miR-214-3p通過(guò)靶向調(diào)節(jié)p53增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力

周大新，謝方利，劉海科，丁 鵬，毛作周，孫 凱，俞 磊，姚衛(wèi)洲，姜連春，李祥兵，劉 聰，吳麗穎

胃癌是國(guó)內(nèi)發(fā)病率排名第二的惡性腫瘤，也是最常見的癌癥相關(guān)死亡原因之一。早期診斷和及時(shí)手術(shù)切除為早期胃癌患者帶來(lái)了良好的生存質(zhì)量和較長(zhǎng)的生存期。然而晚期胃癌，因其常經(jīng)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及腹膜擴(kuò)散而復(fù)發(fā)，預(yù)后很差;對(duì)于晚期胃癌患者，采用以手術(shù)治療為主，聯(lián)合圍手術(shù)期化療、放療、生物靶向治療等手段的綜合治療，從而延長(zhǎng)患者生存期，改善其生存質(zhì)量，但治療效果仍不理想。

目前，微小RNA(micro RNA,miRNA)在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用正在受到廣泛關(guān)注，眾多國(guó)內(nèi)外文章報(bào)道m(xù)iRNA表達(dá)的改變與人類腫瘤的進(jìn)展和不良預(yù)后高度相關(guān)。同樣，胃癌中miRNA的異常表達(dá)也會(huì)對(duì)疾病的進(jìn)程產(chǎn)生促進(jìn)或者抑制作用。對(duì)于致癌的miRNA，用miRNA抑制劑可以有效地抑制miRNA在體內(nèi)的功能；而對(duì)于腫瘤抑制性miRNA，用miRNA模擬物可起到抗腫瘤作用。因此，某些miRNA可以作為癌癥診斷和治療的靶標(biāo)。該研究觀察了miR-214-3p在胃癌組織中的表達(dá)情況以及對(duì)胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響，并深入探索了其發(fā)生作用的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

SYBR Green熒光定量PCR反應(yīng)試劑盒購(gòu)自北京TransGen生物公司。miRNA模擬物及抑制物由上海吉瑪制藥公司設(shè)計(jì)合成；p53過(guò)表達(dá)質(zhì)粒由上海吉瑪制藥公司構(gòu)建；實(shí)驗(yàn)所用引物及內(nèi)參均由上海生工公司設(shè)計(jì)合成。Lipofect 3000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自于美國(guó)Invirogen公司；Transwell小室及Matrigel 基質(zhì)膠購(gòu)自于美國(guó)Corning公司。螢光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega生物公司。

1.2 臨床組織標(biāo)本

收集淮北市人民醫(yī)院2018年12月—2020年7月經(jīng)手術(shù)治療切除的41對(duì)胃癌和對(duì)應(yīng)的癌旁正常新鮮組織樣本，所有病例均是本院病理確診胃癌的病例，年齡47～71(60.26±9.71)歲，術(shù)前未經(jīng)過(guò)任何放化療治療，樣本取材后置于-80 ℃冰箱中保存所有病例均是本院病理確診胃癌的病例。本研究取得了本院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.3 細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)所使用的胃癌細(xì)胞系MGC-803購(gòu)自美國(guó)ATCC公司，細(xì)胞培養(yǎng)方式依照該公司說(shuō)明書中所述。本實(shí)驗(yàn)將MGC-803細(xì)胞分為NC組(轉(zhuǎn)染mimic NC)、miR-214-3p上調(diào)組(轉(zhuǎn)染miR-214-3p mimic)、miR-214-3p下調(diào)組(轉(zhuǎn)染miR-214-3p ASO，反義寡核苷酸(Antisense oligonucleotides, ASO)，PsiCHECK2 vector+mimic NC組、PsiCHECK2-p53 3′UTR+mimic NC組，PsiCHECK2 vector+miR-214-3p mimic組，PsiCHECK2-p53 3′UTR+miR-214-3p mimic組。miRNA轉(zhuǎn)染的操作按照說(shuō)明書進(jìn)行,，提前1 d將細(xì)胞種于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到50%左右時(shí)，使用Lipofect 3000試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染，36～48 h后進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

1.4 細(xì)胞遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)

NC組、miR-214-3p下調(diào)組細(xì)胞轉(zhuǎn)染36 h后，進(jìn)行細(xì)胞換液，用無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)24 h；細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)，取細(xì)胞1×10個(gè)用300 μl無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋后種于小室，并在小室下方的24孔板內(nèi)加入800 μl有血清培養(yǎng)基，置于細(xì)胞箱培養(yǎng)；細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)，提前制作基質(zhì)膠60 μl并平鋪于小室底部，后續(xù)方法與前述細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)相同；待細(xì)胞遷移侵襲至小室外面，取出小室，PBS溶液清洗后，用乙醇進(jìn)行細(xì)胞固定，結(jié)晶紫溶液染色，再次用PBS溶液清洗，用棉簽擦去小室內(nèi)面細(xì)胞，最后置于倒置相差顯微鏡上，并進(jìn)行拍照計(jì)數(shù)。

1.5 miRNA靶基因預(yù)測(cè)

使用開放數(shù)據(jù)平臺(tái)ENCORI(http://starbase.sysu.edu.cn)和TargetScan(http://www.targetscan.org)預(yù)測(cè)miR-214-3p的下游靶基因。

1.6 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞種在24孔板中，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，分別將miR-214-3p mimic或mimic NC，Psicheck2-p53 3′UTR質(zhì)粒或Psicheck2-Vector對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)各組細(xì)胞，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。轉(zhuǎn)染48 h后，使用螢光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)試劑盒用熒光素讀取板進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)

將抽提的NC組、miR-214-3p上調(diào)組、miR-214-3p下調(diào)組總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA模板，加入特異性引物，使用SYBR Green熒光定量PCR反應(yīng)試劑盒進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)，反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 miR-214-3p在胃癌組織中的表達(dá)

通過(guò)qPCR檢測(cè)miR-214-3p在41對(duì)胃癌組織及其對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織中的表達(dá)水平。結(jié)果表明，癌旁正常組織miR-214-3p表達(dá)量為(6.834±3.212)，miR-214-3p在胃癌組織中的表達(dá)量為(22.107±7.215)；與癌旁正常組織相比，胃癌組織中miR-214-3p的表達(dá)上調(diào)(

P

<0.01，

t

=12.383，圖1)。

圖1 miR-214-3p在癌旁正常組織和胃癌組織中的表達(dá)情況 與癌旁正常組織比較：**P<0.01

2.2 miR-214-3p表達(dá)與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系

將胃癌miR-214-3p表達(dá)量的平均值設(shè)為標(biāo)準(zhǔn)，大于平均值為高表達(dá)，小于等于平均值為低表達(dá)。通過(guò)分析miR-214-3p表達(dá)與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系顯示：miR-214-3p表達(dá)水平與胃癌患者的淋巴轉(zhuǎn)移具有顯著的正相關(guān)性(

P

<0.05)，而與其他特征性病理學(xué)參數(shù)包括病人患者的年齡、性別、分化程度、TNM分期、腫瘤大小均無(wú)顯著相關(guān)性(表1)。

表1 miR-214-3p表達(dá)與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.3 miR-214-3p可調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力

為了研究miR-214-3p對(duì)胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響，將miR-214-3p抑制劑miR-214-3p ASO和mimic NC分別轉(zhuǎn)染到MGC-803胃癌細(xì)胞系中。轉(zhuǎn)染36 h后，進(jìn)行細(xì)胞遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，與NC組相比，miR-214-3p下調(diào)組細(xì)胞遷移和侵襲能力明顯降低(

P

<0.05，圖2)。

2.4 miR-214-3p在胃癌細(xì)胞中靶向調(diào)節(jié)p53的表達(dá)

使用開放數(shù)據(jù)平臺(tái)ENCORI和TargetScan預(yù)測(cè)miR-214-3p的靶基因，并發(fā)現(xiàn)了p53 mRNA的3′UTR與miR-214-3p匹配的潛在結(jié)合位點(diǎn)(圖3)。通過(guò)熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)，與PsiCHECK2 vector+miR-214-3p mimic組和PsiCHECK2-p53 3′UTR+mimic NC組相比，在胃癌細(xì)胞MGC-803中同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-214-3p模擬物miR-214-3p mimic和p53 mRNA 3′UTR的Psicheck2質(zhì)粒的PsiCHECK2-p53 3′UTR+miR-214-3p mimic組，熒光素酶活性受到抑制(

P

<0.05，圖4)。同時(shí)，qPCR結(jié)果顯示，與NC組相比：轉(zhuǎn)染miR-214-3p mimic的上調(diào)組細(xì)胞，p53 mRNA的表達(dá)水平降低；而轉(zhuǎn)染了miR-214-3p ASO的下調(diào)組細(xì)胞，p53 mRNA的表達(dá)水平升高(

P

<0.05，圖5)。

3 討論

在人類大多數(shù)癌癥中均已報(bào)道異常的miRNA表達(dá)，而miRNA的異常表達(dá)通常與人類癌癥的惡性進(jìn)展和不良預(yù)后具有高度相關(guān)性。眾多研究證明miRNA可促進(jìn)或抑制不同的細(xì)胞過(guò)程，例如細(xì)胞凋亡、分化、發(fā)育、遷移和侵襲。

在本研究首先收集經(jīng)手術(shù)治療切除的41對(duì)胃癌及其對(duì)應(yīng)的癌旁新鮮組織樣本，通過(guò)qPCR檢測(cè)其中miR-214-3p的表達(dá)，結(jié)果顯示miR-214-3p在胃癌組織中的表達(dá)水平高于癌旁組織。Yang et al發(fā)現(xiàn)miR-214-3p在胃癌組織中上調(diào)，且miR-214-3p的上調(diào)與胃癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。Xin et al的研究結(jié)果也顯示，miR-214-3p可能通過(guò)下調(diào)PTEN來(lái)促進(jìn)胃癌細(xì)胞的腹膜轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致胃癌的惡性進(jìn)展。與之前的文獻(xiàn)結(jié)果一致，miR-214-3p已被證明在多種類型的癌癥的發(fā)生中起促進(jìn)作用。

圖2 miR-214-3p調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞遷移和侵襲能力 ×200 與NC組比較：*P<0.05

圖3 miR-214-3p與p53 mRNA的3′UTR匹配結(jié)合位點(diǎn)

圖4 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè) 胃癌細(xì)胞MGC-803中miR-214-3p對(duì)p53 mRNA 3′UTR的作用

圖5 qPCR檢測(cè)胃癌細(xì)胞MGC-803中轉(zhuǎn)染 miR-214-3p mimic或miR-214-3p ASO后 p53 mRNA的表達(dá)水平

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)在胃癌細(xì)胞MGC-803轉(zhuǎn)染miR-214-3p ASO，并進(jìn)行細(xì)胞遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示抑制miR-214-3p的表達(dá)可以降低胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。這與Orso et al在乳腺癌中報(bào)道的相同，miR-214-3p上調(diào)導(dǎo)致乳腺癌和黑色素瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的增強(qiáng)，從而最終促進(jìn)癌癥的發(fā)展。但在不同的癌癥中，miR-214-3p對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用可能是不同的。有文獻(xiàn)顯示miR-214-3p也可以起到抑癌的作用，Sun et al通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明miR-214-3p可通過(guò)靶向BCL-9L來(lái)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，轉(zhuǎn)移和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

本研究預(yù)測(cè)到p53 mRNA的3′UTR中存在一個(gè)保守的miR-214-3p結(jié)合位點(diǎn)。此外，熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)測(cè)定的結(jié)果表明，當(dāng)用PsiCHECK2-p53 3′UTR轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)，miR-214-3p mimic的過(guò)表達(dá)降低了熒光素酶的活性，而用PsiCHECK2-Vector轉(zhuǎn)染時(shí)則沒有降低熒光素酶的活性，該結(jié)果說(shuō)明p53是miR-214-3p的直接靶標(biāo)。與該研究結(jié)果一致，Wang et al在骨髓瘤腫乳腺癌中發(fā)現(xiàn)p53是miR-214-3p的靶基因。p53作為一種著名的抑癌基因，在幾乎所有人類惡性腫瘤中產(chǎn)生突變或沉默，這成為腫瘤發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵因素。p53主要通過(guò)控制細(xì)胞周期、凋亡和DNA修復(fù)在維持基因組完整性方面的重要作用而聞名。最近，Kong et al報(bào)道lncRNA ZFPM2-AS1可以通過(guò)穩(wěn)定巨噬細(xì)胞遷移抑制因子來(lái)減弱p53途徑并促進(jìn)胃癌發(fā)生。因此，為了研究胃癌細(xì)胞中miR-214-3p對(duì)p53的調(diào)控作用，本研究在胃癌細(xì)胞MGC-803中轉(zhuǎn)染miR-214-3p mimic和miR-214-3p ASO，通過(guò)qPCR結(jié)果分析顯示，過(guò)表達(dá)miR-214-3p可使p53 mRNA的表達(dá)水平降低，抑制miR-214-3p的表達(dá)可使p53 mRNA的表達(dá)水平增高。以上結(jié)果表明miR-214-3p的上調(diào)可以通過(guò)抑制p53的表達(dá)，從而增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的遷移與侵襲能力。

綜上所述，本研究表明miR-214-3p在胃癌中的表達(dá)上調(diào)，提示miR-214-3p可以作為臨床胃癌的一個(gè)輔助診斷標(biāo)志物。miR-214-3p ASO可以抑制胃癌細(xì)胞的遷移與侵襲，因此，基于miR-214-3p的抑制劑可以被用作胃癌的潛在治療藥物。miR-214-3p靶向調(diào)控抑癌基因p53的表達(dá)，從而增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的遷移與侵襲能力，進(jìn)一步揭示了胃癌中miR-214-3p發(fā)揮促癌作用的機(jī)制。因此，這項(xiàng)研究為胃癌細(xì)胞的發(fā)病機(jī)制提供了新穎的見解，并提示miR-214-3p可作為胃癌治療的潛在治療靶標(biāo)。