit et al報(bào)道

    Glut

    1在非黑色素瘤皮膚癌中高表達(dá),考慮為該病變的潛在風(fēng)險(xiǎn)因子。但

    Glut

    1在結(jié)直腸癌中的研究較少,其致癌機(jī)制尚不明確,基于此,本研究通過TGF-β/PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路探究

    Glut

    1基因?qū)Y(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行徑的影響。

    圖6 各組細(xì)胞凋亡率檢測(cè)

    圖7 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)

    本研究通過qRT-PCR法和Western blot法檢測(cè)表明,與Control組比較,結(jié)直腸癌組織中Glut1、TGF-β1、PI3K、AKT、mTOR、Bcl- 2 mRNA和蛋白的表達(dá)上調(diào),差異顯著,因而證實(shí)

    Glut

    1表達(dá)升高滿足了結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)能量的大幅度需求,促進(jìn)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。Yang et al納入2 077例結(jié)直腸癌患者行Meta分析證實(shí)

    Glut

    1的表達(dá)與結(jié)直腸癌的總生存期和無病生存期相關(guān),同時(shí)也是結(jié)直腸癌的侵襲性臨床特征的指標(biāo),本研究結(jié)果與之一致。

    既往研究表明PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。由于上游致癌基因(PI3K,AKT)的激活和(或)腫瘤抑制因子(PTEN,LKB1)的失活,諸多惡性腫瘤中均檢測(cè)到mTORC 1活性升高,而作為PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的下游效應(yīng)因子,mTOR調(diào)節(jié)結(jié)腸直腸癌的腫瘤發(fā)生,因而考慮抑制PI3K-AKT-mTOR信號(hào)傳導(dǎo)過程可能拮抗結(jié)直腸癌的進(jìn)一步發(fā)展。TGF-β隨著多細(xì)胞生物體的進(jìn)化而出現(xiàn),在胚胎發(fā)生中起關(guān)鍵作用,對(duì)于組織穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。據(jù)報(bào)道,TGF-β可通過激活PI 3K-Akt-mTOR信號(hào)通路介導(dǎo)對(duì)葡萄糖的反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示shGlut 1組較NC組和Blank組Glut 1-AKT-mTOR和TGF-β 1的mRNA和蛋白表達(dá)均明顯下降;且shGlut 1組結(jié)腸直腸癌細(xì)胞增殖能力顯著下降,而細(xì)胞凋亡增加,從而證實(shí)Glut 1表達(dá)降低/沉默通過抑制TGF-β-PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路來抑制細(xì)胞生長(zhǎng),促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

    猜你喜歡
    直腸癌培養(yǎng)基通路
    腹腔鏡下直腸癌前側(cè)切除術(shù)治療直腸癌的效果觀察
    蛹蟲草液體發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選
    各種培養(yǎng)基制作應(yīng)注意的幾個(gè)事項(xiàng)
    直腸癌術(shù)前放療的研究進(jìn)展
    COXⅠ和COX Ⅲ在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及其臨床意義
    KBM581培養(yǎng)基:人T細(xì)胞誘導(dǎo)與擴(kuò)增培養(yǎng)基應(yīng)用指南
    Kisspeptin/GPR54信號(hào)通路促使性早熟形成的作用觀察
    proBDNF-p75NTR通路抑制C6細(xì)胞增殖
    GRP及GRPR在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及意義
    通路快建林翰:對(duì)重模式應(yīng)有再認(rèn)識(shí)
    男女下面进入的视频免费午夜| 国产精品一区二区免费欧美| 1024手机看黄色片| 欧美高清性xxxxhd video| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 日本熟妇午夜| 99国产极品粉嫩在线观看| 国产欧美日韩精品亚洲av| www.www免费av| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 亚洲国产精品合色在线| 国产真实伦视频高清在线观看 | 又黄又爽又免费观看的视频| 少妇人妻一区二区三区视频| 极品教师在线免费播放| 国产中年淑女户外野战色| 淫妇啪啪啪对白视频| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 欧美性感艳星| 国产日本99.免费观看| 免费一级毛片在线播放高清视频| 免费观看在线日韩| 国产免费av片在线观看野外av| 丝袜美腿在线中文| 欧美极品一区二区三区四区| 国产免费男女视频| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 一级黄色大片毛片| 久久亚洲精品不卡| 天天躁日日操中文字幕| 校园春色视频在线观看| 黄色配什么色好看| 亚洲精品成人久久久久久| 18禁在线播放成人免费| 国内精品久久久久久久电影| 久久久久久久久中文| 国产爱豆传媒在线观看| 亚洲精品粉嫩美女一区| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 国产在视频线在精品| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 精品久久久久久久久亚洲 | 亚洲成人免费电影在线观看| 久久久久久伊人网av| 嫩草影院入口| 久久久久久久久久久丰满 | 日本a在线网址| 久久久国产成人精品二区| 亚洲性久久影院| 2021天堂中文幕一二区在线观| 色哟哟·www| 亚洲四区av| 成人美女网站在线观看视频| 我的老师免费观看完整版| 波多野结衣高清作品| 亚洲四区av| 欧美一级a爱片免费观看看| 日本黄色视频三级网站网址| 国产成年人精品一区二区| 亚洲四区av| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| av.在线天堂| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 性色avwww在线观看| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 精品不卡国产一区二区三区| 97超视频在线观看视频| 精品欧美国产一区二区三| 精品久久久噜噜| 精品一区二区三区人妻视频| 国产黄a三级三级三级人| av女优亚洲男人天堂| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 国产精品一区二区性色av| 久久人人爽人人爽人人片va| 亚洲成人久久爱视频| 中文字幕高清在线视频| 成人特级黄色片久久久久久久| 色吧在线观看| 国产亚洲av嫩草精品影院| 国产在线精品亚洲第一网站| 免费在线观看影片大全网站| 国产成年人精品一区二区| 久9热在线精品视频| 可以在线观看毛片的网站| 亚洲 国产 在线| 国产精品爽爽va在线观看网站| 国产视频内射| 欧美+日韩+精品| 精华霜和精华液先用哪个| 亚洲国产精品成人综合色| 内地一区二区视频在线| 全区人妻精品视频| 长腿黑丝高跟| 在线免费观看不下载黄p国产 | 天天躁日日操中文字幕| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 欧美日韩黄片免| 麻豆国产97在线/欧美| 热99re8久久精品国产| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 亚洲精品一区av在线观看| 日本爱情动作片www.在线观看 | 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 我的女老师完整版在线观看| 99在线视频只有这里精品首页| 真人做人爱边吃奶动态| 久久欧美精品欧美久久欧美| 日本a在线网址| 日本在线视频免费播放| 色哟哟哟哟哟哟| 成年女人永久免费观看视频| 欧美色欧美亚洲另类二区| 国产成人一区二区在线| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 久久久久久久久久久丰满 | 一边摸一边抽搐一进一小说| 午夜精品一区二区三区免费看| 日韩欧美 国产精品| 亚洲无线在线观看| 老司机午夜福利在线观看视频| 成年版毛片免费区| 亚洲av免费在线观看| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 国产精品亚洲美女久久久| 久久精品国产自在天天线| 性色avwww在线观看| 免费在线观看日本一区| av在线观看视频网站免费| 国产高清有码在线观看视频| 国产色爽女视频免费观看| 日韩欧美 国产精品| 偷拍熟女少妇极品色| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 1000部很黄的大片| 欧美性感艳星| 亚洲第一电影网av| 日韩欧美 国产精品| 深爱激情五月婷婷| 亚洲国产精品久久男人天堂| 成人av一区二区三区在线看| 亚洲av一区综合| 国产久久久一区二区三区| 日本黄色视频三级网站网址| or卡值多少钱| 免费黄网站久久成人精品| 小说图片视频综合网站| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 国产精品伦人一区二区| 女同久久另类99精品国产91| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 男人狂女人下面高潮的视频| 国产熟女欧美一区二区| a级毛片a级免费在线| 亚洲av不卡在线观看| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 亚洲精品456在线播放app | 一级黄片播放器| 又黄又爽又免费观看的视频| 久久人人爽人人爽人人片va| 91精品国产九色| 国产视频一区二区在线看| 国国产精品蜜臀av免费| 女的被弄到高潮叫床怎么办 | 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 一个人看视频在线观看www免费| 久久99热这里只有精品18| 久久久国产成人免费| 久久久久免费精品人妻一区二区| www.色视频.com| 在线免费十八禁| 国产精品乱码一区二三区的特点| 亚洲18禁久久av| 两人在一起打扑克的视频| 黄色日韩在线| 色综合站精品国产| 欧美3d第一页| 日韩在线高清观看一区二区三区 | www.www免费av| 亚洲人成网站在线播| 国产极品精品免费视频能看的| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 国产精品av视频在线免费观看| 久久久色成人| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 亚洲18禁久久av| 性欧美人与动物交配| 在线天堂最新版资源| 我要看日韩黄色一级片| 一本精品99久久精品77| 人人妻人人澡欧美一区二区| a在线观看视频网站| 欧美高清成人免费视频www| 草草在线视频免费看| 国产淫片久久久久久久久| 国产探花极品一区二区| 天堂动漫精品| 精品午夜福利视频在线观看一区| 不卡一级毛片| 两个人视频免费观看高清| 成人综合一区亚洲| av国产免费在线观看| 国产精华一区二区三区| 特级一级黄色大片| 精品午夜福利在线看| 性欧美人与动物交配| 国产极品精品免费视频能看的| 一个人免费在线观看电影| 观看免费一级毛片| 国产精品无大码| 国产精华一区二区三区| 亚洲欧美日韩东京热| 天堂动漫精品| 免费黄网站久久成人精品| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 岛国在线免费视频观看| 欧美最黄视频在线播放免费| 成人国产麻豆网| 亚洲一区二区三区色噜噜| 十八禁网站免费在线| 亚洲成人久久爱视频| 精品一区二区三区av网在线观看| 国产黄片美女视频| 一区福利在线观看| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 日韩一本色道免费dvd| 国产精品日韩av在线免费观看| 国产成人av教育| 免费av观看视频| 国产av在哪里看| 超碰av人人做人人爽久久| 国产69精品久久久久777片| 国产成人一区二区在线| 在线观看一区二区三区| 99热6这里只有精品| 又紧又爽又黄一区二区| 搡老妇女老女人老熟妇| 国产av麻豆久久久久久久| 久久99热这里只有精品18| 久久精品国产亚洲网站| 国产视频一区二区在线看| 日本免费a在线| 联通29元200g的流量卡| 黄色女人牲交| 最新在线观看一区二区三区| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| aaaaa片日本免费| 一区二区三区激情视频| 69av精品久久久久久| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 国产91精品成人一区二区三区| 美女高潮的动态| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 夜夜爽天天搞| 亚洲,欧美,日韩| 国产av不卡久久| 国产av一区在线观看免费| 色在线成人网| 久99久视频精品免费| 欧美日韩综合久久久久久 | 国产精品野战在线观看| 99热只有精品国产| 国产久久久一区二区三区| 国产三级在线视频| 乱系列少妇在线播放| 精品不卡国产一区二区三区| 99国产精品一区二区蜜桃av| 国产精品不卡视频一区二区| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 久久精品国产鲁丝片午夜精品 | 老师上课跳d突然被开到最大视频| 午夜福利在线在线| 精品人妻熟女av久视频| 999久久久精品免费观看国产| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 91在线观看av| 亚洲内射少妇av| 国产av一区在线观看免费| 日本色播在线视频| 午夜激情欧美在线| 免费在线观看影片大全网站| 免费观看的影片在线观看| 搞女人的毛片| 他把我摸到了高潮在线观看| 黄色视频,在线免费观看| 国内揄拍国产精品人妻在线| 亚洲最大成人av| 国产中年淑女户外野战色| 欧美日韩国产亚洲二区| 精品国产三级普通话版| 春色校园在线视频观看| 午夜视频国产福利| 美女大奶头视频| 精品久久久久久久末码| 亚洲在线自拍视频| 国国产精品蜜臀av免费| 国产男人的电影天堂91| 别揉我奶头 嗯啊视频| 精品久久久久久,| 可以在线观看的亚洲视频| 国产精品98久久久久久宅男小说| 日日干狠狠操夜夜爽| 在线观看舔阴道视频| 亚洲精品粉嫩美女一区| 联通29元200g的流量卡| 亚洲18禁久久av| 亚洲天堂国产精品一区在线| www.色视频.com| 欧美另类亚洲清纯唯美| 少妇人妻一区二区三区视频| 亚洲欧美激情综合另类| 亚洲av中文av极速乱 | 国语自产精品视频在线第100页| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 日韩一区二区视频免费看| 精品午夜福利在线看| 中文在线观看免费www的网站| 五月伊人婷婷丁香| 91麻豆av在线| 日本色播在线视频| 免费看日本二区| 精品人妻1区二区| 国产真实乱freesex| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 色在线成人网| 亚洲一区高清亚洲精品| av中文乱码字幕在线| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 91久久精品电影网| 最近在线观看免费完整版| 日韩中文字幕欧美一区二区| 嫁个100分男人电影在线观看| 国产精品1区2区在线观看.| 两个人视频免费观看高清| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 日本爱情动作片www.在线观看 | 亚洲精品成人久久久久久| 成人二区视频| 久久国产乱子免费精品| 久久久国产成人精品二区| 2021天堂中文幕一二区在线观| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 国产一区二区在线av高清观看| 日本一本二区三区精品| 97超视频在线观看视频| 淫妇啪啪啪对白视频| 88av欧美| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 国产私拍福利视频在线观看| 中文在线观看免费www的网站| www.色视频.com| 99久久成人亚洲精品观看| 亚洲成人精品中文字幕电影| 毛片女人毛片| 黄色配什么色好看| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 69av精品久久久久久| 精品久久久久久久久久免费视频| 亚洲电影在线观看av| 制服丝袜大香蕉在线| 欧美最黄视频在线播放免费| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 在线看三级毛片| 日本-黄色视频高清免费观看| 免费人成视频x8x8入口观看| 国产亚洲精品av在线| 国产精品免费一区二区三区在线| 麻豆成人午夜福利视频| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 日日干狠狠操夜夜爽| 国产精品不卡视频一区二区| 变态另类丝袜制服| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 亚洲国产精品sss在线观看| 亚洲精品久久国产高清桃花| 欧美日本视频| 亚洲av成人av| 国产高清三级在线| 久久精品国产清高在天天线| 亚洲久久久久久中文字幕| av在线观看视频网站免费| 国产精品一区www在线观看 | 亚洲成人中文字幕在线播放| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 国产乱人伦免费视频| 99热只有精品国产| 久久草成人影院| 久久热精品热| 一区二区三区四区激情视频 | 国产精品女同一区二区软件 | 亚洲精品色激情综合| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 国产免费一级a男人的天堂| 啪啪无遮挡十八禁网站| 欧美高清成人免费视频www| 88av欧美| 九九爱精品视频在线观看| 婷婷精品国产亚洲av在线| 国产精华一区二区三区| 少妇高潮的动态图| 欧美性猛交黑人性爽| 99久久成人亚洲精品观看| 一级a爱片免费观看的视频| 久久久国产成人免费| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 亚洲欧美日韩高清专用| 男女啪啪激烈高潮av片| 欧美3d第一页| 草草在线视频免费看| 国产综合懂色| 亚洲内射少妇av| 国产精品人妻久久久久久| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 看十八女毛片水多多多| 国产精华一区二区三区| 又粗又爽又猛毛片免费看| 亚洲人与动物交配视频| 亚洲电影在线观看av| 欧美黑人巨大hd| 日韩高清综合在线| 久久国产精品人妻蜜桃| 成人国产一区最新在线观看| 3wmmmm亚洲av在线观看| 真人一进一出gif抽搐免费| 看免费成人av毛片| 国产精品精品国产色婷婷| 成人一区二区视频在线观看| 日日撸夜夜添| 国产久久久一区二区三区| 欧美一区二区精品小视频在线| 久9热在线精品视频| 波多野结衣高清无吗| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 久久久久久久久大av| 联通29元200g的流量卡| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 亚洲四区av| 日韩精品青青久久久久久| 美女高潮的动态| 久久亚洲精品不卡| 国产探花在线观看一区二区| 国产精品女同一区二区软件 | 日本a在线网址| 在线a可以看的网站| 日本欧美国产在线视频| 日日啪夜夜撸| 亚洲不卡免费看| 日韩欧美三级三区| 亚洲成av人片在线播放无| 日本爱情动作片www.在线观看 | 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 可以在线观看毛片的网站| 免费大片18禁| av天堂中文字幕网| 亚洲欧美日韩高清专用| 亚洲成人精品中文字幕电影| 亚洲天堂国产精品一区在线| 欧美黑人欧美精品刺激| 男女那种视频在线观看| 99热只有精品国产| 国产亚洲精品av在线| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 在线播放无遮挡| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 黄色日韩在线| 国产成人aa在线观看| 国产 一区精品| 色尼玛亚洲综合影院| 国产av不卡久久| 国产成人一区二区在线| 性色avwww在线观看| 男女啪啪激烈高潮av片| 99热这里只有精品一区| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 搡老熟女国产l中国老女人| 最近最新免费中文字幕在线| 亚洲专区中文字幕在线| 99热这里只有精品一区| 精品久久久久久久久av| 黄色配什么色好看| 99在线视频只有这里精品首页| 午夜福利18| 亚洲第一电影网av| 久久久久久大精品| 亚洲经典国产精华液单| bbb黄色大片| 男人舔女人下体高潮全视频| 成人一区二区视频在线观看| av视频在线观看入口| 欧美日韩黄片免| 欧美3d第一页| 深夜精品福利| 欧美+日韩+精品| 亚洲欧美清纯卡通| 午夜影院日韩av| av黄色大香蕉| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 小说图片视频综合网站| 久久精品国产亚洲网站| 久久久久久伊人网av| 波多野结衣巨乳人妻| 免费搜索国产男女视频| 老熟妇仑乱视频hdxx| 成人亚洲精品av一区二区| 国产高清视频在线观看网站| 伊人久久精品亚洲午夜| 1024手机看黄色片| 3wmmmm亚洲av在线观看| 可以在线观看毛片的网站| 欧美激情在线99| 12—13女人毛片做爰片一| 亚洲欧美精品综合久久99| 欧美精品国产亚洲| 亚洲国产精品合色在线| 午夜爱爱视频在线播放| 日韩精品有码人妻一区| 真人做人爱边吃奶动态| 亚洲精品影视一区二区三区av| 91久久精品电影网| 免费黄网站久久成人精品| 国产精品日韩av在线免费观看| 亚洲色图av天堂| 国产美女午夜福利| 国产免费av片在线观看野外av| 色综合婷婷激情| 亚洲精品久久国产高清桃花| 国产三级在线视频| 亚洲在线自拍视频| 精品国产三级普通话版| 中文字幕高清在线视频| 午夜老司机福利剧场| 日本五十路高清| 中文在线观看免费www的网站| 日韩强制内射视频| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 日本黄色片子视频| 天堂动漫精品| 国产精品国产高清国产av| 能在线免费观看的黄片| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 99riav亚洲国产免费| 色在线成人网| 免费观看精品视频网站| 欧美在线一区亚洲| 此物有八面人人有两片| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 18禁在线播放成人免费| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 老司机午夜福利在线观看视频| 少妇的逼好多水| 99久久九九国产精品国产免费| 午夜爱爱视频在线播放| 色综合亚洲欧美另类图片| 久久久久免费精品人妻一区二区| 亚洲av免费高清在线观看| 国产一区二区在线观看日韩| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 毛片一级片免费看久久久久 | 成年人黄色毛片网站| 一级a爱片免费观看的视频| 可以在线观看毛片的网站| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 欧美日本亚洲视频在线播放| 国产色婷婷99| 丝袜美腿在线中文| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 十八禁国产超污无遮挡网站| 一夜夜www| 欧美一区二区精品小视频在线| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 欧美一区二区亚洲| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 日本在线视频免费播放| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 12—13女人毛片做爰片一| 亚洲第一电影网av| 一个人免费在线观看电影| 欧美一区二区精品小视频在线| 黄色丝袜av网址大全| 一个人免费在线观看电影| 欧美一区二区精品小视频在线| 精品久久久久久久久久久久久| 国产伦人伦偷精品视频| 12—13女人毛片做爰片一| 黄色丝袜av网址大全| 校园人妻丝袜中文字幕| 成人毛片a级毛片在线播放| 老司机午夜福利在线观看视频| 亚洲综合色惰| 日日夜夜操网爽| 亚洲自拍偷在线| 日韩欧美精品免费久久| 老熟妇仑乱视频hdxx| 亚洲成a人片在线一区二区| 在线观看一区二区三区| 国产精品一区二区免费欧美| 亚洲国产欧美人成| 成人国产综合亚洲| 亚洲欧美日韩高清专用| av在线观看视频网站免费| 午夜福利成人在线免费观看| 国产91精品成人一区二区三区| 国产av麻豆久久久久久久| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| av福利片在线观看|